刺梨及其活性成分對(duì)2型糖尿病小鼠糖脂代謝的影響

陳 超，譚書明，王 畫，楊 笙，代曉桐

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025）

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是一類由于攝入過多高糖高脂食品、缺乏運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的胰島素抵抗和胰島B細(xì)胞功能缺陷的代謝性疾病。據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟報(bào)道，自2015年以來全球患糖尿病的人數(shù)已達(dá)到4.25億，預(yù)測(cè)到2045年將達(dá)到7億，其中我國患者已達(dá)1.1億，居世界首位。目前一些降血糖藥物可能引起不同的副作用，如二甲雙胍、瑞格列奈會(huì)造成惡心、嘔吐，阿卡波糖會(huì)造成胃疼等，從植物中提取天然降血糖活性成分代替人工合成同類物質(zhì)，可提高安全性，降低副作用。

刺梨（Tratt）廣泛分布于西南地區(qū)，其中以貴州為主，是一種薔薇科野生植物。刺梨中含有豐富的黃酮和多糖。黃酮、多糖具有抗氧化、降血糖、降血脂等功能活性；孔曉妮等研究發(fā)現(xiàn)翻白草總黃酮能通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase，PI3K/Akt）途徑改善T2DM小鼠糖脂代謝紊亂和胰島素抵抗；楊玉玲等研究發(fā)現(xiàn)洋甘菊總黃酮能降低T2DM小鼠血糖水平、促進(jìn)胰島素分泌、改善糖耐量異常；王生亞等研究發(fā)現(xiàn)青稞多糖能改善T2DM小鼠氧化應(yīng)激、修復(fù)胰腺組織損傷；郎茜等研究發(fā)現(xiàn)杜仲葉多糖能改善T2DM大鼠胰島素分泌不足、氧化應(yīng)激并降低高血糖因子（Caspase-3、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK））在肝臟中表達(dá)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)刺梨原汁對(duì)改善糖脂代謝紊亂的效果良好，但刺梨中的活性成分對(duì)糖脂代謝影響的研究鮮有涉及，故本研究進(jìn)一步探討刺梨干粉（Tratt，RRT）、刺梨總多糖提取物（Tratt olysaccharide extraction，RPS）、刺梨總黃酮提取物（Tratt flavonoid extraction，RF）對(duì)T2DM小鼠糖脂代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

60 只體質(zhì)量為（20±2）g的健康雄性昆明小鼠由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0014。小鼠飼養(yǎng)在通風(fēng)良好、室溫（23±2）℃、相對(duì)濕度45%～65%、12 h/12 h明暗交換的環(huán)境中，自由攝食飲水。

刺梨品種為‘貴農(nóng)5號(hào)’，采摘于2020年9月上旬、貯存于-80 ℃環(huán)境，實(shí)驗(yàn)所用刺梨均為同一型號(hào)、同一批次，購自于貴州宏財(cái)聚農(nóng)投資有限公司。

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ） 美國Sigma公司；鹽酸二甲雙胍（純度97%） 上海麥克林生化科技有限公司；纖維素酶（活力＞400 U/mg） 北京恒遠(yuǎn)博泰生物科技有限公司；總蛋白定量測(cè)試盒、甘油三酯（triacylglycerol，TG）測(cè)定試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）測(cè)定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測(cè)定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）測(cè)定試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測(cè)定試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）測(cè)定試劑盒 南京建成生物科技有限公司；肝糖原測(cè)定試劑盒、葡萄糖激酶（glucokinase，GK）酶聯(lián)免疫試劑盒、過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（peroxisome proliferators-activated receptor-γ，PPAR-γ）酶聯(lián)免疫試劑盒 上海僑杜生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax190連續(xù)波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices公司；H1-16KR高速冷凍離心機(jī) 湖南可成儀器設(shè)備有限公司；DY89-II電動(dòng)玻璃勻漿機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；YD-202組織切片機(jī) 浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠；LGJ-10真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；UV9000S紫外分光光度計(jì)上海元析儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；研磨儀 德國Janke & Kunkel公司；恒流泵 蘇州辰傲電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 RRT、RPS、RF的制備

