發(fā)菜藻粉對小鼠腸道菌群及免疫調(diào)節(jié)的影響

陳 旎，武毅凱，李艷茹，王 帥，韓成鳳，李 健，王曉麗，張樂樂，譚之磊，賈士儒，韓培培

（天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

人體腸道中棲居的腸道微生物總數(shù)可達(dá)到10～10個(gè)，在腸道中形成一個(gè)動(dòng)態(tài)變化且復(fù)雜的菌群生態(tài)系統(tǒng)。腸道微生物對人體的調(diào)節(jié)作用和重要性不亞于任何一個(gè)器官，腸道菌群與人體的健康密切相關(guān)，隨著研究的深入，越來越多的證據(jù)表明腸道微生物群對宿主的消化吸收、營養(yǎng)功能和免疫起著重要的作用。近年來，學(xué)者們對腸道菌群與免疫系統(tǒng)的相互關(guān)系進(jìn)行了大量的討論，得出腸道菌群不僅形成了一道強(qiáng)有力的免疫屏障，還對腸內(nèi)免疫具有一定的調(diào)節(jié)作用。

發(fā)菜學(xué)名發(fā)狀念珠藍(lán)細(xì)菌（），又名發(fā)狀念珠藻，在藻類分類系統(tǒng)中，發(fā)菜屬于藍(lán)藻門（Cyanophyta）、藍(lán)藻綱（Cyanophyceae）、念珠藻目（Nostocales）、念珠藻科（Nostocaceae）、念珠藻屬（），是一種分布廣泛的陸生固氮藍(lán)細(xì)菌，具有良好的食用價(jià)值和藥用價(jià)值。近年來發(fā)菜細(xì)胞因其所具有的多種生物活性而備受關(guān)注，主要表現(xiàn)在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、抗凝血等方面，例如研究發(fā)現(xiàn)野生發(fā)菜多糖Nosoflan具有很強(qiáng)的抗病毒活性，Kanekiyo等的研究表明液體培養(yǎng)條件下的發(fā)菜多糖對HSV-2病毒、人類巨細(xì)胞病毒和甲流流感病毒具有有效抗病毒活性，實(shí)驗(yàn)證明發(fā)菜水抽提物能夠增加唾液中免疫球蛋白A濃度，且具有一定的免疫活性。杜潔通過研究發(fā)現(xiàn)，與模型對照組相比，發(fā)菜多糖組能夠顯著增大小鼠的臟器指數(shù)以及增強(qiáng)脾臟B細(xì)胞分泌抗體能力，還能在一定程度上提高小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)化能力，可見發(fā)菜多糖具有增強(qiáng)小鼠體內(nèi)外免疫功能的作用；發(fā)菜多糖對大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌及沙門氏菌都有一定的抑制作用。但發(fā)菜在調(diào)節(jié)腸道微生物環(huán)境方面的作用報(bào)道較少，因此本實(shí)驗(yàn)探究發(fā)菜在改善腸道菌群結(jié)構(gòu)及增強(qiáng)機(jī)體免疫方面的作用，以期為發(fā)菜作為功能性食品和藥物的開發(fā)利用提供理論支撐。

本實(shí)驗(yàn)以野生發(fā)菜為原材料，探究不同劑量的野生發(fā)菜藻粉和液體培養(yǎng)發(fā)菜藻粉對C57/BL小鼠腸道菌群的影響，采用Illumina MiSep PE250高通量測序技術(shù)檢測兩種發(fā)菜藻粉對小鼠盲腸、結(jié)腸菌群結(jié)構(gòu)的影響，進(jìn)一步討論發(fā)菜藻粉對免疫調(diào)節(jié)的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為C57/BL清潔級小鼠，雄性，6 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所提供，動(dòng)物使用許可證號：SYXK（津）2014-0002，檢疫后備用。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過天津科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核，符合動(dòng)物保護(hù)、動(dòng)物福利和倫理原則，符合國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理的相關(guān)規(guī)定（批準(zhǔn)號：DWLI-20160626）。

