韓雪影,李 露

(青島科技大學(xué)a.海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院;b.化工學(xué)院,山東 青島266042)

檸檬酸又名枸櫞酸,其分子式為C6H8O7,外觀呈白色結(jié)晶性粉末、白色顆粒或者是無色半透明晶體[1],可用作防腐劑、增味劑、螯合劑、p H 調(diào)節(jié)劑、抗氧化劑和穩(wěn)定劑等[2],在食品、化工、紡織、環(huán)保、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)有著廣泛的用途[3-4]。

已經(jīng)有許多微生物被報(bào)道能夠生產(chǎn)檸檬酸,包括細(xì)菌[5-7],霉菌[8-9]和酵母[10-12]等,但工業(yè)生產(chǎn)菌主要為黑曲霉和酵母菌。目前黑曲霉是工業(yè)中最常用的檸檬酸發(fā)酵菌株,但黑曲霉生長(zhǎng)緩慢,發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng),菌體形態(tài)不易控制,發(fā)酵時(shí)需富氧通氣等本身缺陷不易改變,因此尋求其他微生物用于檸檬酸發(fā)酵,酵母菌生長(zhǎng)快速、無需富氧發(fā)酵,菌體形態(tài)不易變形,但發(fā)酵后副產(chǎn)物較多,遺傳改造困難,與黑曲霉相比檸檬酸產(chǎn)量較低。本課題利用代謝工程改造的大腸桿菌進(jìn)行發(fā)酵,大腸桿菌生長(zhǎng)快速、易于遺傳改造,無需富氧發(fā)酵,且大腸桿菌W 耐酸性較好,適合用于有機(jī)酸的生產(chǎn)。

在大腸桿菌中檸檬酸和衣康酸的代謝途徑極為相似,glt A基因和cad基因分別是檸檬酸和衣康酸生產(chǎn)的關(guān)鍵酶,glt A基因是衣康酸合成代謝途徑中的一環(huán),二者的區(qū)別在于有無cad基因的表達(dá)[13];cad基因在代謝途徑中跟檸檬酸的生產(chǎn)毫無關(guān)系,但在代謝工程改善衣康酸的生產(chǎn)過程中,glt A基因經(jīng)常被過表達(dá)以增加衣康酸的生產(chǎn)且效果明顯。如:通過自組裝技術(shù),在大腸桿菌Rosetta(DE3)中過表達(dá)了基因cad、glt A和ACN(烏頭酸酶),使衣康酸的產(chǎn)量得到了提高[14]。HARDER 等[15]以大腸桿菌MG1655 為宿主過表達(dá)了cad、glt A等基因,獲得了工程菌生產(chǎn)衣康酸的最高產(chǎn)量。但是cad基因的過表達(dá)對(duì)檸檬酸的代謝過程到底有何影響,卻很少有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究在大腸桿菌W 中單獨(dú)過表達(dá)glt A基因和共表達(dá)glt A、cad基因,篩選獲得wg和wgc工程菌,通過搖瓶發(fā)酵對(duì)比檸檬酸產(chǎn)量,探索cad基因在大腸桿菌中過表達(dá)對(duì)檸檬酸產(chǎn)量的影響,為闡明檸檬酸和衣康酸代謝途徑之間的聯(lián)系奠定基礎(chǔ)。后續(xù)通過單因素試驗(yàn)探索碳源、初始糖含量、溫度、p H、接種量和外源添加酵母膏等發(fā)酵條件對(duì)檸檬酸生產(chǎn)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 菌株、質(zhì)粒與引物

使用菌株DH5α為克隆宿主,大腸桿菌W(ATCC 9637)為表達(dá)宿主,所用質(zhì)粒為p CDFduet-1和p COLAduet-1,引物序列列于表1。cad基因序列來源于土曲霉(NCBI序列ID:BAG49047.1),由上海生工生物有限公司全基因合成并進(jìn)行密碼子優(yōu)化;glt A基因序列來源于大腸桿菌W(NCBI序列ID:945323),從本實(shí)驗(yàn)室已有菌株中擴(kuò)增獲得。啟動(dòng)子(tac和BBa_J23100)和終止子(BBa_B1001)的序列可從標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)部分注冊(cè)處(http://parts.igem.org)獲得。5＇UTR 由UTR 設(shè)計(jì)網(wǎng)站設(shè)計(jì)(http://sbi.postech.ac.kr/utr_designer)[16]。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primers sequence