RRT：稱取適量刺梨真空凍干72 h，高速研磨成干粉待用。

RPS：參考文獻(xiàn)[5,20-23]的方法，取適量RRT按照料液比1∶15溶于超純水，按RRT質(zhì)量加入0.25%纖維素酶反應(yīng)1 h后放入超聲設(shè)備，功率300 W、溫度50 ℃提取40 min，抽濾得澄清濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干后加入無水乙醇，醇沉液置于4 ℃冰箱靜置12 h后，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，保留沉淀，沉淀加入超純水配成6 mg/mL溶液；預(yù)處理D101大孔樹脂后，稱取適量大孔樹脂裝柱，將粗多糖水溶液按1.5 mL/min流速進(jìn)樣，加入超純水洗滌至洗滌液無色為吸附完畢，加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液按照1.5 mL/min洗脫并收集洗脫液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、凍干得RPS待用。多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線參考葉潤(rùn)等的方法繪制，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為＝0.252 5+0.014 9（＝0.997 1），經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得RPS中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為71%。

RF：參考文獻(xiàn)[25-29]的方法，取適量RRT按照料液比1∶13溶于體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液中，按RRT質(zhì)量加入0.25%纖維素酶反應(yīng)1 h后放入超聲設(shè)備，功率300 W、溫度50 ℃提取40 min，抽濾得澄清濾液，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)凍干得黃酮粗提物；預(yù)處理AB-8大孔樹脂，將適量大孔樹脂填充到層析柱中，黃酮粗提物按照2.5 mg/mL溶于超純水并微波5 min保證充分溶解，抽濾，濾液按1.5 mL/min流速進(jìn)樣，加入超純水洗滌直至洗滌液透明無色為吸附完畢，將體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液按1.5 mL/min流速進(jìn)樣洗脫并收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)凍干得RF待用。黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制參考周藝等的方法。經(jīng)過測(cè)定，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為＝0.183 7+0.005（＝0.999 1），經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得RF中黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為51%。

1.3.2 動(dòng)物分組與處理

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)貴州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：EAE-GZU-2020-P010），符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理?；A(chǔ)飼料適應(yīng)性飼喂1 周后，根據(jù)小鼠體質(zhì)量隨機(jī)分為空白組（＝8）和高脂高糖組（＝52），空白組喂普通飼料，高脂高糖組采用表1配方喂養(yǎng)4 周后，除空白組外，其余各組12 h禁食不禁水后注射50 mg/kgSTZ，每3 d注射1 次，注射3 次造模結(jié)束，造模期間自由飲食飲水，造模10 d后，禁食12 h剪尾采血，測(cè)定空腹血糖值（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），高于11.1 mmol/L視為造模成功。造模成功后的小鼠分為5 組（＝8），分別為模型組、陽性組（灌胃200 mg/kg鹽酸二甲雙胍）、RRT組（灌胃400 mg/kgRRT）、RPS組（灌胃200 mg/kgRPS）、RF組（灌胃200 mg/kgRF）。將鹽酸二甲雙胍、RRT、RPS、RF按照純度換算成凈質(zhì)量，分別溶于生理鹽水配制灌胃溶液，根據(jù)小鼠體質(zhì)量調(diào)整灌胃劑量，每日同時(shí)間灌胃，模型組與空白組灌胃等量生理鹽水?？瞻捉M給予基礎(chǔ)飼料，其他組給予高脂高糖飼料。實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由飲食飲水，每周記錄進(jìn)食量、飲水量和體質(zhì)量，干預(yù)周期28 d。

表1 高脂高糖飼料配方Table 1 Formulation of high-fat and high-sugar diet

第29天，小鼠禁食不禁水12 h，摘眼球取血于離心管中，3 500 r/min、4 ℃離心15 min，吸取上層血清置入新離心管中轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中待測(cè)。小鼠脫頸處死，迅速解剖去除肝臟、腎臟、脾、白色脂肪及棕色脂肪并準(zhǔn)確稱質(zhì)量；白色脂肪位于腹膜內(nèi)、腸系膜上、附睪周圍及皮下，呈白色。棕色脂肪位于肩胛下、主動(dòng)脈周圍、縱膈及頸部組織，為暗紅色小顆粒。用生理鹽水洗去肝臟污血并將其等切分為6 份，5 份錫紙包裹放入液氮并迅速轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱待測(cè)，1 份裝入固定液中用于病理學(xué)觀察。

