馬軍韜， 張國(guó)民， 張麗艷， 鄧凌韋， 王永力， 高洪儒， 王南博， 宮秀杰

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，黑龍江哈爾濱 150028； 2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院耕作栽培研究所，黑龍江哈爾濱 150028)

水稻稻瘟病是由稻瘟病病菌()引起的一種世界性水稻病害，也是黑龍江省的主要病害之一，嚴(yán)重制約著當(dāng)?shù)厮旧a(chǎn)。其中，穗頸瘟造成的產(chǎn)量損失最為直接和嚴(yán)重。2005年、2006年黑龍江省水稻稻瘟病大面積發(fā)生，其絕大部分損失是由穗頸瘟造成的。近年來，隨著植保無人機(jī)技術(shù)的普遍推廣及農(nóng)民防病意識(shí)的提高，大規(guī)模、多頻次的藥劑防控措施得以實(shí)現(xiàn)，殺菌劑的使用量猛增，在控制住稻瘟病大流行的同時(shí)，也對(duì)環(huán)境造成了巨大污染，過度用藥現(xiàn)象頻繁，并不是病害的最佳解決途徑。綜合研究表明，合理利用品種的自身抗性可以有效控制病害，且操作輕簡(jiǎn)、生態(tài)環(huán)保。而品種合理利用的前提條件則是對(duì)其抗穗頸瘟能力進(jìn)行區(qū)域化精準(zhǔn)鑒定。

關(guān)于水稻品種的抗稻瘟病鑒定，從鑒定類型來說，多數(shù)研究是進(jìn)行的苗期葉瘟鑒定，如徐志健等的研究。少數(shù)研究進(jìn)行的是成株期穗頸瘟鑒定，韓豪杰等于2018—2019年應(yīng)用田間自然感病的鑒定方式分析了24個(gè)水稻品種在鄂西南10個(gè)地點(diǎn)的抗穗頸瘟情況，結(jié)果顯示，24個(gè)品種中，只有榮優(yōu)華占2年在不同地點(diǎn)都沒有發(fā)生穗頸瘟；只有榮優(yōu)華占和中9優(yōu)恩66 2年在不同地點(diǎn)的抗、感反應(yīng)型表現(xiàn)一致。王小秋等應(yīng)用注射接種混合菌株的鑒定方式分析了江蘇省158份粳稻新品種/系的抗穗頸瘟情況，結(jié)果顯示，158 份品種中，病級(jí)在7級(jí)或以上的品種達(dá)到了72%，病級(jí)在3級(jí)以下的品種只有35份。此外，張善磊等開展的類似試驗(yàn)也都應(yīng)用的是注射接種混合菌株的鑒定方式。

從水稻穗頸瘟的鑒定方式來說，田間自然感病鑒定方式應(yīng)用較多，如黃凌洪等的研究。該類鑒定方式雖操作輕簡(jiǎn)，但受環(huán)境條件影響較多，準(zhǔn)確性不好把握。相對(duì)而言，人工接種鑒定的準(zhǔn)確性則好很多，但具體選用哪種人工接種鑒定方式其結(jié)果也有明顯差別。汪真等應(yīng)用注射接種、帶穗剪穎接種、噴霧接種、吸管滴液接種等方式完成了2份水稻品種的抗性鑒定試驗(yàn)，結(jié)果顯示，4種接種方式下，供試品種的發(fā)病率平均值分別介于82.90%～88.45%、7.95%～9.85%、29.15%～33.30%和29.35%～41.50%之間，注射接種效果最佳。此外，賀閩等分別對(duì)人工注射接種的實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)進(jìn)行了詳細(xì)描述。

有鑒于此，本研究以人工注射接種為鑒定方式，以一批采集自黑龍江省不同積溫帶的稻瘟病病菌菌株為獨(dú)立接種體，完成其適宜種植區(qū)水稻品種抗穗頸瘟能力的定量分析，以期為品種自身抗性的充分利用提供數(shù)據(jù)支撐，幫助解決生產(chǎn)現(xiàn)實(shí)問題。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試水稻：2019年供試水稻品種69份，其中，第一積溫帶、第二積溫帶和第三積溫帶及以上品種分別為28、10、31份，品種名稱及適宜種植區(qū)信息見表1。2020年供試水稻品種33份，其中，第一積溫帶、第二積溫帶和第三積溫帶及以上品種分別為10、7、16份，為2019年試驗(yàn)中篩選到的抗穗頸瘟能力較好的品種，品種名稱及適宜種植區(qū)信息略。

表1 2019年供試水稻品種名稱及適宜種植區(qū)信息

供試稻瘟病病菌菌株：2019年供試稻瘟病病菌菌株60株，采自黑龍江省第一積溫帶、第二積溫帶和第三積溫帶及以上地區(qū)的水稻病株上，每個(gè)積溫帶均為20株；2020年供試稻瘟病病菌菌株150株，采自黑龍江省第一積溫帶、第二積溫帶和第三積溫帶及以上地區(qū)的水稻病株上，每個(gè)積溫帶均為50株；上述菌株均由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 接種鑒定方法 供試稻瘟病病菌菌株的分離、擴(kuò)繁和產(chǎn)孢等參照周江鴻等的方法。待大量分生孢子形成后，配制成3×10個(gè)孢子/mL的孢子懸浮液備用。

