狼瘡性腎炎患者樹突細胞B7-H4表達與調節(jié)性T淋巴細胞的相關性研究

肖長長 羅丹 陳少英 胡志輝 劉蘭霞 駱九源 蘇小玲 張俊愛

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是自身免疫介導的,以免疫性炎癥為突出表現(xiàn)的彌漫性結締組織病。其特征是自身抗體產生的抗核和/或細胞質抗原增加,免疫復合物沉積在各個器官的微血管中,補體激活和整合,白細胞在多個器官中浸潤,以及各種類型的組織損傷［1-3］。50%～70%的SLE患者病程中會出現(xiàn)臨床腎臟受累,腎活檢顯示幾乎所有SLE均有腎臟病理學改變。LN對SLE預后影響甚大,腎功能衰竭是SLE的主要死亡原因之一［4］。B淋巴細胞和T淋巴細胞都參與狼瘡發(fā)病［5］。目前臨床上仍以激素聯(lián)合免疫抑制劑為主要的治療方案,但其治療有顯著的副作用,且仍有部分患者對傳統(tǒng)的方案不敏感,這類患者極易發(fā)展為多器官功能衰竭、終末期腎臟?。?］。因此,深入研究LN的發(fā)病免疫機制,尋找理想的LN治療靶點具有重要意義。B7-H4是最近發(fā)現(xiàn)的B7家族新成員,屬共抑制分子,在正常組織中及細胞中有大量信使核糖核酸(mRNA)表達,但是蛋白質水平的表達較低,而在腫瘤細胞中,B7-H4 在mRNA 水平以及蛋白水平中均高表達,可以通過抑制T細胞增殖和細胞因子分泌對T細胞的免疫應答進行負性調控［7］。樹突狀細胞(dendriticcell,DC)是參與固有免疫、啟動和調節(jié)適應性免疫最重要的細胞之一,是唯一能活化Naive T細胞的抗原提呈細胞(antigen presenting cell,APC)。最近研究證明,DC在LN中起著關鍵作用［8］。B7-H4介導的信號途徑對T、B細胞活化起負調節(jié)作用,可在DC細胞上誘導性表達,其作用及機制尚不明確。CD4+CD25+調節(jié)性T細胞(Tregs) 最先是因其控制自身抗原的免疫反應能力而被識別的,它保持自身免疫穩(wěn)定和防止自身免疫發(fā)生,Liu等［9］發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+CD127lo可以替代CD4+CD25+Foxp3+表達。據此作者推測,在抗原及炎癥因子長期刺激下,B7-H4分子被耗竭,B7-H4+DC細胞下調,B7-H4+DC細胞促進NaiveT細胞向Tregs的分化減少,Tregs減少導致LN持續(xù)炎癥反應過強。本項目中檢測B7-H4在外周血DC中的表達,分析B7-H4+DC與Tregs的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2020年5～12月在本院腎內風濕免疫科門診及住院確診的LN患者50例作為實驗組,所有病例均符合1997年美國風濕病學會(ARA) 修訂的LN診斷標準,同時排除合并嚴重感染和患有腫瘤的患者,其中男5例,女45例；年齡22～46歲,平均年齡(34.2±12.3)歲。根據患者的SLE疾病活動指數(shù)(systemic lupus erythematosus disease activity index,SLEDAI)評估結果分為活動期組(SLE疾病活動指數(shù)積分≥10分,30例)和靜止期組(SLE疾病活動指數(shù)積分＜9分,20例)。經治療目前無臨床癥狀或有微量蛋白尿,但無進展,實驗室檢查無顯著異常,抗ds-DNA抗體轉陰或抗核抗體滴度很低。另選擇同期在本院健康體檢者45例作為健康對照組,其中男5例,女40例；年齡24～46歲,平均年齡(34.5±10.5)歲。實驗組和健康對照組的性別和年齡等一般資料比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),具有可比性。健康對照組納入標準：既往無系統(tǒng)性紅斑狼瘡及嚴重慢性疾病病史,近期無使用糖皮質激素,血常規(guī)、肝腎功能、免疫相關指標正常。本研究經東莞市厚街醫(yī)院的批準,并征得研究對象的知情同意,實驗在廣東醫(yī)科大學免疫實驗室進行。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 FITC標記CD4、PE標記CD25、Alexa Fluor標記CD127。上述試劑盒及CBA試劑盒、淋巴分離液、Buffer液等均購自美國BD公司；FACSCanto Ⅱ流式細胞儀型號為BD公司產品。