1.3.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.3.1 FBG的測(cè)定

分別在灌胃結(jié)束后的第0、7、14、21、28天，禁食不禁水6 h，剪尾采血，并使用血糖儀測(cè)定空腹FBG。

1.3.3.2 口服糖耐量測(cè)定

灌胃28 d后禁食不禁水12 h，6 組小鼠均按照2.00 g/kg劑量灌胃葡萄糖溶液，剪尾取血測(cè)量0、0.5、1 h和2 h時(shí)的血糖濃度。血糖曲線下面積（area under curve，AUC）根據(jù)公式（1）計(jì)算。

式中：、、和是灌胃葡萄糖溶液后0、0.5、1 h和2 h的血糖濃度/（mmol/L）。

1.3.3.3 臟器指數(shù)的測(cè)定

臟器指數(shù)根據(jù)公式（2）計(jì)算。

式中：為小鼠臟器質(zhì)量/g；為小鼠體質(zhì)量/g。

1.3.3.4 理化指標(biāo)測(cè)定

血清中的TC、TG、LDL-C、HDL-C及肝臟中的MDA、CAT、SOD、肝糖原、GK、PPAR-γ水平測(cè)定均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3.5 肝臟組織切片分析

解剖摘取各組小鼠肝臟，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定，固定狀態(tài)良好后，進(jìn)行修剪、脫水、包埋、切片、染色、封片制作切片，蘇木精-伊紅（hematoxylineosin，HE）染色，光學(xué)顯微鏡下放大200 倍觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)，按表2五級(jí)分法進(jìn)行肝臟病變程度分析，分?jǐn)?shù)越高代表病變程度越高。

表2 肝臟病理觀察評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Scoring criteria for liver pathological observation

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間分析比較用單因素方差分析，并采用Duncan法進(jìn)行組間兩兩比較，＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 RRT、RPS、RT對(duì)T2DM小鼠體質(zhì)量、進(jìn)食量、飲水量的影響

由表3可知，干預(yù)28 d后，空白組與模型組體質(zhì)量差異顯著（＜0.05），說明T2DM導(dǎo)致小鼠體質(zhì)量下降。經(jīng)陽性藥物和樣品干預(yù)后，陽性組體質(zhì)量與第0天接近，維持穩(wěn)定，與模型組差異顯著（＜0.05）；RRT組、RPS組體質(zhì)量下降趨勢(shì)相比模型組有所減緩，RF組小鼠在第28天時(shí)體質(zhì)量顯著高于模型組（＜0.05）。結(jié)果表明，RRT、RPS、RF均能改善T2DM小鼠體質(zhì)量下降現(xiàn)象，效果依次為RF＞陽性藥物＞RPS＞RRT。

表3 各組小鼠實(shí)驗(yàn)28 d期間內(nèi)初體質(zhì)量、末體質(zhì)量及體質(zhì)量變化（n＝8）Table 3 Initial and final body mass of mice from each group and changes in body mass of mice over the 28-day experimental period (n = 8)

由圖1可知，空白組進(jìn)食量、飲水量均在正常范圍；與空白組比，模型組進(jìn)食量、飲水量顯著增加82.6%和196.6%（＜0.05）。經(jīng)陽性藥物和樣品干預(yù)后，與模型組比，陽性組進(jìn)食量、飲水量分別顯著下降30.9%和44.7%（＜0.05），RRT組、RPS組、RF組進(jìn)食量分別顯著下降10.2%、20.7%、25.8%，飲水量分別顯著下降11.3%、24.2%、42.5%（＜0.05）。結(jié)果說明RRT、RPS、RF均可顯著改善T2DM小鼠多飲多食現(xiàn)象（＜0.05），陽性藥物、RPS和RF改善進(jìn)食量效果相近，陽性藥物和RF改善飲水量效果相近，總體效果依次為陽性藥物＞RF＞RPS＞RRT。

圖1 各組小鼠進(jìn)食量（A）和飲水量（B）的變化（n＝8）Fig. 1 Changes in food (A) and water (B) intake of mice in each group (n = 8)