1.2 重組菌株wg和wgc的構(gòu)建

使用Prime STAR(Takara)高保真酶,以帶有目的基因片段的質(zhì)粒為模板,通過PCR 擴(kuò)增目的基因片段,以原始質(zhì)粒載體為模板,通過PCR 擴(kuò)增載體片段。對(duì)回收純化后的基因片段和載體片段分別進(jìn)行雙酶切,然后在T4連接酶(Takara)的作用下連接基因片段與質(zhì)粒片段,分別構(gòu)建基因表達(dá)載體。具體如下:

1)將glt A基因片段取代p COLADuet-1 質(zhì)粒上T7啟動(dòng)子至終止子之間的片段,并使用啟動(dòng)子元件PBBa_J23100啟動(dòng)表達(dá)和終止子元件Ter BBa_B1001終止表達(dá),啟動(dòng)子和終止子通過引物設(shè)計(jì)加入到基因的兩端,構(gòu)建重組質(zhì)粒p COLA-glt A(圖1(a))。最后將構(gòu)建好的重組載體p COLA-glt A(圖1(a))通過熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌W,獲得重組菌株wg。

2)用cad基因片段取代p CDFDuet-1 質(zhì)粒上T7啟動(dòng)子至終止子之間的片段,并使用啟動(dòng)子元件tac啟動(dòng)表達(dá)和終止子元件Ter BBa_B1001 終止表達(dá),構(gòu)建重組質(zhì)粒pCDF-cad(圖1(a)),最后將構(gòu)建好的重組載體p CDF-cad(圖1(b))通過熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌wg,獲得重組菌株wgc。

圖1 重組質(zhì)粒pCOLA-gltA 和pCDF-cadFig.1 Recombinant plasmid pCOLA-glt A and p CDF-cad

1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

將陽(yáng)性重組菌株用LB培養(yǎng)基(10.0 g·L－1胰蛋白胨、5.0 g·L－1酵母提取物和5.0 g·L－1NaCl)在37 ℃和150 r·min－1條件下培養(yǎng)12 h,然后按照4%的接種量接種至M9 培養(yǎng)基(12.8 g·L－1Na2HPO4·7H2O、3 g·L－1KH2PO4、0.5 g·L－1NaCl、1.0 g·L－1NH4Cl、0.5% 葡 萄 糖、2 mmol MgSO4、0.1 mmol CaCl2)[17],在37℃和200 r·min－1下生長(zhǎng)至OD600值約為1.0 時(shí),加入0.2 mmol·L－1IPTG 誘導(dǎo)蛋白的表達(dá),最后在37 ℃,200 r·min－1條件下發(fā)酵96 h后收集發(fā)酵液。

1.4 分析方法

通過檢測(cè)發(fā)酵液在600 nm 處的光吸收來衡量菌體的生物量。利用HPLC 檢測(cè)發(fā)酵液中的檸檬酸和蔗糖[18]。色譜柱使用Aminex HPX-87 H 有機(jī)酸柱(25.0 cm,0.4 cm i.d.,Bio-Rad),流動(dòng)相為5.0 mmol·L－1H2SO4,分析條件為:RID 檢測(cè)器,流速0.4 m L·min－1,柱溫65 ℃,進(jìn)樣體積為10.0μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 基因glt A 和cad 對(duì)檸檬酸產(chǎn)量的影響

glt A(檸檬酸合酶基因)是檸檬酸合成不可或缺的基因,而cad基因的過表達(dá)從理論上來說能加速檸檬酸的消耗,使檸檬酸的含量降低,為了探索基因cad對(duì)檸檬酸產(chǎn)量的影響,將重組菌株wg、wgc于37 ℃,150 r·min－1條件下用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h,然后在4%的接種量,37 ℃,200 r·min－1條件下用M9培養(yǎng)基發(fā)酵5 d,以進(jìn)行產(chǎn)量的對(duì)比。野生菌W 在相同條件下發(fā)酵,在發(fā)酵液中檢測(cè)不到檸檬酸,因此默認(rèn)本實(shí)驗(yàn)中野生菌不產(chǎn)檸檬酸,在此條件下進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和實(shí)驗(yàn)分析,見圖2。第1 d開始wg和wgc表達(dá)菌株發(fā)酵液中檸檬酸的含量呈逐漸上升的趨勢(shì),發(fā)酵到第4 d時(shí)檸檬酸含量達(dá)到最高,wg最高產(chǎn)量為150 mg·L－1,wgc最高產(chǎn)量為245 mg·L－1。第4 d之后檸檬酸含量開始下降,可能由于發(fā)酵液中糖分的消耗使得碳源通量降低。在相同時(shí)間點(diǎn),菌株wgc檸檬酸的生產(chǎn)量全都高于wg菌株檸檬酸的產(chǎn)量,1～5 d wgc檸檬酸產(chǎn)量與wg檸檬酸產(chǎn)量的比值分別為2.5、1.9、1.8、1.6、2.1,wgc表達(dá)菌株生產(chǎn)檸檬酸的能力明顯比wg菌株更好,這表明cad基因的過表達(dá)有利于檸檬酸產(chǎn)量的提高,可能是因?yàn)閏ad基因的過表達(dá)進(jìn)一步誘發(fā)或抑制了大腸桿菌機(jī)體內(nèi)檸檬酸相關(guān)的其它代謝途徑,導(dǎo)致檸檬酸的積累。

