李笑溪 韓亞寧 黃 康 任 真 王立平* 朱英杰*

1(中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳 518055)

2(中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

1 引 言

小鼠是實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最廣泛的動(dòng)物，其易于繁殖和飼養(yǎng)，具有與人類同源的解剖結(jié)構(gòu)、胚胎發(fā)育過程和代謝途徑，其大部分腦結(jié)構(gòu)、功能性分區(qū)均與人類相對(duì)應(yīng)，可以用于各類生理、病理和涉及共同功能的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)[1-3]。99% 的人類編碼基因都可以在小鼠基因組中找到對(duì)應(yīng)的同源基因，可以仿照人類的致病突變/基因多態(tài)性對(duì)小鼠基因組進(jìn)行直接的編輯、敲除，以構(gòu)建各類研究模型[4-6]。利用這些模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，有助于揭示人類精神疾病的生理及病理機(jī)制，研發(fā)可能的診斷、治療工具。目前，小鼠模型已經(jīng)越來越多地應(yīng)用于神經(jīng)科學(xué)，尤其是神經(jīng)精神類疾病的研究中，因此，對(duì)其行為的客觀解讀尤為重要。傳統(tǒng)的行為學(xué)分析方法由于技術(shù)原因，比較簡單化，且參數(shù)單一，可能會(huì)造成對(duì)小鼠行為生物學(xué)意義片面甚至錯(cuò)誤的解讀[7-9]。目前，研究中應(yīng)用的小鼠模型基因背景復(fù)雜多樣，而不同基因背景的動(dòng)物，其自發(fā)行為表現(xiàn)的差異性，都很難用原有的動(dòng)物行為學(xué)分析方法進(jìn)行有效的研究和量化分析，這有可能會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

近年來，隨著數(shù)學(xué)、工程學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)與動(dòng)物行為學(xué)的深度交叉融合，計(jì)算行為學(xué)(Computational Ethology)作為一門利用人工智能方法對(duì)各種條件下的動(dòng)物行為進(jìn)行測量、描述和分析的學(xué)科得以快速發(fā)展和完善，并逐漸得到學(xué)界的重視。計(jì)算行為學(xué)主要基于能夠模仿人類認(rèn)知功能的軟硬件綜合體[10]，對(duì)動(dòng)物行為進(jìn)行自動(dòng)化的定量分析，并挖掘研究對(duì)象未知的行為特征[11-13]。Huang 等[14-15]提出了一個(gè)層次化三維運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)框架(Behavior Atlas，BeA)來對(duì)小鼠的行為進(jìn)行精細(xì)的量化分析——利用高效的多視角三維動(dòng)物運(yùn)動(dòng)捕獲系統(tǒng)采集小鼠的行為視頻，并設(shè)計(jì)了一個(gè)并行、多階段運(yùn)動(dòng)分解策略對(duì)層次結(jié)構(gòu)行為動(dòng)力學(xué)進(jìn)行分析；然后應(yīng)用動(dòng)態(tài)時(shí)間對(duì)齊核方法對(duì)小鼠行為運(yùn)動(dòng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行精細(xì)化的分析，形成一套度量運(yùn)動(dòng)序列之間相似性的客觀參數(shù)，建立了一個(gè)低維的行為表型。結(jié)果表明，該框架能僅通過分析評(píng)估轉(zhuǎn)基因小鼠的自發(fā)行為，自動(dòng)預(yù)測其疾病模型的特征。

C57BL/6J、C57BL/6N、BALB/c(簡稱6J、6N、BC)為 3 種被廣泛使用的近交系小鼠品系[1-2,6]。本研究利用本課題組建立的 BeA 法對(duì)3 種近交系小鼠的自發(fā)行為進(jìn)行了精細(xì)的量化評(píng)估，構(gòu)建和比較了 3 種近交系小鼠的行為譜。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，自發(fā)行為影響因素的差異程度為：遠(yuǎn)基因型(6J/BC、6N/BC)＞近基因型(6J/6N)＞雌雄差異(6JM/6JF、6NM/6NF、BCM/BCF)。