2.2 RRT、RPS、RF對(duì)T2DM小鼠臟器指數(shù)的影響

由表4可知，模型組肝臟指數(shù)顯著高于空白組（＜0.05），經(jīng)陽性藥物和樣品干預(yù)后，與模型組相比，陽性組肝臟指數(shù)顯著下降19.5%（＜0.05），RRT組、RPS組、RF組肝臟指數(shù)分別顯著下降15.0%、15.1%、22.0%（＜0.05），說明RRT、RPS、RF均能降低肝臟指數(shù)。糖尿病腎病是糖尿病中常見的微血管并發(fā)癥，腎臟指數(shù)對(duì)評(píng)價(jià)糖尿病具有一定參考價(jià)值。與空白組比，模型組腎臟指數(shù)顯著上升（＜0.05），經(jīng)陽性藥物和樣品干預(yù)后，與模型組比，陽性藥物組、RRT組、RPS組、RF組腎臟指數(shù)明顯下降，其中RRT組、RF組與模型組差異顯著（＜0.05）。與空白組比，模型組脾臟指數(shù)顯著上升（＜0.05）。經(jīng)陽性藥物和樣品干預(yù)后，與模型組比，陽性組、RRT組脾臟指數(shù)明顯下降，RPS組、RF組脾臟指數(shù)顯著下降（＜0.05）。結(jié)果表明，RRT、RPS、RF能夠抑制機(jī)體臟器增大；這與Gao Yue等研究糙米酚類物質(zhì)對(duì)T2DM小鼠肝臟指數(shù)影響和陸敏濤等研究花椒麻素對(duì)T2DM小鼠臟器指數(shù)影響的結(jié)果相一致。

表4 各組小鼠臟器指數(shù)（n＝8）Table 4 Organ indices of mice in each group (n = 8)

2.3 RRT、RPS、RF對(duì)T2DM小鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C濃度的影響

由表5可知，與空白組比，模型組血清TC、TG、LDL-C水平顯著升高（＜0.05），HDL-C水平顯著下降（＜0.05），說明T2DM導(dǎo)致小鼠血脂代謝紊亂。經(jīng)陽性藥物和樣品干預(yù)后，與模型組相比，陽性組TC、TG、LDL-C水平分別顯著下降39.8%、28.5%、41.1%（＜0.05），HDL-C水平顯著增加49.7%（＜0.05）；RRT組、RPS組、RF組TC水平分別顯著下降17.0%、21.4%、33.4%（＜0.05）；RRT組、RPS組TG水平分別下降21.2%、11.9%，RF組TG水平顯著下降46.4%（＜0.05）；RRT組LDL-C水平下降14.3%，RPS組、RF組LDL-C水平分別顯著下降26.8%、33.9%（＜0.05）；RRT組、RPS組、RF組HDL-C水平分別顯著上升25.9%、51.7%、56.5%（＜0.05）。結(jié)果表明，RRT、RPS、RF均能改善T2DM小鼠血脂代謝紊亂、維持血脂水平穩(wěn)定，RF總體效果與陽性藥物相近。

表5 各組小鼠血清相關(guān)指標(biāo)變化（n＝8）Table 5 Changes in serum lipid indices of mice in each group (n = 8)

2.4 RRT、RPS、RF對(duì)T2DM小鼠脂肪分化因子PPAR-γ含量和脂肪質(zhì)量的影響

由圖2A可知，與空白組相比，模型組小鼠PPAR-γ含量顯著增加86.3%（＜0.05）。經(jīng)陽性藥物和樣品干預(yù)后，與模型組比，陽性組PPAR-γ含量顯著降低31.5%（＜0.05），RRT組降低12%，RPS組、RF組分別顯著降低17.2%和33%（＜0.05）。

由圖2B可知，與空白組相比，模型組小鼠白色脂肪質(zhì)量顯著增加28%（＜0.05）。經(jīng)陽性藥物和樣品干預(yù)后，與模型組比，陽性組白色脂肪質(zhì)量顯著下降40.3%（＜0.05），RRT組、RPS組分別下降2.5%、18.3%，RF組顯著下降34.8%（＜0.05）。與空白組比，模型組棕色脂肪質(zhì)量顯著降低68.1%（＜0.05）。經(jīng)陽性藥物和樣品干預(yù)后，與模型組相比，陽性組棕色脂肪質(zhì)量顯著增加113.1%（＜0.05），RRT組增加27.84%，RPS組、RF組分別顯著增加82.9%和144.3%（＜0.05）。