發(fā)菜細(xì)胞、野生發(fā)菜 天津科技大學(xué)生化工程研究室；無水甲醇 天津化學(xué)試劑一廠；氯化鈣、硫酸鎂、硅酸鈉、氯化錳、硫酸鋅、硫酸銅、硫酸亞鐵、硝酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硼酸 上海阿拉丁生化科技股份有限公司。TRIzol、DNase I、RNase A（試劑為色譜純）北京索萊寶科技有限公司；DNA分子標(biāo)記（試劑為超純級） 大連寶生生物科技有限公司。TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、PrimeScript?RT reagent Kit、SYBRPremix Ex（Tli RNaseH Plus）、腸道菌群基因組DNA提取試劑盒 日本TaKaRa生物有限公司。試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Scientz-IID超聲破碎儀 寧波新芝公司；GC7890/MS5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；rapidNcube全自動(dòng)杜馬斯定氮儀 德國Elementar公司；ALPHA 1-4/LD冷凍干燥器 德國CHRIS公司；HPG-2080B光照培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；PHSJ-4A pH計(jì) 上海雷磁儀器廠；UV-2550紫外-可見分光光度計(jì) 日本SHIMADZU公司；L-8800氨基酸分析儀 日本日立有限公司；Stepone實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國ABO公司；Biometra PCR基因擴(kuò)增儀 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 野生發(fā)菜與液體培養(yǎng)發(fā)菜的預(yù)處理

野生發(fā)菜經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，獲得野生發(fā)菜藻粉。

將發(fā)菜藻種接種于60 L的無菌BG11培養(yǎng)基中，接種量10%，光照強(qiáng)度60 μmol/（m·s），通氣量0.2 m/h，室溫培養(yǎng)20 d。將發(fā)菜凍干后并研磨以獲得液體環(huán)境中培養(yǎng)的發(fā)菜藻粉。

1.3.2 發(fā)菜藻粉中化學(xué)組成的測定

采用全自動(dòng)杜馬斯定氮儀測定發(fā)菜藻粉中粗蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。采用索氏提取法進(jìn)行粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定。采用甲醇提取法進(jìn)行葉綠素a和類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定。參照文獻(xiàn)[13]方法進(jìn)行藻藍(lán)蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定。采用苯酚-硫酸法測定莢膜多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。對樣品進(jìn)行消解，所有待測樣品一式3 份，使用1 ng/mL調(diào)諧液對電感耦合等離子體質(zhì)譜儀進(jìn)行協(xié)調(diào)優(yōu)化，等離子體氣流量為18 L/min，載氣流量為1.2 L/min，輔助氣流量為0.93 L/min，碰撞氣流量為4.5 L/min，重復(fù)3 次，進(jìn)行礦質(zhì)元素含量的測定。稱取干燥的發(fā)菜細(xì)胞藻粉10 mg于安瓿管中，用5 mL 6 mol/L鹽酸溶液酸解24 h，9 000 r/min離心10 min取上清液，采用氨基酸分析儀在波長為570 nm和440 nm條件下對上清液中的氨基酸含量進(jìn)行檢測。