圖2 wg和wgc發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸Fig.2 Fermentation of wg and wgc to produce citric acid

2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 不同碳源對(duì)檸檬酸產(chǎn)量的影響

為了探索不同碳源對(duì)重組菌株wgc發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的影響,將共表達(dá)cad、glt A的菌株在4%的接種量,37 ℃,200 r·min－1條件下分別置于4 g·L－1的蔗糖、葡萄糖、果糖和麥芽糖中發(fā)酵培養(yǎng)4 d,結(jié)果見圖3。以蔗糖為碳源進(jìn)行發(fā)酵所得發(fā)酵液中檸檬酸含量最高,明顯優(yōu)于其它糖類,達(dá)到0.63 g·L－1,檸檬酸產(chǎn)量提高了152%。使用果糖和麥芽糖作為碳源發(fā)酵檸檬酸含量較低,使用二糖發(fā)酵比單糖產(chǎn)量略高,因此確定二糖中的蔗糖為最適發(fā)酵碳源,并使用蔗糖進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵試驗(yàn)。

圖3 碳源對(duì)檸檬酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of carbon source on the yield of citric acid

2.2.2 蔗糖濃度

底物蔗糖濃度對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)和檸檬酸的合成有著不可忽視的影響。蔗糖濃度過高會(huì)造成滲透壓高,發(fā)酵液黏度相應(yīng)增加,從而影響傳質(zhì)速率,造成菌體生長(zhǎng)延遲期的延長(zhǎng)和比生長(zhǎng)速率的降低,影響檸檬酸的合成速度。合適的糖濃度使檸檬酸產(chǎn)量高,殘?zhí)堑?糖酸轉(zhuǎn)化率高。將重組菌株wgc在4%的接種量,37 ℃,200 r·min－1條件下分別置于2、4、6、8 g·L－1的蔗糖中搖瓶96 h,考察蔗糖濃度對(duì)檸檬酸產(chǎn)量的影響見圖4。從圖4可看出,隨著蔗糖濃度的提高,檸檬酸產(chǎn)量逐漸增加,在蔗糖濃度8和10 g·L－1時(shí)獲得檸檬酸含量分別為1.36 和1.37 g·L－1,檸檬酸產(chǎn)量提高了約117%,但蔗糖的利用率較低,分別為24.4%和13.7%,為了減少碳源浪費(fèi),降低生產(chǎn)的成本,綜合考慮檸檬酸產(chǎn)量和蔗糖的利用率之后,選用8 g·L－1的蔗糖濃度進(jìn)行發(fā)酵。

圖4 蔗糖濃度對(duì)檸檬酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of sucrose concentration on the yield of citric acid

2.2.3 發(fā)酵溫度

溫度影響著菌體的生長(zhǎng)以及機(jī)體內(nèi)各種反應(yīng)的進(jìn)行,菌體最佳生長(zhǎng)溫度和最佳發(fā)酵溫度可能有所不同,為了探索大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸適宜的發(fā)酵溫度,將重組菌株wgc置于4%接種量、8 g·L－1蔗糖、200 r·min－1和溫度分別為25、30、35、40和45℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)96 h,結(jié)果見圖5。溫度在25～35 ℃之間時(shí),發(fā)酵液中檸檬酸含量呈現(xiàn)出隨溫度的升高而逐漸上升的趨勢(shì),超過35℃后檸檬酸含量則逐漸下降,在35 ℃時(shí)檸檬酸含量最高,為1.37 g·L－1,檸檬酸產(chǎn)量提升不明顯。35℃與37℃檸檬酸產(chǎn)量差別甚微,考慮到已經(jīng)在發(fā)酵初期通過37℃發(fā)酵來提高生物量,選擇37℃作為后續(xù)工程菌生產(chǎn)檸檬酸的發(fā)酵溫度。

圖5 溫度對(duì)檸檬酸產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of temperature on the yield of citric acid