圖2 各組小鼠肝臟PPAR-γ含量變化（A）和白色脂肪、棕色脂肪質(zhì)量（B）（n＝8）Fig. 2 Changes of PPAR-γ contents in the liver (A) and white fat and brown fat contents (B) of mice in each group (n = 8)

以上結(jié)果說明，T2DM小鼠肝臟中PPAR-γ含量增加，導(dǎo)致小鼠體內(nèi)白色脂肪堆積；RRT、RPS、RF能抑制脂肪合成因子PPAR-γ在肝臟中的表達(dá)從而減少白色脂肪堆積，并增加棕色脂肪的質(zhì)量，總體效果依次為RF＞陽性藥物＞RPS＞RRT。這與管巧麗、史紀(jì)芳等研究發(fā)現(xiàn)活化AMPK可通過抑制PPAR-γ途徑調(diào)控3T3-L1脂肪細(xì)胞中脂滴蓄積以及Wang Lei等研究發(fā)現(xiàn)刺梨總多糖對(duì)白色脂肪堆積具有改善作用的結(jié)果相一致。

2.5 RRT、RPS、RF對(duì)T2DM小鼠FBG的影響

由圖3可知，空白組在干預(yù)期間FBG持續(xù)穩(wěn)定，且在正常范圍（3.9～6.1 mmol/L）；模型組第28天 FBG相比第0天增加23.64%，達(dá)到24.44 mmol/L。陽性組FBG前14 d緩慢增長(zhǎng)后下降，第28天降到11.63 mmol/L，RRT組、RPS組FBG變化趨勢(shì)和陽性藥物組相似，第28天分別降到14.53 mmol/L和13.03 mmol/L；RF組FBG呈穩(wěn)定下降趨勢(shì)，第28天降到11.13 mmol/L。結(jié)果表明，RRT、RPS、RF雖未能將FBG降到正常范圍，但相比模型組均明顯降低。這與安玉紅等研究發(fā)現(xiàn)刺梨果酒降低T2DM小鼠FBG的結(jié)果相一致。

圖3 各組小鼠28 d實(shí)驗(yàn)期間空腹FBG變化（n＝8）Fig. 3 Changes in fasting blood glucose levels of mice in each group during the 28-day experimental period (n = 8)

2.6 RRT、RPS、RF對(duì)糖尿病小鼠口服糖耐量的影響

由圖4A可知，灌胃葡萄糖溶液后，空白組血糖濃度在0.5 h內(nèi)短暫上升后迅速下降，2 h時(shí)已恢復(fù)至初始值。模型組血糖濃度持續(xù)升高，1 h后才緩慢下降，2 h時(shí)未恢復(fù)到初始值；陽性組血糖濃度變化趨勢(shì)與空白組相似，2 h時(shí)與初始值僅相差14.1%；RRT組血糖濃度變化趨勢(shì)與模型組相似，2 h時(shí)未恢復(fù)到初始值；RPS組、RF組血糖濃度變化趨勢(shì)均與陽性藥物組相似，2 h后血糖濃度與初始值相近。結(jié)果表明，陽性藥物、RPS、RF改善糖耐量效果相近，明顯優(yōu)于RRT。

由圖4B可知，與空白組相比，模型組AUC顯著上升305.4%（＜0.05）；與模型組比，陽性組AUC顯著下降46.4%（＜0.05），RRT組下降7.6%，與模型組差異不顯著（＞0.05），RPS組、RF組AUC分別顯著下降39.9%和30.6%（＜0.05），均與陽性藥物組差異不顯著（＞0.05）。結(jié)果表明，改善糖耐量異常能力依次為陽性藥物＞RPS＞RF＞RRT。

圖4 治療期間各組小鼠糖耐量（A）和AUC（B）的變化（n＝8）Fig. 4 Glucose tolerance (A) and area under the blood glucose-time curve (AUC) (B) of mice in each group during experimental period (n = 8)