1.3.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

飼養(yǎng)環(huán)境：溫度保持在（25±2）℃，相對濕度保持在（50±5）%，自然明暗周期12 h。小鼠分組前先進(jìn)行為期2 周的環(huán)境適應(yīng)性生活，期間接受標(biāo)準(zhǔn)飲食。將30 只6 周齡的清潔級雄性C57/BL小鼠隨機(jī)分為5 組，每組6 只。給藥方案：空白組（生理鹽水）（NC），發(fā)菜藻粉的喂養(yǎng)劑量參考螺旋藻片對于成人的日推薦用量（4 g），即66.7 mg/kg（成人體質(zhì)量以60 kg計(jì)），低、高劑量組分別為成人日推薦量的3 倍和6 倍，液體培養(yǎng)發(fā)菜低劑量組（LL）灌胃劑量200 mg/kg，高劑量組（LH）灌胃劑量400 mg/kg，野生發(fā)菜低劑量組（WL）灌胃劑量200 mg/kg和高劑量組（WH）灌胃劑量400 mg/kg，對小鼠進(jìn)行定時(shí)灌胃，連續(xù)灌胃30 d，定期記錄小鼠體質(zhì)量。最后一次灌胃結(jié)束后，對小鼠絕食給水喂養(yǎng)24 h，收集新鮮的體外糞便，摘取小鼠眼球采血，收集血液室溫靜置，離心收集血清，-80 ℃保存。將采血完成的小鼠進(jìn)行脫頸處死，無菌收集結(jié)腸、盲腸末端5 cm以內(nèi)的內(nèi)容物、胸腺及脾臟，置于干燥的滅菌試管中，-80 ℃保存。對脾臟及胸腺進(jìn)行稱質(zhì)量，免疫器官指數(shù)計(jì)算如公式（1）所示。

1.3.4 血清中細(xì)胞免疫因子的測定

按照ELISA試劑盒說明書操作，測定血清中IL-1β、TNF-α、IFN-β以及腸液中分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，SIgA）的含量。

1.3.5 胸腺及脾臟中細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量的測定

參照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit說明書操作步驟進(jìn)行胸腺及脾臟中RNA的提取。參照PrimeScript? RT reagent Kit說明書操作步驟進(jìn)行cDNA的合成。以GenBank中公布的小鼠基因組中IL-1β、TNF-α、IFN-β和IgA的序列為模板設(shè)計(jì)引物，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成引物，引物序列如表1所示。應(yīng)用SYBRPremix Ex（Tli RNaseH Plus）試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)條件：預(yù)變性：95 ℃，30 s；熱循環(huán)：95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線：95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s。數(shù)據(jù)分析采用2法，使用作為內(nèi)參基因，進(jìn)行定量數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for real time-quantitative PCR

1.3.6 腸道環(huán)境因子中水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值、短鏈脂肪酸含量的測定

稱取0.1 g盲腸及結(jié)腸內(nèi)容物，稱質(zhì)量記為，置于105 ℃烘箱中烘至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量記為，盲腸及結(jié)腸內(nèi)容物中的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)算如公式（2）所示。

稱取0.1 g盲腸內(nèi)容物及糞便，按1∶9（/）的比例加入1 mL去離子水，用pH計(jì)測定混合液的pH值。稱取0.1 g盲腸內(nèi)容物進(jìn)行短鏈脂肪酸（short chain fatty acid，SCFA）含量測定，采用7890A氣相色譜和HP-INNOWAX色譜柱，GC分析條件：FID檢測器；載氣為N，流速為2 mL/min；分流比為1∶10；檢測器溫度為240 ℃，進(jìn)樣口溫度為240 ℃；升溫程序：初始溫度80 ℃，保持5 min，15 ℃/min升到140 ℃，再以10 ℃/min升到180 ℃，保持2 min，最后以30 ℃/min升到240 ℃，保持5 min。

1.3.7 腸道菌群的測序分析

將小鼠的盲腸和結(jié)腸取出后，迅速取出內(nèi)容物，置于已滅菌的Ep管中。然后立即放入液氮中速凍，以備Illumina HiSeq2500高通量測序使用。樣品DNA的提取、高通量測序文庫的構(gòu)建和基于Illumina HiSeq2500平臺的測序由廣州基迪奧生物技術(shù)有限公司完成。以30 ng左右的DNA為模板，用帶有barcode的特異引物擴(kuò)增16S rDNA的V3+V4區(qū)，擴(kuò)增使用的引物為上游引物：5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’，下游引物：5’-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3’。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 20統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行配對樣本檢驗(yàn)，＜0.05表示差異顯著，＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)菜藻粉的基本組成

