日本結(jié)縷草耐鹽基因ZjbHLH106的克隆及序列分析

謝 琦

[1.深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院/廣東省植物表觀遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518060；2.深圳大學(xué)光電工程學(xué)院/光電子器件與系統(tǒng)(教育部/廣東省)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518060]

鹽脅迫是影響植物生長、發(fā)育的重要生物脅迫之一，植物應(yīng)對(duì)鹽脅迫的生物學(xué)反應(yīng)，在細(xì)胞、分子和生理水平上都已經(jīng)有了較為清晰的闡述。鹽脅迫調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及諸多因素包括脫落酸水平的增加，滲透保護(hù)劑、抗氧化劑和保護(hù)蛋白的積累等。脅迫誘導(dǎo)的基因產(chǎn)物不僅與耐受脅迫相關(guān)，同時(shí)也參與到基因表達(dá)調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。轉(zhuǎn)錄因子(TF)是植物體內(nèi)重要的基因，很多類轉(zhuǎn)錄因子能特異響應(yīng)外界環(huán)境的脅迫，調(diào)控逆境相關(guān)基因的表達(dá)，影響或者啟動(dòng)植物抗逆相關(guān)的生物學(xué)進(jìn)程。在植物體內(nèi)，已經(jīng)鑒定出非常多的轉(zhuǎn)錄因子參與到植物的非生物脅迫調(diào)控路徑。bHLH(basic helix-loop-helix)是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，其成員眾多，在植物體內(nèi)僅次于MYB轉(zhuǎn)錄因子家族。擬南芥中鑒定出了162個(gè)bHLH成員，在水稻中也鑒定出了167個(gè)bHLH成員。bHLH結(jié)構(gòu)域約含60個(gè)氨基酸，包含了2個(gè)功能不同的結(jié)構(gòu)域。DNA結(jié)合區(qū)域位于N端，約含有15個(gè)氨基酸，HLH(helix-loop-helix)區(qū)域主要由疏水殘基組成，形成2個(gè)兩親的α螺旋，由1個(gè)可變長度的環(huán)區(qū)隔開，該區(qū)域位于結(jié)構(gòu)域的C端末端，以二聚體形式起作用。bHLH轉(zhuǎn)錄因子通常識(shí)別和結(jié)合E-box序列(CANNTG)，如G-box序列(CACGTG)。bHLH家族基因與很多非生物類脅迫相關(guān)，例如基因(MYC-like bHLH)與植物的抗凍脅迫相關(guān)，參與了滲透脅迫相關(guān)的生物學(xué)反應(yīng)，參與了寒冷脅迫，響應(yīng)損傷及干旱脅迫。在擬南芥鑒定到了1個(gè)耐鹽基因基因，該基因在擬南芥未分化的愈傷組織響應(yīng)鹽脅迫的誘導(dǎo)，并且缺失了的擬南芥突變體對(duì)NaCl敏感，且過表達(dá)的株系對(duì)鹽脅迫的抗性增強(qiáng)。

本研究通過同源序列比對(duì)在結(jié)縷草基因組中鑒定和獲得了基因，通過RT-PCR獲得了該基因編碼序列(CDS)，保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)該基因具有典型的bHLH結(jié)構(gòu)域，并且通過鹽脅迫處理以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)研究該基因在鹽脅迫下的表達(dá)量變化。鑒定和研究基因有助于研究和闡述結(jié)縷草耐鹽相關(guān)的分子機(jī)理，并且為結(jié)縷草耐鹽相關(guān)的分子改良育種工作提供了優(yōu)質(zhì)的候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料準(zhǔn)備

日本結(jié)縷草種子來源于北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所，將日本結(jié)縷草種子放入水中浸泡24 h進(jìn)行催芽處理，之后播種于直徑15 cm的花盆中培養(yǎng)，營養(yǎng)土與蛭石體積比為3 ∶1。植物發(fā)芽后培養(yǎng)4周時(shí)間，之后用200 mmol/L的NaCl溶液澆灌處理，選取30 min、1 h、2 h、4 h、24 h及48 h的結(jié)縷草根，迅速放于超低溫冰箱(-80 ℃)，以備后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.2 RNA提取及cDNA合成