1.2.2 實驗方法 檢測B7-H4+DC細胞及Treg,采集患者和健康對照組外周血,采用密度梯度離心獲外周血單個核細胞(PBMC),然后采用流式細胞術檢測DC中B7-H4表達情況及Tregs的數(shù)量。CD4+CD25+CD127loT細胞的檢測具體操作詳見參考文獻［10,11］。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據進行處理。計量資料以均數(shù)±標準差()表示,采用t檢驗,多組比較采用方差分析；定性計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗；相關性分析采用非參數(shù)Spearman分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組外周血DC中B7-H4表達情況比較 活動期組外周血DC中B7-H4表達水平低于健康對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；靜止期組外周血DC中B7-H4表達水平與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組外周血DC中B7-H4表達情況比較(n)

2.2 活動期組B7-H4表達與CD4+CD25+CD127loT細胞數(shù)量的相關性分析 經Spearman相關性分析,狼瘡活動期組B7-H4表達水平與CD4+CD25+CD127loT細胞數(shù)量呈正相關(r=0.611,P＜0.05)。見表2。

表2 狼瘡活動期組B7-H4、CD4+CD25+CD127lo T細胞的相關性(n)

3 討論

B7-H4又名B7S1,B7x,是新近發(fā)現(xiàn)的B7新家族成員,屬共抑制分子。其mRNA在外周組織中分布廣泛,但其蛋白質僅在造血細胞表面呈誘導性表達,主要表達于抗原提呈細胞和活化的T細胞表面。B7-H4在外周組織細胞中介導的免疫應答中起負調節(jié)作用,其所介導的信號途徑可抑制T細胞的增殖和白細胞介素(IL)-2的分泌,阻滯T細胞的細胞周期,還可抑制中性粒細胞前體細胞的功能［12］。有研究［13］發(fā)現(xiàn),B7-H4抗原表達于腎小管上皮細胞胞漿中,LN患者B7-H4 陽性腎小管數(shù)明顯低于對照人群,并且和腎臟組織中的腎小管間質損害積分明顯負相關。LN患者sB7-H4含量與正常對照和無腎炎的 SLE 患者無明顯差異,但其和SLE-DAI明顯正相關,LN高度活動組明顯高于中度活動組。同時有實驗表明,B7-H4缺乏癥也加劇了LN小鼠模型淋巴組織腫脹和腎臟病變［14］。用B7-H4拮抗劑抗體治療也加重了狼瘡模型,相反,B7-H4 Ig減輕了狼瘡的表現(xiàn)［15］。這些證據均表明B7-H4在LN的發(fā)病過程中起著重要的作用。

DC主要參與機體的免疫功能,在LN中起著關鍵作用。B7-H4介導的過程對T、B細胞主要是起負性調節(jié),可在DC細胞上誘導性表達。DC在LN發(fā)展和進步中的作用：目前尚不確定LN中免疫應答和免疫耐受平衡是如何被打破的,但DCs被認為在LN中起著關鍵作用［16］。①LN患者血清、淋巴結和炎癥組織(如皮膚和腎臟)中發(fā)現(xiàn)高水平的凋亡細胞,這些調亡細胞的自身RNA和DNA與pDCs的Toll樣受體第9型(TLR9)或Toll樣受體第7型(TLR7)［17,18］的結合,誘導Ⅰ型干擾素(IFN)的持續(xù)輸出。DCs產生的IFN以自分泌的方式促進自身的活化和成熟,包括IFN的輸出增加,CD80、CD86和MHCⅡ類的表面表達增加,使其更善于激活T細胞。DC細胞功能異常：HN患者中 pDC刺激T細胞的能力明顯增強。②同時發(fā)現(xiàn)LN患者 pDCs在加入凋亡的PMNs后沒能誘導出調節(jié)性T調節(jié)的細胞特征(Foxp3表達),而健康者能誘導表達FoxP3。③SLE供體的未成熟DC和成熟DC均表達較高水平的CCR7、CD40和CD86,并誘導較強的T細胞增殖；系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者DCs的異常行為是由內在缺陷引起的,是由其在炎癥環(huán)境中的發(fā)展引起的,還是兩者的結合引起的目前尚不清楚。基于SLE中觀察到的DCs功能的失調以及DCs在SLE發(fā)病機制的啟動和持續(xù)中的作用的新證據,深入探討DC在LN發(fā)病中作用及其機制,對探尋LN治療的靶點具有重要意義。