2 材料和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用小鼠為 6J、6N 和 BC 3 種近交系小鼠，雌雄各 10 只，年齡為 5～6 周的青年成鼠。小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，每個(gè)籠子 4～6 只，讓小鼠在無特定病原體實(shí)驗(yàn)室內(nèi)適應(yīng)環(huán)境 1 周左右，期間給予小鼠充足的飼料和飲水，照明周期為 12 h 光照/12 h 黑暗。

2.2 曠場試驗(yàn)

將小鼠放置于一個(gè)自制的曠場試驗(yàn)裝置中，用視頻記錄其自發(fā)行為[14]。小鼠在直徑為 50 cm、高為 50 cm 的圓柱形空間內(nèi)自由活動(dòng)，該圓柱是由圓形透明亞克力壁和磨砂材質(zhì)的白色亞克力底面組成，為了避免光反射，在其塑料底下面放置一層黑色暗質(zhì)拋光橡膠墊。4 個(gè)數(shù)碼相機(jī)(Intel RealSense Camera D435)用支架正交放置，一臺(tái)56 英寸的電視機(jī)面朝下水平放置，為實(shí)驗(yàn)裝置提供均勻穩(wěn)定的白色背景光，圖像采集平臺(tái)的其他硬件包括：PCI-E 多路 USB 擴(kuò)展卡(可同時(shí)通過USB-3.0 采集 4 個(gè)攝像機(jī)的視頻)，高性能計(jì)算機(jī)(Intel 酷睿 i7-9700K、16 G RAM 配備 1 T SSD和 12 T 硬盤)。

小鼠的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)均在獨(dú)立安靜的行為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)開始前，先將小鼠放入實(shí)驗(yàn)環(huán)境適應(yīng) 30 min。每個(gè)小鼠測試完成后，取走小鼠，并清理儀器裝置中小鼠留下的尿液和糞便，用 75% 乙醇溶液擦拭，并用吸水紙擦去殘余乙醇，待揮發(fā)完全后再放入另一只小鼠進(jìn)行測試，確保小鼠之間不會(huì)因氣味相互影響。根據(jù)小鼠生物節(jié)律，曠場試驗(yàn)均在上午 8 時(shí)到 12 時(shí)之間進(jìn)行，允許小鼠先在裝置中自由活動(dòng) 10 min，然后再對(duì)小鼠的自發(fā)行為記錄 15 min，并對(duì)其自發(fā)行為數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2.3 行為學(xué)分析

基于 DeepLabCut 動(dòng)物姿態(tài)估計(jì)工具包[16]，采用 K-Means 算法從視頻中抽取約 2 000 張圖，其中，6J 和 6N 各占 1/4，BC 占 1/2。人工標(biāo)記圖中小鼠的 16 個(gè)部位：鼻尖、左耳、右耳、脖子、左前肢、右前肢、左后肢、右后肢、左前爪、右前爪、左后爪、右后爪、背部、尾根、尾中部、尾尖，作為整體或分別訓(xùn)練集。對(duì)模型訓(xùn)練后識(shí)別每幀視頻中上述 16 個(gè)部位的坐標(biāo)，建立 2D 骨架數(shù)據(jù)，融合多視角的 2D 骨架姿態(tài)重構(gòu)，得到 3D 骨架數(shù)據(jù)，然后分解、聚類得到每個(gè)樣本 40 種運(yùn)動(dòng)模式的層次化結(jié)構(gòu)行為數(shù)據(jù)，稱為行為譜[14]。

用 3D 骨架數(shù)據(jù)計(jì)算小鼠體態(tài)參數(shù)和經(jīng)典行為學(xué)參數(shù)。體態(tài)參數(shù)：用從鼻尖、脖子、背部到尾根的連線長度作為體長消除個(gè)體間差異，計(jì)算小鼠軀干、頭部、四爪和兩耳相關(guān)的體態(tài)參數(shù)表征其伸展程度；平均速度：以小鼠背部(x,y)坐標(biāo)軌跡計(jì)算小鼠曠場試驗(yàn)期間的速度平均值；位移速度：位移速度高于 3 倍平均速度運(yùn)動(dòng)的平均值；平均焦慮指數(shù)：小鼠背部位于 1/2 曠場半徑中心區(qū)域的權(quán)重。