本實(shí)驗(yàn)對野生發(fā)菜藻粉和液體培養(yǎng)發(fā)菜藻粉進(jìn)行了化學(xué)組成的測定。如表2所示，液體培養(yǎng)環(huán)境下所得的發(fā)菜藻粉的粗脂肪、葉綠素a和藻藍(lán)蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均極顯著高于野生發(fā)菜（＜0.01），說明液體培養(yǎng)提高了發(fā)菜細(xì)胞對光的利用效率。野生發(fā)菜藻粉的莢膜多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)更高，液體培養(yǎng)發(fā)菜藻粉中礦質(zhì)元素Fe、Zn和K的含量均高于野生發(fā)菜，野生發(fā)菜藻粉的Ca含量偏高，液體培養(yǎng)的發(fā)菜細(xì)胞中Na和K的含量豐富。

表2 不同培養(yǎng)環(huán)境下發(fā)菜藻粉成分分析Table 2 Chemical composition analysis of culture and wild N. flagelliforme powder

由表3可知，不同培養(yǎng)環(huán)境下發(fā)菜藻粉中共檢測出16種氨基酸，液體培養(yǎng)和野生發(fā)菜藻粉所含的氨基酸總量分別為278.1 mg/g和227.6 mg/g。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization，F(xiàn)AO/WHO）（1973年）推薦的理想蛋白質(zhì)模式規(guī)定，質(zhì)量較好的蛋白質(zhì)氨基酸組成必需氨基酸（essential amino acid，EAA）/總氨基酸（total amino acid，TAA）應(yīng)該在40%左右，EAA/非必需氨基酸（nonessential amino acid，NEAA）應(yīng)該在0.6%以上，野生發(fā)菜和液體培養(yǎng)下所得的藻粉蛋白質(zhì)氨基酸組成符合這一模式。可見，液體培養(yǎng)發(fā)菜藻粉更具有食用和藥用的價(jià)值。

表3 不同培養(yǎng)環(huán)境下發(fā)菜藻粉氨基酸成分分析Table 3 Amino acid composition of wild and cultured N. flagelliforme powder

2.2 發(fā)菜藻粉對小鼠體質(zhì)量和器官指數(shù)的影響

如圖1所示，可知在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)小鼠的體質(zhì)量均處于正常范圍內(nèi)。這表明每只小鼠在不同的處理?xiàng)l件下均處于健康的狀態(tài)。胸腺和脾臟的器官指數(shù)決定了其淋巴細(xì)胞增殖的程度，可在一定程度上反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱，由表4可知，與NC組相比，不同培養(yǎng)環(huán)境下的發(fā)菜藻粉對小鼠胸腺指數(shù)均無顯著影響（＞0.05），但LH、WH、WL組與NC組相比脾臟指數(shù)均顯著增加（＜0.05），說明發(fā)菜細(xì)胞對小鼠免疫功能有一定的促進(jìn)作用。

圖1 每周的小鼠體質(zhì)量的變化Fig. 1 Changes in body mass of mice every week

表4 發(fā)菜藻粉對小鼠器官指數(shù)的影響Table 4 Effect of N. flagelliforme powder on immune organ indices of mice

