益母縮宮顆粒對不全流產(chǎn)模型大鼠相關(guān)炎癥因子水平的影響

侯汪歡，毛惠

（1.西南醫(yī)科大學(xué),四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院產(chǎn)科,四川 瀘州 646000）

0 引言

隨著社會發(fā)展，在諸多社會因素的共同作用下，我國未婚女性數(shù)量逐年遞增，婚前性行為、婚前同居、未婚先孕等行為增加，導(dǎo)致我國女性遭受意外妊娠、人工流產(chǎn)甚至多次人工流產(chǎn)概率逐年上升。通過中國衛(wèi)生健康統(tǒng)計年鑒查閱2019年全國人工流產(chǎn)人數(shù)達到976 萬人不等[1]，且部分私人診所、違規(guī)診所接待的人工流產(chǎn)患者未被統(tǒng)計在內(nèi)。一項對全國30個省市自治區(qū)近300 家醫(yī)院近8 萬人工流產(chǎn)婦女的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，重復(fù)流產(chǎn)比例高達65.2%[2]。我國女性的健康在人流率、人流數(shù)雙高的局勢下遭受到了危害[3]。

相比手術(shù)流產(chǎn)，藥物流產(chǎn)具有經(jīng)濟實惠、安全性高、創(chuàng)傷小、療效顯著、易接受、副作用小等優(yōu)點，藥物流產(chǎn)的臨床指南表明米非司酮和米索前列醇配伍使用有效率達95%[4]。流產(chǎn)會激活局部的炎性細胞，誘導(dǎo)大量炎癥因子的合成及釋放，如NO、前列腺素等炎癥介質(zhì)以及TNF-α 和 IL-6 等促炎性細胞因子，從而導(dǎo)致機體出現(xiàn)一系列的炎癥反應(yīng)不利于流產(chǎn)后子宮復(fù)舊，導(dǎo)致陰道異常出血[5]。因此進一步探討益母縮宮顆粒能否調(diào)節(jié)相關(guān)炎癥因子的表達，減輕子宮內(nèi)膜炎癥反應(yīng)，降低藥物流產(chǎn)后感染的風(fēng)險，進一步揭示其作用機理，為臨床治療藥物流產(chǎn)后子宮異常出血提供合理、適用的手段。

1 實驗材料

1.1 實驗藥品

益母縮宮顆粒，獨立小包裝（10g/ 袋），生產(chǎn)批號：20201204，大鼠用藥劑量按照成人用藥量（30g/d）來計算。換算后益母縮宮顆粒低、中、高劑量組大鼠灌胃濃度分別對應(yīng)為：1.56g/(kg·d)、3.13g/(kg·d)、6.25g/(kg·d)。

新生化顆粒，規(guī)格9g/袋，國藥準字號：Z2016 3013，成人用量27g/d，換算后新生化顆粒灌胃濃度1.56g/(kg·d)。

米非司酮片，批號：432005041，規(guī)格25mg/片，華潤紫竹藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，灌胃濃度：8.3mg/kg。

米索前列醇片，規(guī)格0.2mg/ 片，產(chǎn)品批號：43200304，華潤紫竹藥業(yè)，灌胃濃度：100μg/kg。

苯巴比妥鈉，規(guī)格0.1g/瓶，生產(chǎn)批號：190503，上海上藥新亞藥業(yè)。

1.2 實驗主要試劑和儀器

1.2.1 實驗試劑

一氧化氮測試盒 貨號：S0159O-2 南京建成

大鼠TNF-αELISA 試劑盒 貨號：MM-0180R2江蘇酶免

大鼠IL-6ELISA 試劑盒 貨號：MM-0190R2江蘇酶免

1.2.2 實驗儀器

電子分析天平（瑞士PRECISAXB220A）、組織研磨儀器（HF-48，上海凈帆貿(mào)易有限公司）、冷凍離心機（TGL16M 臺式高速冷凍離心機）、酶標儀（Rayto,RT-6100）、移液槍、-80℃冰箱、4%多聚甲醛固定液、玻片、大鼠灌胃針、燒杯、玻璃棒、滴管、棉球、注射器、解剖固定板、組織剪、眼科剪、鑷子、采血管、采血針、置物架、紗布、無菌手套等。