黑龍江省水稻品種抗穗頸瘟能力分析參照馬軍韜等的人工注射接種法完成，每個(gè)品種只接種來源于適宜種植區(qū)的稻瘟病病菌菌株。選擇環(huán)境條件易于發(fā)病的田塊，每個(gè)品種設(shè)置2行區(qū)，每行30蔸，單本插秧。水稻種植全過程不施用任何殺菌劑，在水稻始穗期用醫(yī)用注射器將合格的孢子懸浮液注入水稻穗苞中下部，接種量為1 mL/穗，每個(gè)處理接種3穗，1穗以上明顯發(fā)病則記為感病反應(yīng)型。

水稻黃熟期植株發(fā)病完全后，按下列標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)查，病情分為6級(jí)：0級(jí)，無??；1級(jí)，每穗損失5.0%及以下，或個(gè)別枝梗發(fā)病；2級(jí)，每穗損失5.1%～20.0%，或1/3左右枝梗發(fā)病；3級(jí)，每穗損失20.1%～50.0%，或穗頸或主軸發(fā)?。?級(jí)，每穗損失50.1%～70.0%，或穗頸發(fā)病，大部分秕谷；5級(jí)，每穗損失70.0%以上，或穗頸發(fā)病造成白穗。統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，將0～2級(jí)歸為抗病反應(yīng)型，3～5級(jí)歸為感病反應(yīng)型。

1.2.2 指標(biāo)評(píng)價(jià)方法 黑龍江省水稻品種抗穗頸瘟能力優(yōu)劣用抗性頻率高低表示：抗性頻率=非致病菌株數(shù)/總菌株數(shù)×100%。

選取綜合抗性頻率較好的水稻品種，用聯(lián)合抗病性方式評(píng)價(jià)其搭配后在適宜種植區(qū)可能的抗穗頸瘟能力，3個(gè)積溫帶共設(shè)計(jì)45個(gè)水稻品種組合。聯(lián)合抗病性包括聯(lián)合抗病性系數(shù)和聯(lián)合致病性系數(shù)2個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，以聯(lián)合抗病性系數(shù)最大且聯(lián)合致病性系數(shù)最小為最佳標(biāo)準(zhǔn)。聯(lián)合抗病性系數(shù)=組合中共同抗病菌株數(shù)/總菌株數(shù)；聯(lián)合致病性系數(shù)=組合中共同致病菌株數(shù)/總菌株數(shù)。

互補(bǔ)抗病性是以多個(gè)水稻品種抗性互補(bǔ)后的百分率高低為抗穗頸瘟能力優(yōu)劣的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，3個(gè)積溫帶共設(shè)計(jì)45個(gè)水稻品種組合。互補(bǔ)抗病性=(總菌株數(shù)-組合中共同致病菌株數(shù))/總菌株數(shù)×100%。

用水稻品種抗穗頸瘟相似度聚類分析方式評(píng)價(jià)水稻品種抗穗頸瘟遺傳分化情況，品種間抗穗頸瘟相似度高低用抗性相似系數(shù)大小表示，相似系數(shù)=1-相異系數(shù)。利用DPS 14.10分析軟件，將水稻品種與穗頸瘟的反應(yīng)型作為性狀，抗病反應(yīng)型記為“1”，感病反應(yīng)型記為 “0”，以不加權(quán)算術(shù)平均法(UMPGA法)完成聚類分析。本研究共完成33份水稻品種的抗穗頸瘟相似度聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻品種抗穗頸瘟接種鑒定結(jié)果

2019年數(shù)據(jù)(表2)顯示，第一積溫帶供試品種抗性頻率介于20.00%～95.00%之間，平均值為56.07%；其中，抗性頻率≥70.00%的品種有10份，占供試品種的35.71%，分別為中科發(fā)5號(hào)、中科804、松836、松粳16、松粳18、松粳19、松粳20、松粳35、龍稻18和五優(yōu)稻4號(hào)。第二積溫帶供試品種抗性頻率介于50.00%～90.00%之間，平均值為71.50%；其中，抗性頻率≥70.00%的品種有7份，占供試品種的70.00%，分別為綏粳14、齊粳10號(hào)、龍粳21、綏粳8、龍樺2號(hào)、龍慶稻6和綏粳21；第三積溫帶及以上供試品種抗性頻率介于0.00～95.00%之間，平均值為64.52%；其中，抗性頻率≥70.00%的品種有16份，占供試品種的51.61%，分別為龍粳3767、龍粳51、龍粳1437、龍粳1624、龍粳2305、龍粳3407、龍粳50、龍粳52、龍粳3040、龍粳3100、龍粳43、龍粳3047、龍粳3099、龍粳3007、三江1號(hào)和龍粳3001。