2.3 發(fā)菜藻粉對免疫因子的影響

IL-1β是一種致炎細(xì)胞因子，受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控和炎性細(xì)胞因子依賴和炎性細(xì)胞因子非依賴的蛋白水解作用的嚴(yán)密調(diào)控，其含量的降低意味著小鼠體內(nèi)炎癥的減輕；腫瘤壞死因子TNF-α主要負(fù)責(zé)殺死或抑制某些腫瘤細(xì)胞，并提高T淋巴細(xì)胞及其他殺傷細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性；干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）可刺激自然殺傷細(xì)胞使其對病毒的殺傷能力增強(qiáng)，更快地清除病毒感染，可反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱；SIgA在消化道、呼吸道和生殖道黏膜的表面能發(fā)揮其正常的抵抗細(xì)菌感染、中和病毒和毒素的功能，具有免疫排除功能，其水平高低從側(cè)面反映宿主免疫系統(tǒng)排除功能的強(qiáng)弱。由圖2A可知，LH與WH組的小鼠血清內(nèi)IL-1β質(zhì)量濃度較NC組顯著降低（＜0.05），意味著小鼠體內(nèi)炎癥的減輕，說明灌胃高劑量的發(fā)菜藻粉在一定程度上降低了小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)；由圖2B可知，WH組中的小鼠血清中TNF-α的質(zhì)量濃度顯著增加（＜0.05），達(dá)到119.56 μg/mL，與NC組比較，提高了183.23%，這意味著該組小鼠體內(nèi)可能有炎癥產(chǎn)生；由圖2C可知，野生發(fā)菜藻粉及液體培養(yǎng)發(fā)菜藻粉均能顯著提高小鼠血清中IFN-γ的質(zhì)量濃度（＜0.05），且與灌胃劑量成正比，這些結(jié)果表明發(fā)菜藻粉能在一定程度上提高小鼠的免疫能力；由圖2D可知，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清SIgA質(zhì)量濃度較NC組均有顯著升高（＜0.05），這表明灌胃發(fā)菜藻粉可增加盲腸內(nèi)組織液中SIgA的質(zhì)量濃度且與灌胃的發(fā)菜劑量成正比，發(fā)菜藻粉能使得小鼠腸道免疫能力增強(qiáng)。

圖2 發(fā)菜藻粉對小鼠血清中IL-1β（A）、TNF-α（B）和INF-γ（C）及腸液中SIgA（D）質(zhì)量濃度的影響Fig. 2 Effect of N. flagelliforme powder on the concentrations of IL-1β (A),TNF-α (B) and INF-γ (C) in serum and SIgA (D) in intestinal fluid of mice

如圖3A所示，與NC組相比，免疫因子IL-1β mRNA在脾臟與胸腺中的表達(dá)水平均無顯著變化（＞0.05），圖3B中顯示脾臟中TNF-α的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)（＜0.05），圖3C顯示IFN-γ在胸腺中的mRNA表達(dá)量與NC組相比無顯著變化（＞0.05），而WH組與LH組IFN-γ在脾臟中的mRNA表達(dá)量顯著高于NC組（＜0.05），圖3D顯示，與NC組相比，灌胃野生發(fā)菜與液體培養(yǎng)發(fā)菜均使小鼠胸腺、脾臟中IgA的mRNA表達(dá)量顯著增加?？梢?，灌胃發(fā)菜藻粉總體上能夠顯著上調(diào)小鼠免疫器官中免疫因子（TNF-α、INF-γ、SIgA）的mRNA表達(dá)。

圖3 發(fā)菜藻粉對小鼠脾臟、胸腺IL-1β（A）、TNF-α（B）、INF-γ（C）及IgA（D）合成基因mRNA水平的影響Fig. 3 Effect of N. flagelliforme powder on mRNA expression levels of IL-1β (A),TNF-α (B), INF-γ (C) and IgA (D) synthesis genes in spleen and thymus of mice

2.4 發(fā)菜藻粉對實(shí)驗(yàn)小鼠腸道環(huán)境的影響

由圖4A可知，在盲腸和結(jié)腸中，與NC組相比，LH、WH組水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所提高，腸道內(nèi)適當(dāng)?shù)奶岣吆靠稍黾蛹S便體積，對腸道健康產(chǎn)生有益影響，可推測灌胃發(fā)菜藻粉對盲腸有一定的積極作用。如圖4B所示，實(shí)驗(yàn)組小鼠糞便的pH值較NC組均顯著降低，且LH、WH組小鼠盲腸內(nèi)容物的pH值較NC組均顯著降低（＜0.05），pH值的降低表明SCFA濃度可能增大，從而可能抑制一些惡性腫瘤微生物及不良病原體的繁殖，最終加速有益菌的增殖。

圖4 發(fā)菜藻粉對小鼠腸道內(nèi)的水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）及pH值（B）的影響Fig. 4 Effect of N. flagelliforme powder on the water (A) content and pH (B) in the intestinal tract of mice