1.3 實驗動物

均來源于西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，許可證號 ：SCXK（川）2018-17，選取性成熟SD 雌性大鼠48只，體重220～250g，雄性大鼠20只，體重250～280g，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心忠山動物房，許可證號 SYXK（川）2018-065。實驗期間充分供給食物和水源，人工模擬光照（白天和黑夜各12h），動物房溫度維持在21℃-23℃，濕度60%±20%。

2 實驗方法

2.1 不全流產(chǎn)大鼠造模

隨機挑選出8只未合籠雌性大鼠作為空白組（D 組），剩余雌鼠參照王曉東造模法[6],按照雄鼠：雌鼠=1:2 的比例進行合籠，合籠時間選擇每日下午18:00，次日晨08:00 檢查雌鼠陰栓或陰道涂片，查見陰栓或精子則判定為妊娠第1 天，未孕大鼠繼續(xù)合籠至判定為妊娠。妊娠大鼠于懷孕第 7天上午08:00 灌胃米非司酮（8.3mg/kg），同日下午18:00 灌胃米索前列醇(100μg/kg)，灌胃后于陰道內(nèi)置入1 大小適宜無菌棉球，若造模成功則第二天早晨于雌鼠陰道內(nèi)棉球上可見部分血跡。

2.2 動物分組及干預(yù)措施

建模成功后的雌鼠被隨機分為5 組，分組情況為模型組（E 組）、益母縮宮顆粒低劑量組（A 組）、益母縮宮顆粒中劑量組（B 組）、益母縮宮顆粒高劑量組（C 組）、新生化顆粒組（F 組），每組各8只。其中D、E 組灌胃動物飲用水，連續(xù)7 天，余組灌胃對應(yīng)濃度藥物，連續(xù)7 天。

2.3 標本采集

各組大鼠予以相應(yīng)干預(yù)措施處理后，入組第8天予以10%苯巴比妥鈉行腹腔注射麻醉，麻妥后將大鼠固定于解剖板上，消毒完畢后沿腹部正中切開，迅速進腹，找到粉紅色 Y 型子宮組織，從卵巢下端至宮頸口處完整離斷子宮，一部分置于4%多聚甲醛固定液中，一部分置于1.5mLEP 管凍存于-80℃冰箱中，對取材后的標本做好標注，以便檢測。

2.4 大鼠子宮組織勻漿NO、TNF-α、IL-6 的檢測方法

稱取約0.1g 子宮組織，梯度解凍，按照子宮組織（g）：0.9%氯化鈉注射液（mL）=1:9 進行冰浴勻漿，離心機轉(zhuǎn)速3000r/min，溫度4℃，離心10min，取上清液沸水（95-100 ℃）5min 后，于3000r/min再離心5min 后取上清液，置于冰上待測。嚴格按照Elisa 試劑盒說明書對TNF-α、 IL-6 水平進行測定，嚴格按照硝酸酶還原法試劑盒說明書檢測子宮組織勻漿中NO 含量。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用 SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示。數(shù)據(jù)分布符合正態(tài)性且方差齊性的多組資料采用完全隨機設(shè)計的方差分析（one-way ANOVA）進行統(tǒng)計分析，采用 LSD 法進行組間比較；腫瘤壞死因子a 數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，采用秩和檢驗法（KrusKal-Wallis檢驗）進行統(tǒng)計分析。P＜0.05 則差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 大鼠子宮組織勻漿NO 含量

與E 組相比，B、C、F 組大鼠子宮組織勻漿中NO 含量明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）,A組大鼠子宮組織勻漿中NO 含量差異無統(tǒng)計學(xué)意 義（P＞0.05）；與F 組 相 比，A 組 大 鼠子宮組織勻漿中NO 含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），B、C 組大鼠子宮組織勻漿中NO 含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3.2 大鼠子宮組織勻漿TNF-α 含量