3 結(jié) 果

3.1 小鼠體態(tài)與訓(xùn)練集

小鼠 BeA 多視角圖像采集和數(shù)據(jù)處理流程如圖 1 所示。

圖1 BeA 多視角圖像采集和數(shù)據(jù)處理流程Fig. 1 Multi-perspective image acquisition and data processing in BeA

將曠場試驗(yàn)中用多視角攝像機(jī)拍攝的所有小鼠的自發(fā)行為數(shù)據(jù)進(jìn)行自動(dòng)識(shí)別，根據(jù)動(dòng)作變化和銜接關(guān)系進(jìn)行分解、聚類[14]后共得到 40 種運(yùn)動(dòng)模式。因此，每個(gè)樣本的行為記錄可以轉(zhuǎn)換成離散的 40 種運(yùn)動(dòng)模式序列編號(hào)(簡稱行為譜)。3 種小鼠標(biāo)記圖整體作為訓(xùn)練集的處理結(jié)果如圖 2(a)所示，在 40 種運(yùn)動(dòng)模式中，BC 只表現(xiàn)出其中 5 種，而 6J 和 6N 表現(xiàn)出另外 19 種行為，只有一個(gè)小概率運(yùn)動(dòng)模式(編號(hào) 22)重疊，即 6J/6N 與 BC 幾乎不存在被識(shí)別為同類別的行為。

將視頻慢放后反復(fù)觀察，發(fā)現(xiàn) 6J/6N 和 BC兩類小鼠體態(tài)有很大差異——BC 較為伸展。為驗(yàn)證這一差異，將 6J/6N 與 BC 分別作為訓(xùn)練集，識(shí)別處理得到 3D 骨架數(shù)據(jù)，計(jì)算出小鼠脖子、背部、雙耳和四爪相關(guān)的 5 種體態(tài)參數(shù)，表征小鼠軀干、頭部、四爪和兩耳相關(guān)的體態(tài)伸展程度。其中，A/L體現(xiàn)軀干(背部)伸展程度，B/L體現(xiàn)整個(gè)身體(脖子和背部)伸展程度，C/L體現(xiàn)四爪伸展程度，D/L和E/L體現(xiàn)鼻尖、兩耳間的特征。結(jié)果如圖 2(b)～(f)所示，6J/6N 與 BC 之間的 5 種體態(tài)參數(shù)都表現(xiàn)出顯著性差異，BC 明顯較為伸展。這種體態(tài)差異很可能是導(dǎo)致 6J/6N與 BC 組內(nèi)差距的區(qū)分度較差、行為譜結(jié)果異常的主要原因。因此，本實(shí)驗(yàn)采用 6J/6N 和 BC 組分別作為訓(xùn)練集進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

圖2 6J/6N 與 BC小鼠行為譜與體態(tài)參數(shù)差異Fig. 2 Differences in both behavior atlas and body state parameters of 6J/6N and BC

3.2 基因型與雌雄差異

BC 與 6J/6N 基因型的小鼠自發(fā)行為譜是通過無監(jiān)督聚類獨(dú)立構(gòu)建的，從而導(dǎo)致其運(yùn)動(dòng)模式編號(hào)無法與小鼠自發(fā)行為直接匹配，一些行為標(biāo)簽的具體特征也無法直接對(duì)應(yīng)，故 6J/6N 與 BC組之間只能根據(jù)經(jīng)典行為標(biāo)簽進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，而對(duì)同一訓(xùn)練集處理的 6N 和 6J 的行為差異分析可以更深入。首先，對(duì) 6J 和 6N 的行為譜進(jìn)行頻率統(tǒng)計(jì)(如圖 3(a))和雙因素方差分析。由分析結(jié)果可知，6J 和 6N 自發(fā)行為的 40 種運(yùn)動(dòng)模式均無顯著性差異。進(jìn)一步對(duì)同一種基因型的小鼠研究雌雄因素對(duì)自發(fā)行為的影響。分別比較 6J、6N和 BC 中雌雄小鼠的自發(fā)行為譜差異，對(duì)比結(jié)果如圖 3(b)～(d)所示。由圖可知，在 6J 和 BC 基因型小鼠中，雌雄對(duì)照組也無顯著性差異，而在6N 中，40 號(hào)行為模式表現(xiàn)出顯著的性別差異，雌性小鼠表現(xiàn)出更多的 40 號(hào)行為模式?？傮w來看，6J 和 6N 小鼠的自發(fā)行為譜較為相似(見圖 2(a))，對(duì)比圖 2(a)和圖 2(d)可知，BC 與6J 和 6N 在 28～38 號(hào)運(yùn)動(dòng)模式區(qū)域差異明顯，3 種基因型小鼠的自發(fā)行為均表現(xiàn)出一定程度的個(gè)體差異。