2.7 RRT、RPS、RF對(duì)小鼠肝臟GK活力和肝糖原含量的影響

當(dāng)機(jī)體內(nèi)血糖水平過高時(shí)，GK能促進(jìn)葡萄糖分解、肝糖原合成、調(diào)節(jié)血糖水平。由圖5A可知，與空白組相比，模型組GK活力顯著下降42.8%（＜0.05），經(jīng)陽性藥物和樣品干預(yù)后，與模型組相比，陽性組GK活力顯著增加43.2%（＜0.05），RRT組增加12.2%，RPS組、RF組分別顯著增加32.1%和47.1%（＜0.05）。結(jié)果表明，RRT、RPS、RF均能上調(diào)肝臟GK活力，陽性藥物、RPS和RF效果均顯著優(yōu)于RRT，RF效果最佳。這與劉丹奇等研究發(fā)現(xiàn)紅茶、枸杞、桑葉多糖能提高T2DM小鼠肝臟GK活力的結(jié)果相一致。

T2DM會(huì)造成小鼠糖異生增多、GK活力降低，導(dǎo)致肝糖原含量下降。由圖5B可知，相比空白組，模型組肝糖原含量顯著下降67.5%（＜0.05），經(jīng)陽性藥物和樣品干預(yù)后，與模型組相比，陽性組肝糖原含量顯著增加159%（＜0.05），RRT組、RPS組、RF組分別顯著增加30.2%、45.6%、135.4%（＜0.05）。RF和陽性藥物效果相近，且顯著優(yōu)于RRT、RPS。結(jié)果表明，RF、RPS、RRT均能改善糖尿病肝糖原含量減少現(xiàn)象，RF效果最佳。這與Liu Kang、Wang Yudan等的研究結(jié)果相一致。

圖5 各組小鼠肝臟GK活力（A）和肝糖原含量（B）的變化（n＝8）Fig. 5 GK activity (A) and liver glycogen content in the liver (B) of mice in each group (n = 8)

2.8 RRT、RPS、RF對(duì)小鼠肝臟氧化應(yīng)激、損傷的影響

T2DM會(huì)導(dǎo)致MDA、有毒過氧化物在肝臟中大量堆積和SOD活力降低，從而引發(fā)肝臟應(yīng)激損傷和胰島B細(xì)胞損傷。由表6可知，與空白組相比，模型組MDA含量顯著增加82.4%（＜0.05）。經(jīng)陽性藥物和樣品干預(yù)后，與模型組相比，陽性組MDA含量顯著降低32.9%（＜0.05）；RRT組、RPS組、RF組分別顯著下降18.7%、17.1%、46.2%（＜0.05）。RF效果優(yōu)于陽性藥物且顯著優(yōu)于RRT、RPS。

表6 RRT、RPS、RF對(duì)小鼠肝臟MDA、CAT、SOD水平的影響（n＝8）Table 6 Effects of RRT, RPS, and RF on the levels of MDA, CAT, and SOD in the liver of mice (n = 8)

與空白組相比，模型組CAT活力顯著下降49.7%（＜0.05）。經(jīng)陽性藥物和樣品干預(yù)后，與模型組相比，陽性藥物組CAT活力顯著增加43.3%（＜0.05），RRT組、RPS組、RF組CAT活力分別增加10.3%、33.4%、59.1%。RF效果優(yōu)于陽性藥物、RPS且顯著優(yōu)于RRT。

與空白組相比，模型組SOD活力顯著下降69.5%（＜0.05），經(jīng)陽性藥物和樣品干預(yù)后，與模型組相比，陽性藥物組SOD活力顯著增加103.6%（＜0.05），RRT組、RPS組、RF組分別顯著增加37.4%、73.2%、132.7%（＜0.05）。RF效果顯著高于陽性藥物、RRT、RPS（＜0.05）。結(jié)果表明，RRT、RPS、RF均能抗氧化應(yīng)激、修復(fù)肝臟細(xì)胞，RF效果最佳。這與董華強(qiáng)等研究發(fā)現(xiàn)多穗黃酮根皮苷能改善T2DM小鼠氧化應(yīng)激的結(jié)果相一致。