取200 mg結(jié)縷草根系樣品，在液氮中充分研磨，通過TRIzol法(The InvitrogenTRIzolPlus RNA Purification Kit)提取樣品的總RNA。取1 μg的總RNA，利用TAKARA的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript1st Strand cDNA Synthesis Kit)，反轉(zhuǎn)錄成單鏈的cDNA，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 基因序列的分析及克隆

在擬南芥基因組中(https：//www.arabidopsis.org/)中下載基因序列(ID：AT2G41130)，通過同源序列比對(duì)在日本結(jié)縷草中鑒定的序列。利用NCBI在線引物設(shè)計(jì)程序(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)設(shè)計(jì)日本結(jié)縷草基因的引物(表1)，通過聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)克隆目標(biāo)基因。

1.4 啟動(dòng)子區(qū)域分析

根據(jù)日本結(jié)縷草提供的序列基因信息，將基因開放閱讀框前2 000 bp序列作為啟動(dòng)子序列進(jìn)行下載。利用在線軟件PlantPAN 3.0(http：//plantpan.itps.ncku.edu.tw/promoter.php)分析基因的啟動(dòng)子序列。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

根據(jù)NCBI在線引物設(shè)計(jì)程序(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)，對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)的引物設(shè)計(jì)(表1)。利用TOYOBO公司的SYBR Green試劑盒(SYBRGreen Realtime PCR Master Mix)對(duì)基因進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)，內(nèi)參序列選用Actin序列(表1)。

表1 引物序列及信息

2 結(jié)果與分析

2.1 日本結(jié)縷草bHLH106基因的擴(kuò)增

擬南芥的基因響應(yīng)鹽脅迫誘導(dǎo)，可能在鹽脅迫中參與了重要的作用。本研究通過登陸擬南芥網(wǎng)站(https：//www.arabidopsis.org/)，下載擬南芥序列(AT2G41130)，通過同源比對(duì)分析，在結(jié)縷草的基因組(http：//zoysia.kazusa.or.jp/)中進(jìn)行同源序列比對(duì)，獲得日本結(jié)縷草的序列(Zjn_sc00014.1.g08160.1.sm.mk)。根據(jù)所提供的序列設(shè)計(jì)特異性引物(表1中的bHLH_F和bHLH_R)，通過RT-PCR擴(kuò)增出了包含完整編碼區(qū)(CDS)的序列，測序發(fā)現(xiàn)總長度為1 120 bp，與目標(biāo)序列基本一致(圖 1)。

2.2 ZjbHLH106基因序列分析

在結(jié)縷草的參考基因組中，(結(jié)縷草基因ID：Zjn_sc00014.1.g08160.1.sm.mk)編碼區(qū)內(nèi)出現(xiàn)了63 bp未測通的序列(圖2-A標(biāo)注NNNN的區(qū)域)，這部分序列的遺失可能影響了該基因開放閱讀框(ORF)的預(yù)測結(jié)果。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因?qū)嶋H的CDS區(qū)域與基因組預(yù)測的ORF區(qū)域確實(shí)存在一定的差異，實(shí)際序列具有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，而基因組預(yù)測得到的ORF序列存在3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子。

除去這63 bp序列的差異，實(shí)際克隆的在CDS區(qū)域第340個(gè)堿基出現(xiàn)了T變成了G(亮氨酸L變成了纈氨酸V)，第646個(gè)堿基出現(xiàn)了A變G的情況(蘇氨酸T變成了丙氨酸A)，這2個(gè)位點(diǎn)可能是SNP位點(diǎn)。通過NCBI保守結(jié)構(gòu)域的尋找，在第1個(gè)外顯子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了bHLH的保守結(jié)構(gòu)域(cd11455：bHLH_AtAIG1_like)，突變的位點(diǎn)存在于第2個(gè)外顯子區(qū)域，可能該區(qū)域氨基酸的變化并不影響該蛋白功能。