由圖5可知，灌胃發(fā)菜藻粉使小鼠盲腸內(nèi)SCFA的含量增加，且與灌胃劑量成正比，LH組小鼠乙酸及丙酸含量最高，分別為68.23、17.15 μmol/g，WH組小鼠丁酸含量最高，為7.76 μmol/g。

圖5 發(fā)菜藻粉對小鼠盲腸內(nèi)容物短鏈脂肪酸含量的影響Fig. 5 Effect of N. flagelliforme powder on the content of short-chain fatty acids (SCFA) in cecum contents of mice

2.5 發(fā)菜藻粉對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.5.1 Alpha多樣性分析

如表5所示，除結(jié)腸LH組Ace指數(shù)，盲腸和結(jié)腸中高劑量組小鼠的Observed species、Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)均顯著高于NC組（＜0.05），說明灌胃發(fā)菜藻粉使小鼠腸道中微生物的豐富度顯著地提高，另外，除盲腸LL組外，小鼠盲腸中各組的Shannon、Simpson指數(shù)與NC組相比均無顯著性差異（＞0.05），而結(jié)腸中，除LL組外，各實(shí)驗(yàn)組小鼠的Observed species指數(shù)和Shannon指數(shù)與NC組相比均顯著提高（＜0.05），這說明灌胃發(fā)菜藻粉主要增加了小鼠結(jié)腸內(nèi)微生物群落的物種多樣性。

表5 灌胃發(fā)菜藻粉的小鼠腸道菌群Alpha多樣性Table 5 Alpha diversity indices of intestinal microflora in mice fed with N. flagelliforme powder

2.5.2 Beta多樣性分析

主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）的方法能展示各個(gè)樣品間的差異大小，兩個(gè)樣品于坐標(biāo)軸上的距離較近，則表示這兩個(gè)樣品的物種組成相似，反之則表示兩個(gè)樣品的物種組成差異大。如圖6所示，在小鼠盲腸中NC組與LL組于坐標(biāo)軸上的位置較近，在小鼠結(jié)腸中LL組與NC組于坐標(biāo)軸上的距離較近，說明灌胃低劑量的液體培養(yǎng)發(fā)菜藻粉對小鼠盲腸和結(jié)腸內(nèi)菌群組成影響不大，而在WH、WL組和LH組中，小鼠盲腸和結(jié)腸內(nèi)菌群組成相似且與NC組相比發(fā)生了較大的變化。

圖6 灌胃發(fā)菜藻粉的小鼠腸道菌群Beta多樣性分析Fig. 6 Beta diversity analysis of intestinal flora in mice fed with N. flagelliforme powder

2.5.3 發(fā)菜藻粉對小鼠腸道菌群豐度的影響

通過對樣品中的16S rRNA基因V4區(qū)序列的Illumina測序，小鼠的結(jié)腸及盲腸中共檢測到9個(gè)菌門，其中厚壁菌門和擬桿菌門是主要成分。由表6和圖7A可知，發(fā)菜藻粉使小鼠結(jié)腸與盲腸內(nèi)的厚壁菌門與擬桿菌門所占比例與NC組相比均出現(xiàn)顯著變化。灌胃發(fā)菜藻粉后，結(jié)腸中擬桿菌門的相對豐度較NC組顯著降低，且與發(fā)菜的灌胃劑量成正比，其中LH組最低，為24.75%，厚壁菌門相對豐度較NC組顯著增加，其中WL組最高，為26.99%。各組間盲腸中擬桿菌門的相對豐度無顯著差別，而各實(shí)驗(yàn)組厚壁菌門的相對豐度與NC組相比顯著降低（＜0.01、＜0.001）。造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于腸道不同位置的營養(yǎng)成分不同。另外，灌胃發(fā)菜藻粉后小鼠腸道內(nèi)疣微菌門的相對豐度與NC組相比均顯著升高（＜0.05、＜0.01、＜0.001）。與NC組相比，LH組小鼠腸道中變形菌門的相對豐度均顯著增加（＜0.05、＜0.01），可見，就變形菌門而言，液體培養(yǎng)發(fā)菜更有利于腸道健康。以上結(jié)果表明兩種發(fā)菜藻粉均在不同程度上改變了小鼠腸道內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)，且對腸道健康有一定的促進(jìn)作用。