與E 組相比，各組大鼠子宮組織勻漿中TNF-α的含量均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與F組相比，A、B 組子宮組織勻漿中TNF-α 的含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），C 組子宮組織勻漿中TNF-α 的含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠子宮組織勻漿NO 含量(±s)

表1 各組大鼠子宮組織勻漿NO 含量(±s)

注：與D 組 相 比，*P＜0.05，**P＜0.01；與E 組 相 比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與F 組相比，#P＜0.05，##P＜0.01

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表2 各組大鼠子宮組織勻漿TNF-α 含量(±s)

表2 各組大鼠子宮組織勻漿TNF-α 含量(±s)

注：與D 組 相 比，*P＜0.05，**P＜0.01；與E 組 相 比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與F 組相比，#P＜0.05，##P＜0.01

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3.3 大鼠子宮組織勻漿IL-6 水平

與E 組相比，各組大鼠子宮組織勻漿中IL-6含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與F組相比，A、B 組大鼠子宮組織勻漿中IL-6 含量未見統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），C 組大鼠子宮組織勻漿中IL-6 含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組大鼠子宮組織勻漿IL-6 水平(±s)

表3 各組大鼠子宮組織勻漿IL-6 水平(±s)

注：與D 組 相 比，*P＜0.05，**P＜0.01；與E 組 相 比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與F 組相比，#P＜0.05，##P＜0.01

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研究結(jié)果表明益母縮宮顆粒能降低藥物不全流產(chǎn)大鼠子宮組織勻漿中NO、TNF-α 和IL-6 的水平，與新生化顆粒組相比，益母縮宮顆粒高劑量組TNF-α 和IL-6 降低，表明其改善炎癥因子、減輕炎癥方面效果優(yōu)于新生化顆粒，其治療藥物流產(chǎn)后異常子宮出血的機制可能與減輕子宮組織炎癥反應(yīng)、防止宮腔感染有關(guān)。

4 討論

藥流后異常子宮出血與宮腔感染密切相關(guān)，長期反復(fù)陰道流血容易導(dǎo)致子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、月經(jīng)紊亂、繼發(fā)不孕、貧血、免疫力低下等，在孕早期感染是導(dǎo)致墮胎相關(guān)死亡的最常見的原因[7]。其中在炎癥發(fā)展過程中起到核心作用的是TNF-α，在炎癥初起時扮演調(diào)節(jié)免疫、提高抗感染能力的免疫調(diào)節(jié)因子的角色，同時還能扮演誘導(dǎo)炎癥介質(zhì)、引發(fā)局部炎癥反應(yīng)的促炎因子角色，主要通過刺激內(nèi)皮細胞產(chǎn)生黏附因子產(chǎn)生作用，最終造成子宮組織的損害[8]。參與炎癥反應(yīng)的主要誘導(dǎo)者是IL-6，各組織炎癥的嚴重程度可以由該項指標來反映，主要原理是因其參與了炎癥反應(yīng)毒性作用的催化和放大，從而造成了組織細胞的損害[9]。

藥物流產(chǎn)后異常子宮出血屬祖國醫(yī)學(xué)“墮胎下血、產(chǎn)后惡露不絕、胞衣殘留”等診治范疇。益母縮宮顆粒在生化湯基礎(chǔ)上加益母草、枳殼、生蒲黃，增強了行氣止痛、活血化瘀的療效，在前期臨床研究和動物研究中均證實益母縮宮顆粒能夠顯著縮短陰道流血時間,促進蛻膜絨毛組織排出,減輕炎癥,促進子宮內(nèi)膜修復(fù)[10]。本研究顯示益母縮宮顆粒能降低子宮組織勻漿NO、TNF-α、IL-6 含量，其治療藥物流產(chǎn)后異常子宮出血的機制可能與減輕子宮組織炎癥反應(yīng)、防止宮腔感染有關(guān)，其在改善炎癥因子、減輕炎癥方面效果優(yōu)于新生化顆粒，值得在臨床上推廣使用。