2.9 肝臟病理學(xué)分析結(jié)果

由圖6和表7可知，空白組肝臟排列整齊，未發(fā)生脂肪變性、水腫和發(fā)炎。模型組肝細(xì)胞排列紊亂、高度水腫、胞體變大、胞質(zhì)疏松、大量肝細(xì)胞脂肪變性、胞質(zhì)中可見大小不一的圓形空泡，輕微發(fā)炎。經(jīng)陽性藥物和樣品干預(yù)后，陽性組肝細(xì)胞排列尚整齊，肝細(xì)胞輕微空泡變性，胞體中度腫脹，未發(fā)炎；RRT組肝細(xì)胞排列尚整齊，胞質(zhì)中可見大小不一的圓形空泡，大量肝細(xì)胞脂肪變性、中度水腫、未發(fā)炎；RPS組肝細(xì)胞排列尚整齊，中度水腫，肝細(xì)胞輕微脂肪變性，胞質(zhì)中可見大小不一的圓形空泡，未發(fā)炎；RF組肝細(xì)胞排列尚整齊，少量細(xì)胞發(fā)生氣球樣變，胞體輕微腫脹，胞質(zhì)空泡化，未發(fā)生脂肪變性和發(fā)炎。

圖6 小鼠肝臟病理學(xué)分析Fig. 6 Liver pathological analysis of mice

表7 各組小鼠肝臟病變程度（n＝8）Table 7 Degree of liver lesions in each group of mice (n = 8)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用高脂高糖飼料聯(lián)合STZ建立T2DM模型，探究RRT、RPS、RF對(duì)T2DM小鼠糖脂代謝紊亂的影響?！叭嘁簧佟睘樘悄虿〉湫桶Y狀。經(jīng)樣品干預(yù)后，RRT組、RPS組、RF組“三多一少”現(xiàn)象均明顯改善，其中RF對(duì)體質(zhì)量減輕、進(jìn)食量增多、飲水量增多改善效果強(qiáng)于RRT、RPS。臟器指數(shù)對(duì)衡量機(jī)體健康尤為重要，它是機(jī)體內(nèi)某臟器質(zhì)量與機(jī)體總質(zhì)量的比值，臟器指數(shù)過大或過小都會(huì)影響機(jī)體健康，RRT、RPS、RF均能改善肝臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、脾臟指數(shù)增大現(xiàn)象。

T2DM患者通常患有不同程度的脂代謝紊亂，高血脂是引起胰島素分泌異常或胰島素受體抵抗的原因之一，TC、TG、LDL-C含量升高，HDL-C含量減少是血脂升高、動(dòng)脈粥樣硬化的主要原因。RRT對(duì)TC、HDL-C改善效果顯著（＜0.05），RPS對(duì)TC、LDL-C、HDL-C改善效果顯著（＜0.05），RF對(duì)TC、TG、LDL-C、HDL-C改善效果均顯著（＜0.05）；說明RF改善脂代謝紊亂能力優(yōu)于RPS、RRT。PPAR-γ主要表達(dá)于脂肪組織和免疫系統(tǒng)，與機(jī)體免疫、脂肪細(xì)胞分化、胰島素抵抗均有關(guān)系；研究發(fā)現(xiàn)T2DM小鼠肝臟組織中PPAR-γ表達(dá)量均會(huì)增加，導(dǎo)致白色脂肪堆積和血脂水平升高。本研究結(jié)果表明，RRT、RPS、RF均對(duì)PPAR-γ表達(dá)有抑制作用，RF抑制效果優(yōu)于陽性藥物，RRT、RPS抑制效果顯著低于陽性藥物（＜0.05）。白色脂肪組織是機(jī)體內(nèi)儲(chǔ)存過剩能量的重要場(chǎng)所，棕色脂肪在機(jī)體內(nèi)負(fù)責(zé)分解白色脂肪并加快機(jī)體新陳代謝。RRT、RPS、RF均能通過抑制PPAR-γ的分化從而降低白色脂肪堆積、增加棕色脂肪含量，總體治療效果依次為RF＞陽性藥物＞RPS＞RRT。