圖3 近交系小鼠品系和雌雄對(duì)照組自發(fā)行為譜對(duì)比Fig. 3 Spontaneous behavior atlas were compared between inbred mice lines and female/male groups

通過視頻慢放，參照文獻(xiàn)定義的行為標(biāo)簽[14,17]，標(biāo)識(shí)自動(dòng)識(shí)別的行為模式[18]，將 6 類主要行為的運(yùn)動(dòng)模式匯總于表 1。6J/6N 組的 40 種行為模式中，有“嗅探”類 9 種、“梳理”類 5 種、“跑”類 5 種、“隆起”類 3 種、“行走”類 4種，同一大類行為中的不同子類行為模式在節(jié)奏、持續(xù)時(shí)間、方向變化、銜接過渡動(dòng)作等方面有所區(qū)別，說明機(jī)器自動(dòng)識(shí)別劃分的行為模式是客觀、合理的。BC 組有“嗅探”類 11 種、“跑”類 5 種、“隆起”類 3 種、“行走”類 6種，沒有明顯的“梳理”類行為，“梳理”作為鼠類的標(biāo)志性動(dòng)作，BC 只是在 17 號(hào)行為模式中伴隨有少量的梳理動(dòng)作。

表1 6J/6N 和 BC 組 6 類主要行為標(biāo)簽匯總Table 1 Summary of 6 major behavioral labels in the 6J/6N and BC groups

將以上 6 類行為按基因型(如圖 4)和雌雄對(duì)照組合并統(tǒng)計(jì)分析。由圖 4 可知，6 類行為的總分?jǐn)?shù)均超過 0.6，基因型相近的對(duì)照組為 6J/6N，該對(duì)照組有“抬頭”“嗅探”“梳理”和“隆起”4 類行為表現(xiàn)出顯著性差異；基因型差異較大的對(duì)照組為 6J 和 BC、6N 和 BC，該對(duì)照組有“抬頭”“梳理”“跑”“隆起”和“行走”5類行為表現(xiàn)出顯著性差異。6N 的“嗅探”行為顯著多于 6J，且數(shù)量分?jǐn)?shù)高于 0.25，相對(duì)差異為19.0%。綜合行為譜分析表明，基因型差異對(duì)小鼠行為的影響大于雌雄因素，基因型差異程度也很明顯。通過 BeA 法得到的行為分類，能在更多維度上評(píng)估基因型和雌雄對(duì)照組之間的行為差異，進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析不同行為標(biāo)簽的類行為模式數(shù)據(jù)，可在更宏觀的層面評(píng)估對(duì)照組的行為。

圖4 基因型對(duì)照組主要行為標(biāo)簽數(shù)量分?jǐn)?shù)對(duì)比Fig. 4 Comparison of fractions of the 6 major movement modules

3.3 經(jīng)典行為學(xué)參數(shù)