調節(jié)性T細胞又名抑制性T細胞,是一群具有免疫調節(jié)功能的T細胞亞群,可通過負向調節(jié)其他免疫細胞的功能進行維持自身免疫穩(wěn)態(tài)。其不但維持自身和外來抗原的免疫耐受,在自身免疫學疾病、腫瘤、感染性疾?。?9］等也發(fā)揮重要作用。調節(jié)性T細胞可分泌多種抑制性細胞因子如IL-10、轉化生長因子-β(TGF-β)、IL-35等,還下調APC細胞的功能或競爭APC細胞上的共刺激分子進行抑制效應性T細胞［20］。調節(jié)性T細胞是CD4+T細胞的一個亞群,通過抑制自身反應性淋巴細胞維持自我耐受；具有免疫抑制功能,其數(shù)量的減少和功能的減弱可能參與了LN的發(fā)生,因此,調節(jié)性T細胞的缺陷或缺乏調節(jié)性T細胞被認為是SLE發(fā)病機制的一部分［14］。Liu等［9］研究發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+CD127lo可以替代CD4+CD25+Foxp3+表達。

B7-H4在自身免疫性疾病中發(fā)揮了重要作用,最新研究發(fā)現(xiàn)狼瘡鼠敲除B7-H4基因或使用抗B7-H4抗體封閉內源性B7-H4表達后出現(xiàn)大量抗dsDNA 抗體產生、腎臟病變進展,然而使用B7-H4Ig可以減輕狼瘡樣癥狀。據此作者推測,在抗原及炎癥因子長期刺激下,B7-H4分子被耗竭,B7-H4+DC細胞下調,B7-H4+DC細胞促進Naive T細胞向Tregs的分化減少,Tregs減少導致LN持續(xù)炎癥反應過強。

本研究發(fā)現(xiàn),活動期組外周血DC中B7-H4表達水平低于健康對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)；靜止期組外周血DC中B7-H4表達水平與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。經Spearman相關性分析,狼瘡活動期組B7-H4表達水平與CD4+CD25+CD127loT細胞數(shù)量呈正相關(r=0.611,P＜0.05)。這一結果與鄭京等［21］的研究是一致的。B細胞的激活有兩條主要途徑：①經典激活途徑：T細胞輔助B細胞產生自身抗體；②在無T細胞的輔助下,DC通過和B細胞的受體相結合,使得B細胞活化。B細胞的異常活化,自身免疫耐受性降低,直接針對自體抗原產生大量的自身抗體,造成器官和組織的損傷,構成了系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病基礎。作者推測,狼瘡活動期組患者B細胞活化,在此發(fā)病基礎上,CD4+T細胞、CD4+CD25+CD127loT細胞凋亡增多,因此循環(huán)的CD4+CD25+CD127loT細胞絕對數(shù)量也減少。因此,臨床工作中,可通過干預DCs或提高Tregs的水平治療和改善LN患者的病程。

綜上所述,B7-H4在活動期LN患者外周血中低表達,而且與調節(jié)性T細胞數(shù)量呈正相關,可作為狼瘡活動性的指標,可能成為LN了解其免疫狀態(tài)、生物靶點治療的重要依據。