T2DM是一種慢性內(nèi)分泌疾病，血糖水平升高是該疾病最主要的特征；發(fā)病后患者的血糖指標(biāo)長(zhǎng)期處于異常導(dǎo)致人體器官組織損傷，若不及時(shí)改善會(huì)導(dǎo)致各種并發(fā)癥。目前國際糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)為正常人FBG在3.3～6.1 mmol/L之間，若大于11.1 mmol/L則視為血糖超標(biāo)，故FBG是重要的檢測(cè)指標(biāo)之一。結(jié)果顯示，第8天時(shí)RRT組、RPS組、RF組相比模型組FBG明顯下降，其中RF效果最佳。糖耐量是指機(jī)體對(duì)血糖的調(diào)節(jié)能力，當(dāng)機(jī)體突然攝入大量葡萄糖時(shí)，機(jī)體快速分泌胰島素、合成肝糖原使體內(nèi)血糖下降到正常水平。糖耐量異常是指機(jī)體口服大量葡萄糖后胰島B細(xì)胞無法迅速做出反應(yīng)，口服糖2 h后血糖濃度依然未降到正常范圍。陽性藥物組、RRT組、RPS組、RF組相比模型組AUC分別下降46.4%、7.6%、39.9%、30.6%，干預(yù)效果依次為陽性藥物＞RPS＞RF＞RRT。

GK是機(jī)體內(nèi)調(diào)節(jié)血糖代謝的關(guān)鍵酶，主要在人體肝臟和胰腺中表達(dá)，可作為葡萄糖傳感器感知葡萄糖濃度的變化、促進(jìn)葡萄糖分解和肝糖原合成、維持機(jī)體血糖平衡。T2DM患者肝臟GK活性降低、肝糖原含量減少、激素分泌異常導(dǎo)致血糖水平失衡，血糖升高，故激活GK能促使血糖含量減少、肝糖原含量增多。RRT、RPS、RF組相比模型組GK活力分別增加12.2%、32.1%、47.1%，肝糖原含量分別增加30.2%、45.6%、135.4%。RF效果均最佳，說明RF是刺梨激活GK、促進(jìn)肝糖原合成的主要活性成分。

植物提取物在降血糖同時(shí)具有強(qiáng)抗氧化活性。MDA由生物體內(nèi)自由基作用在脂質(zhì)中發(fā)生過氧反應(yīng)產(chǎn)生，具有細(xì)胞毒性從而導(dǎo)致胰島B細(xì)胞損傷。SOD能夠有效清除超氧陰離子自由基，減少肝臟細(xì)胞損傷。CAT是一種過氧化物分解酶，可將有毒過氧化物還原為無毒羥基化合物從而保護(hù)肝臟細(xì)胞。機(jī)體內(nèi)源性抗氧化防御機(jī)制和DNA修復(fù)系統(tǒng)不堪重負(fù)時(shí)會(huì)導(dǎo)致胰島B細(xì)胞功能障礙，故減少氧化應(yīng)激能改善糖代謝紊亂。陽性藥物、RRT、RPS、RF均能減少肝臟中MDA含量，RF效果最佳。陽性藥物、RPS和RF增加CAT活力效果相近且均顯著優(yōu)于RRT，RF效果最佳。陽性藥物、RRT、RPS和RF對(duì)增加SOD活力效果均有顯著差異（＜0.05），干預(yù)效果依次為RF＞陽性藥物＞RPS＞RRT。肝臟病理觀察結(jié)果表明，陽性藥物、RRT、RPS、RF均能改善肝細(xì)胞排列紊亂、水腫、發(fā)炎現(xiàn)象，陽性藥物、RPS、RF對(duì)肝臟脂肪變性改善效果明顯優(yōu)于RRT。

綜上，RRT、RPS、RF能通過降低進(jìn)食量、飲水量、調(diào)節(jié)臟器指數(shù)、調(diào)節(jié)血糖血脂、抑制PPAR-γ分化、減少白色脂肪堆積、提高GK活力、增加肝糖原含量、修復(fù)肝臟氧化損傷、改善肝細(xì)胞水腫和脂肪變性等從而改善T2DM小鼠糖脂代謝紊亂。RPS、RF總體效果優(yōu)于RRT，RF對(duì)糖脂代謝紊亂、氧化應(yīng)激改善效果優(yōu)于RPS，RPS對(duì)糖耐量異常改善效果優(yōu)于RF。以上結(jié)果表明，RPS、RF可能作為有效改善T2DM的功能成分，下一步應(yīng)繼續(xù)研究RPS、RF調(diào)節(jié)糖脂代謝紊亂的具體作用機(jī)制。