2.2.4 p H

為了探索培養(yǎng)基初始p H 值對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的影響,考察了4%接種量、8 g·L－1蔗糖、200 r·min－1、37 ℃和p H 6.0～8.0 時(shí)檸檬酸的含量,見圖6。由圖6所示,p H 在6.0～7.0的范圍內(nèi),p H的變化和檸檬酸產(chǎn)量變化呈正相關(guān),當(dāng)p H 為7.0時(shí),檸檬酸產(chǎn)量最高為1.41 g·L－1,產(chǎn)量與不控制p H 相比提升3%,p H 7.0～8.0時(shí),檸檬酸呈下降趨勢(shì),p H 為6.0 和8.0 時(shí),檸檬酸產(chǎn)量較低,可能由于在酸性和堿性環(huán)境中影響大腸桿菌細(xì)胞的生長(zhǎng),為獲得較高檸檬酸產(chǎn)量,選擇p H 7.0進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

圖6 p H 對(duì)檸檬酸產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of p H on the yield of citric acid

2.2.5 接種量

接種量是影響發(fā)酵的重要因素之一,一般來說接種量越大,起酵時(shí)間越短,降糖速率越高,也會(huì)導(dǎo)致菌體過快衰老,較低的接種量會(huì)使發(fā)酵過程緩慢,為了尋找合適的接種量,將重組菌株置于8 g·L－1蔗糖、200 r·min－1、溫度37 ℃、p H 7.0和接種量分別為2、4、6、8、10%的條件下發(fā)酵96 h,結(jié)果見圖7。如圖7所示,在接種量為2%和4%時(shí),檸檬酸產(chǎn)量較高,在接種量4%時(shí)檸檬酸產(chǎn)量達(dá)到了最高為1.42 g·L－1,隨后產(chǎn)量快速下降,可能由于菌量過多,使蔗糖消耗過快,細(xì)胞內(nèi)碳通量下降,檸檬酸產(chǎn)量隨之下降。根據(jù)以上結(jié)果,選擇4%接種量進(jìn)行檸檬酸后續(xù)的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

圖7 接種量對(duì)檸檬酸產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of inoculation amount on the yield of citric acid

2.2.6 外源添加酵母膏量

為了探究有機(jī)氮源酵母膏對(duì)發(fā)酵的影響,將重組菌株wgc置于4%接種量、8 g·L－1蔗糖、200 r·min－1、溫度37 ℃、p H 7.0和酵母膏含量分別為0、1、2、3 g·L－1的條件下發(fā)酵96 h,結(jié)果見圖8。如圖8所示,外源添加酵母膏2 g·L－1時(shí),獲得最高檸檬酸產(chǎn)量為0.26 g·L－1,但遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于不添加酵母膏時(shí)檸檬酸的產(chǎn)量,原因可能是發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸時(shí),大腸桿菌偏好吸收無機(jī)碳源,有機(jī)碳源的增加延長(zhǎng)了菌群生長(zhǎng)的時(shí)間,降低了產(chǎn)酸的效率,因此酵母膏的加入不利于檸檬酸產(chǎn)量的提高。綜上所述,單因素試驗(yàn)確定的最佳發(fā)酵條件為蔗糖8 g·L－1、接種量4%、溫度37 ℃、p H 7.0。

圖8 酵母膏添加量對(duì)檸檬酸產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of the added amount of yeast extract on the yield of citric acid

2.2.7 發(fā)酵時(shí)間

在接種量4%、蔗糖8 g·L－1、溫度37 ℃、p H 7.0的條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵5 d,結(jié)果見圖9。第4天獲得最高檸檬酸產(chǎn)量為1.44 g·L－1,與優(yōu)化前相比檸檬酸產(chǎn)量提高了6倍左右。

圖9 發(fā)酵時(shí)間對(duì)檸檬酸產(chǎn)量的影響Fig.9 Effect of time on the yield of citric acid

3 結(jié) 論

1)構(gòu)建了生產(chǎn)檸檬酸的工程菌wg和wgc,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明cad基因的過表達(dá)同樣也是增強(qiáng)工程菌檸檬酸合成的有效手段,可能是由于cad基因的過表達(dá)是加快了檸檬酸消耗,而檸檬酸作為三羧酸循環(huán)中重要的一環(huán),含量過低影響菌體正常代謝,因此cad基因的過表達(dá)可能加快了三羧酸循環(huán)速率,增加了檸檬酸的通量。

2)確定了工程菌wgc生產(chǎn)檸檬酸的發(fā)酵工藝參數(shù):將單菌落在LB培養(yǎng)基中37℃、200 r·min－1下培養(yǎng)12 h,然后以4%接種量接種至含有8 g·L－1蔗糖、p H 為7.0的M9培養(yǎng)基中18 ℃低溫誘導(dǎo)24 h,然后轉(zhuǎn)至37 ℃發(fā)酵96 h后獲得了最高檸檬酸產(chǎn)量為1.44 g·L－1。