2.3 ZjbHLH106基因啟動(dòng)子序列分析

在日本結(jié)縷草基因組中下載了基因CDS區(qū)域前2 000 bp作為啟動(dòng)子區(qū)域，通過PlantPAN 3.0在線軟件分析，發(fā)現(xiàn)較多的啟動(dòng)子結(jié)合區(qū)域，并且存在很多比較典型的區(qū)域，比如花期相關(guān)的Dof、FAR1，生長素相關(guān)的Aux/IAA、ARF，花發(fā)育相關(guān)的MADS、SBP，非生物脅迫相關(guān)的bHLH、MYB、NAC等(表2)。啟動(dòng)子區(qū)域的分析預(yù)示著該基因可能在植物體內(nèi)很多的生物學(xué)進(jìn)程中受到了調(diào)控作用，直接或間接地參與到相關(guān)的生物學(xué)途徑中。

表2 日本結(jié)縷草bHLH106啟動(dòng)子區(qū)域分析

2.4 鹽脅迫處理對(duì)日本結(jié)縷草ZjbHLH106表達(dá)的影響

本研究對(duì)結(jié)縷草進(jìn)行鹽脅迫處理，提取鹽脅迫處理后0 min(CK)、30 min、1 h、2 h、4 h、24 h和 48 h 的結(jié)縷草根系的RNA，反轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，通過qRT-PCR(引物見表1)分析該基因的表達(dá)量水平，3個(gè)生物學(xué)重復(fù)取自不同單株的結(jié)縷草根系，每組試驗(yàn)進(jìn)行3個(gè)技術(shù)重復(fù)。結(jié)果(圖3)顯示，日本結(jié)縷草也在鹽脅迫的作用下，出現(xiàn)了表達(dá)量升高的現(xiàn)象。在30 min～1 h的增幅較為明顯，2 h時(shí)出現(xiàn)了較大幅度的升高，到4 h的時(shí)候達(dá)到了峰值，之后表達(dá)量開始下調(diào)，盡管48 h的時(shí)候表達(dá)量下調(diào)了很多，但是相比于未進(jìn)行鹽處理的對(duì)照(CK)，的表達(dá)量依然出現(xiàn)顯著性的增加。初步研究表明響應(yīng)鹽脅迫誘導(dǎo)，可能直接或間接參與結(jié)縷草耐鹽脅迫相關(guān)的生物學(xué)進(jìn)程。

3 討論與結(jié)論

日本結(jié)縷草是一類耐旱、抗鹽的禾本科草坪草類植物，但是對(duì)于結(jié)縷草耐鹽基因功能系統(tǒng)的研究工作較少，在分子生物學(xué)調(diào)控方面所知甚少。發(fā)掘和研究結(jié)縷草的抗逆基因有助于理解植物對(duì)逆境環(huán)境的抗性研究，也有助于結(jié)縷草本身的分子育種相關(guān)工作。擬南芥是一類耐鹽相關(guān)的基因，該基因與擬南芥的耐鹽性呈現(xiàn)正相關(guān)。本研究根據(jù)序列相似性原理，從日本結(jié)縷草中鑒定出了基因，通過RT-PCR擴(kuò)增出了該基因的CDS序列，該序列包含有bHLH(cd11455：bHLH_AtAIG1_like)的保守結(jié)構(gòu)域，啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)了很多典型的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域，表明該基因參與了體內(nèi)很多生物學(xué)進(jìn)程。對(duì)日本結(jié)縷草進(jìn)行鹽脅迫處理，發(fā)現(xiàn)該基因響應(yīng)鹽脅迫誘導(dǎo)。植物在受到脅迫后，ROS會(huì)出現(xiàn)大量積累，因此ROS相關(guān)的基因可能會(huì)出現(xiàn)一個(gè)激增的現(xiàn)象。在鹽脅迫處理30 min～1 h并沒有出現(xiàn)一個(gè)大幅度的激增，表明該基因可能與植物的ROS途徑并無直接的關(guān)聯(lián)。隨著鹽離子在植物體內(nèi)的積累，的表達(dá)量逐漸升高，在4 h達(dá)到了峰值后出現(xiàn)了下降，很可能是因?yàn)橹参镏饾u適應(yīng)了現(xiàn)有的鹽脅迫環(huán)境，因此表達(dá)逐漸下調(diào)。本研究克隆了日本結(jié)縷草耐鹽基因，為日本結(jié)縷草耐鹽的分子理論研究提供了思路和參考，也為植物耐鹽相關(guān)分子育種提供了優(yōu)質(zhì)的候選基因。