由圖7B可以看出，與NC組相比，實(shí)驗(yàn)組中一些益生菌、、和的相對豐度明顯升高。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明灌胃發(fā)菜藻粉使小鼠腸道內(nèi)的相對豐度明顯增加，且液體培養(yǎng)發(fā)菜效果更加顯著，其中盲腸中LL組的相對豐度較NC組提高30 倍，由此可見，發(fā)菜在提高免疫和改善腸道微環(huán)境等方面存在巨大的潛力。

表6 不同灌胃發(fā)菜劑量組間小鼠腸道群落相對豐度分布Table 6 Distribution of relative abundance of intestinal community in mice gavaged with different doses of N. flagelliforme

圖7 發(fā)菜藻粉對小鼠腸道菌群相對豐度的影響Fig. 7 Effect of N. flagelliforme powder on intestinal microflora relative abundance in mice

3 討 論

本研究初步探究了發(fā)菜藻粉對小鼠腸道微生態(tài)的影響，首先比較了野生發(fā)菜和液體培養(yǎng)發(fā)菜的基本生化組成，發(fā)現(xiàn)液體培養(yǎng)的發(fā)菜具有更高的營養(yǎng)和食用價(jià)值。蘇建宇對光合自養(yǎng)獲得的發(fā)菜的氨基酸組成與野生發(fā)菜的氨基酸組成進(jìn)行了比較，結(jié)果也證實(shí)了液體培養(yǎng)發(fā)菜具有更高的營養(yǎng)和食用價(jià)值，通過對細(xì)胞因子含量及細(xì)胞免疫因子在胸腺和脾臟中表達(dá)量測定結(jié)果的比較，發(fā)現(xiàn)血清中免疫因子（IL-1β、INF-γ）的含量與小鼠脾臟及胸腺中免疫因子mRNA表達(dá)量增減趨勢一致，免疫因子TNF-α在免疫器官中的含量與血清中免疫因子含量變化不一致，這兩者之間的差異可能是相關(guān)基因的表達(dá)量不同引起的。符宏磊等研究發(fā)現(xiàn)發(fā)菜多糖能有效提高小鼠血清中TNF-α和INF-γ的含量，本研究得出的結(jié)果與其一致。在對小鼠腸道菌群的影響研究中，發(fā)現(xiàn)發(fā)菜藻粉對于小鼠腸道環(huán)境中的pH值具有降低的作用，SCFA濃度增大，SCFA對機(jī)體具有多種有益功能，如促進(jìn)結(jié)腸上皮細(xì)胞的增殖與生長、參與機(jī)體能量代謝、調(diào)控炎癥反應(yīng)及抑制腸道致病菌定植等，綜上，發(fā)菜藻粉有利于維持腸道的穩(wěn)態(tài)和機(jī)體的健康。

通過Illumina MiSep PE250高通量測序分析，實(shí)驗(yàn)組腸道內(nèi)微生物結(jié)構(gòu)顯著改變，灌胃發(fā)菜藻粉使小鼠腸道內(nèi)的和相對豐度明顯增加，且液體培養(yǎng)發(fā)菜效果更加顯著。依附腸道黏膜而生，它在癌癥免疫治療上有非常顯著的效果，并具有抵抗代謝紊亂的作用。Everard等的研究表明，通過給小鼠灌胃活的可以誘導(dǎo)空腹誘導(dǎo)脂肪因子（fasting induced adipokines，F(xiàn)IAF）（可降低脂肪儲存能力）的表達(dá)，在不影響食欲和飲食習(xí)慣的情況下預(yù)防飲食誘導(dǎo)性肥胖。能夠減輕腸道炎癥反應(yīng)，提高結(jié)腸細(xì)胞線粒體和核糖體活性，系統(tǒng)恢復(fù)血清中宿主氨基酸代謝異常，Lai等發(fā)現(xiàn)其對于改善慢性阻塞性肺疾病有效。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)大量產(chǎn)SCFA的細(xì)菌，如、和，經(jīng)過發(fā)菜藻粉的灌胃后它們的豐度明顯增加。此外，灌胃發(fā)菜藻粉后明顯降低了和等致病菌/益生菌的比例。通過對比灌胃野生發(fā)菜藻粉、液體培養(yǎng)發(fā)菜藻粉后的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，灌胃野生發(fā)菜藻粉使小鼠腸道內(nèi)普雷沃菌屬豐度顯著增加，有研究表明某些免疫疾病的發(fā)生會(huì)引起該菌屬豐度的提高，這可能是導(dǎo)致WL、WH組小鼠血清內(nèi)TNF-α含量升高的原因。