根據(jù)樣本 3D 骨架數(shù)據(jù)計(jì)算經(jīng)典行為參數(shù)——平均焦慮指數(shù)、平均速度和位移速度，計(jì)算結(jié)果如圖 5 所示。由圖 5 可知，在 3 個(gè)基因型對(duì)照組中，6N 的平均焦慮指數(shù)顯著低于 6J 和BC(焦慮指數(shù)高者焦慮程度低[19])，BC 的平均速度和位移速度顯著小于 6J 和 6N，而 6J 的平均速度和位移速度小幅低于 6N，也表現(xiàn)為顯著性差異。在兩個(gè)雌雄對(duì)照組中，平均焦慮指數(shù)，以及 6JM 和 6JF 的位移速度表現(xiàn)出顯著性差異。這些宏觀行為參數(shù)總體表現(xiàn)出基因型差異大于雌雄差異，與第 3.2 節(jié)中行為譜的結(jié)論一致。BeA 法可以同時(shí)得到精細(xì)的行為譜和宏觀的經(jīng)典行為參數(shù)，對(duì)小鼠行為的評(píng)估更為全面和客觀[20]。

圖5 基因型和雌雄對(duì)照組典型行為參數(shù)對(duì)比Fig. 5 Comparsing between genotype and female/male groups

4 討論與分析

關(guān)于小鼠行為分析方法，由于哺乳動(dòng)物的行為具有復(fù)雜性、高維性、時(shí)間動(dòng)態(tài)和層次性[21]，除位移運(yùn)動(dòng)外，非位移運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)為動(dòng)物肢體和器官具有高維(如梳理、轉(zhuǎn)彎)和較大的空間變化。BeA 法利用多視角三維動(dòng)物運(yùn)動(dòng)捕捉系統(tǒng)收集行為視頻，避免了單一攝像機(jī)俯視角記錄導(dǎo)致的動(dòng)物身體部位遮擋和視角偏差；在機(jī)器學(xué)習(xí)中，本實(shí)驗(yàn)采用了一種并行的、多階段的運(yùn)動(dòng)分解策略來進(jìn)行層次行為動(dòng)力學(xué)學(xué)習(xí)，改進(jìn)了姿態(tài)估計(jì)效果；運(yùn)動(dòng)分解和降維處理應(yīng)用動(dòng)態(tài)時(shí)間對(duì)齊核方法來描述運(yùn)動(dòng)動(dòng)力學(xué)，能夠客觀地度量運(yùn)動(dòng)序列之間的相似性，并建立一個(gè)行為的低維表示，以便進(jìn)行動(dòng)物行為的參數(shù)化描述。BeA 法能同時(shí)客觀地得到經(jīng)典行為學(xué)參數(shù)和行為譜，進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析不同行為標(biāo)簽數(shù)據(jù)，對(duì)小鼠行為的評(píng)估更為全面[20]。

本研究表明，BeA 法作為一種客觀、精細(xì)化的行為學(xué)分析方法，對(duì)組內(nèi)差異較大的樣本無法兼容，因此，要注意訓(xùn)練集的確定和選擇，或采用部分基因型的集合訓(xùn)練集。此外，BeA 法巨量又準(zhǔn)確的 3D 骨架數(shù)據(jù)可能具有潛在價(jià)值，本文雖然未將 BC 小鼠與 6J/6N 組行為譜進(jìn)行對(duì)比，但通過計(jì)算小鼠的 5 種體態(tài)參數(shù)，量化分析了整體訓(xùn)練集不能識(shí)別處理數(shù)據(jù)的原因：小鼠兩耳距離、鼻尖-脖子-尾根連線長度、鼻尖到尾根距離和四爪連線長度與體長(鼻尖-脖子-背-尾根連線長度)的比值，BC 組均顯著大于 6J/6N 組(所有小鼠年齡均控制在 5～6 周)，說明 BC 小鼠的軀干和四肢呈更為伸展的體態(tài)，且 BC 的運(yùn)動(dòng)速度顯著小于 6N 和 6J。同一行為標(biāo)簽的差異，在以往文獻(xiàn)中有被描述過[22]，但過去的分析方法很難對(duì)這些細(xì)微的差異進(jìn)行定量評(píng)估，故其具體含義尚未被明確定義。使用 BeA 法標(biāo)簽對(duì)公認(rèn)有代表性的疾病模型行為學(xué)分析進(jìn)行后續(xù)研究，將使這些數(shù)據(jù)發(fā)揮出新的價(jià)值。