綜上所述，發(fā)菜在調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)和提高機(jī)體免疫能力方面存在巨大的潛力，尤其是高劑量組液體培養(yǎng)發(fā)菜，可對液體培養(yǎng)發(fā)菜在腸道菌群方面的影響作更進(jìn)一步的研究，以期將發(fā)菜作為功能性食品和藥物投入市場。但存在的不足是，對于發(fā)菜藻粉中發(fā)揮作用的具體成分無法確定，發(fā)菜中多糖和藻藍(lán)蛋白的含量豐富，微藻中提取所得的藻藍(lán)蛋白和多糖均具有一定的抗氧化、抗腫瘤及增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用，可集中對發(fā)菜中這兩種活性成分進(jìn)行下一步的研究。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)探究了發(fā)菜藻粉對小鼠腸道菌群及免疫調(diào)節(jié)的影響。對野生發(fā)菜藻粉與液體培養(yǎng)發(fā)菜藻粉進(jìn)行了化學(xué)組成的比較，發(fā)現(xiàn)液體培養(yǎng)發(fā)菜藻粉更具有食藥用價(jià)值；利用不同劑量（200、400 mg/kg）的野生發(fā)菜藻粉和液體培養(yǎng)發(fā)菜藻粉灌胃C57/BL小鼠8 周后，LH組小鼠胸腺指數(shù)最高，達(dá)到3.48，而WL組小鼠脾臟免疫器官指數(shù)最高，達(dá)到4.78；測定免疫因子中IL-1β、TNF-α、IFN-γ和SIgA的質(zhì)量濃度，WH和LH組中的小鼠外周血液中IL-1β的質(zhì)量濃度顯著降低；實(shí)驗(yàn)組小鼠外周血液中IFN-γ的質(zhì)量濃度較NC組顯著提高，WH、LH組小鼠外周血液中TNF-α及腸液中SIgA質(zhì)量濃度與NC組相比顯著增加，灌胃發(fā)菜藻粉顯著上調(diào)了脾臟內(nèi)TNF-α、IFN-γ、Ig A的mRNA表達(dá)；灌胃發(fā)菜藻粉使得小鼠腸液的pH值顯著降低，盲腸中SCFA的含量顯著增加，其中LH組小鼠乙酸及丙酸含量最高，分別為68.23、17.15 μmol/g，WH組小鼠丁酸含量最高，為7.76 μmol/g；對結(jié)腸及盲腸內(nèi)容的測序分析結(jié)果表明，厚壁菌門和擬桿菌門是小鼠腸道中的優(yōu)勢菌門，灌胃發(fā)菜藻粉使小鼠結(jié)腸與盲腸中擬桿菌門相對豐度降低，結(jié)腸中厚壁菌門相對豐度增加，盲腸中厚壁菌門相對豐度減少，另外腸道中龐微菌門的相對豐度顯著增加；從屬的角度分析，益生菌、、和的相對豐度顯著升高，和等致病菌/益生菌的比例降低。綜合來看，液體培養(yǎng)發(fā)菜高劑量組在調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)和提高機(jī)體免疫能力方面更具有潛力。