與 6J 小鼠相比，6N 小鼠的嗅探行為更多，更具謹(jǐn)慎探索特征，傳統(tǒng)行為學(xué)分析認(rèn)為，這可能是更焦慮的一種表現(xiàn)[23]，該行為與焦慮指數(shù)提示的差異相同，故本研究認(rèn)為 6N 小鼠焦慮程度確實(shí)更高。6N 品系被公認(rèn)為比 6J 好斗，鑒于6J 和 6N 兩個(gè)品系顯著的基因型差異[24]，這種攻擊性差異可能是原發(fā)性的，但本研究結(jié)果提示了另外一種可能性，即 6N 較高的攻擊性可能是由于其過于膽小、焦慮程度更高而做出的代償性行為。早年，神經(jīng)科學(xué)、精神疾病研究水平不足時(shí)，臨床上曾經(jīng)使用“對(duì)癥”的治療方法對(duì)多動(dòng)癥等疾病進(jìn)行干預(yù)[25]，但若異常行為的病因?yàn)榇鷥斝缘?，“?duì)癥”治療反而會(huì)加重病情。以 6N為模型對(duì)這一問題進(jìn)行深入研究，或許可以為人類暴力行為的干預(yù)提供新的思路。

目前，由于雌鼠具有生理周期，大多數(shù)神經(jīng)科學(xué)的行為學(xué)研究只使用雄鼠進(jìn)行研究，以避免過多的激素影響研究結(jié)果。本研究的結(jié)果表明，青年成鼠的自發(fā)行為在雌雄之間的差異并不是很大，雌雄差異明顯要小于品系間差異。未來的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)可以考慮既使用雄鼠也使用雌鼠，雌雄鼠的N值不一定要相同，方差大的性別可增加動(dòng)物數(shù)量，當(dāng)只使用方差大的性別且樣本過少或顯著性不足時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果更容易受偶然因素的影響。

5 結(jié) 論

本文采用基于層次化三維動(dòng)物行為特征的無監(jiān)督學(xué)習(xí)框架(BeA)，對(duì) 3 種近交品系 6J、6N 和 BC 青年成鼠的自發(fā)行為進(jìn)行評(píng)估。與已有研究方法相比，BeA 可以自動(dòng)完成數(shù)據(jù)采集、機(jī)器學(xué)習(xí)、2D 行為數(shù)據(jù)識(shí)別、多視角姿態(tài)融合重構(gòu)獲得 3D 骨架數(shù)據(jù)、行為分解、聚類降維得到運(yùn)動(dòng)模式行為譜數(shù)據(jù)等一系列環(huán)節(jié)，更具客觀性，從而避免主觀因素帶來的實(shí)驗(yàn)偏差。根據(jù)3D 骨架數(shù)據(jù)可以進(jìn)一步計(jì)算經(jīng)典行為學(xué)參數(shù)，行為譜還可以進(jìn)一步標(biāo)識(shí)、統(tǒng)計(jì)分析不同行為標(biāo)簽，總體上更為客觀、全面。對(duì)自發(fā)行為譜、行為標(biāo)簽統(tǒng)計(jì)和經(jīng)典行為參數(shù)結(jié)果進(jìn)行綜合分析可知，自發(fā)行為影響因素差異程度為遠(yuǎn)基因型(6J/BC、6N/BC)＞近基因型(6J/6N)＞雌雄差別(6JM/6JF、6NM/6NF、BCM/BCF)，野生型小鼠的自發(fā)行為表現(xiàn)出一定程度的個(gè)體差異。合并同類行為和經(jīng)典行為參數(shù)均表現(xiàn)出基因型差異大于雌雄差異，6N 的嗅探行為顯著多于 6J，BC 的體態(tài)較為伸展，運(yùn)動(dòng)速度明顯小于 6J 和 6N。BeA法能夠獲得多方面的行為學(xué)數(shù)據(jù)，需要注意訓(xùn)練集的運(yùn)用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可作為小鼠模型實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、選擇品系、樣本量確定的參考。