表2 2019年69份水稻品種在適宜種植區(qū)抗穗頸瘟鑒定結(jié)果

2020年進(jìn)一步增加接種菌株數(shù)量，對(duì)2019年抗性頻率高于70.00%的33份水稻品種進(jìn)行再次鑒定。數(shù)據(jù)(表3)顯示，33份水稻品種抗性頻率介于40.00%～90.00%之間，平均值為69.64%；抗性頻率≥70.00% 的品種有19份。其中，第一積溫帶品種抗性頻率介于40.00%～86.00%之間，平均值為68.80%；其中，抗性頻率≥70.00%的品種有6份，占供試品種60.00%，分別為松粳20、松粳35、松836、中科804、中科發(fā)5號(hào)和五優(yōu)稻4號(hào)。第二積溫帶品種抗性頻率介于42.00%～82.00%之間，平均值為71.71%；其中，抗性頻率≥70.00%的品種有6份，占供試品種數(shù)的的85.71%，分別為綏粳8、綏粳14、綏粳21、龍粳21、龍樺2號(hào)和龍慶稻6；第三積溫帶及以上品種抗性頻率介于48.00%～90.00%之間，平均值為69.25%；抗性頻率≥70.00%的品種有7份，占供試品種數(shù)的43.75%，分別為龍粳50、龍粳51、龍粳1624、龍粳3047、龍粳3100、龍粳3407和龍粳3767。

表3 2020年33份水稻品種在適宜種植區(qū)抗穗頸瘟鑒定結(jié)果

將2019年、2020年的接種鑒定結(jié)果進(jìn)行綜合分析，數(shù)據(jù)(表4)顯示，33份水稻品種對(duì)70株稻瘟病菌株的抗性頻率介于50.00%～88.57%之間，平均值為73.55%，抗性頻率≥70.00%的品種有22份，抗性頻率≥80.00%的品種有11份。鑒于試驗(yàn)所用菌株數(shù)量總體偏少，為確保品種在田間應(yīng)用的安全性及可靠性，進(jìn)一步提高抗性閾值，將抗性頻率≥80.00%的水稻品種定為抗穗頸瘟品種。依此原則，共獲得抗穗頸瘟水稻品種11份。其中，第一積溫帶抗穗頸瘟品種有3份，分別為松836、中科804和中科發(fā)5號(hào)；第二積溫帶抗穗頸瘟品種有2份，分別為綏粳8和綏粳14；第三積溫帶抗穗頸瘟品種有6份，分別為龍粳51、龍粳1624、龍粳3047、龍粳3100、龍粳3407和龍粳3767。

表4 33份水稻品種在適宜種植區(qū)2年綜合抗穗頸瘟鑒定結(jié)果

2.2 水稻品種聯(lián)合抗病性和互補(bǔ)抗病性分析

從各積溫帶選取抗性較好的品種，進(jìn)行聯(lián)合抗病性分析，數(shù)據(jù)顯示：供試水稻品種相互搭配后，各積溫帶均不存在最佳搭配方案，但仍具有一定差別。其中，第一積溫帶水稻品種的聯(lián)合抗病性系數(shù)和聯(lián)合致病性系數(shù)平均值分別為0.66、0.05，中科804 &中科發(fā)5號(hào)組合聯(lián)合抗病性系數(shù)最高，中科804 &松836組合和中科發(fā)5號(hào) &松836組合聯(lián)合致病性系數(shù)最低；如果以聯(lián)合抗病性系數(shù)≥0.70且聯(lián)合致病性系數(shù)≤0.05為閾值，則中科804 &中科發(fā)5號(hào)和中科發(fā)5號(hào) &松836共2個(gè)組合適合搭配種植(表5)。第二積溫帶水稻品種的聯(lián)合抗病性系數(shù)和聯(lián)合致病性系數(shù)平均值分別為0.59、0.06，綏粳8 &綏粳14組合聯(lián)合抗病性系數(shù)最高，綏粳8 &龍樺2號(hào)組合聯(lián)合致病性系數(shù)最低，無適合搭配種植的組合(表6)。第三積溫帶及以上水稻品種的聯(lián)合抗病性系數(shù)和聯(lián)合致病性系數(shù)平均值分別為0.70、0.02，龍粳3047 &龍粳3407組合和龍粳3100 &龍粳3407組合聯(lián)合抗病性系數(shù)最高，龍粳51 &龍粳3407組合、龍粳1624&龍粳3047組合和龍粳1624 &龍粳3407組合聯(lián)合致病性系數(shù)最低；共有龍粳3047 &龍粳3407、龍粳3100 &龍粳3407等8個(gè)組合適合搭配種植(表7)。

表5 第一積溫帶部分水稻品種聯(lián)合抗病性分析

表6 第二積溫帶部分水稻品種聯(lián)合抗病性分析

表7 第三積溫帶部分水稻品種聯(lián)合抗病性分析

從各積溫帶選取抗性較好的品種，進(jìn)行互補(bǔ)抗病性分析，數(shù)據(jù)顯示：第一積溫帶水稻品種的互補(bǔ)抗病性平均值為95.14%，中科804 &松836組合和中科發(fā)5號(hào) &松836組合互補(bǔ)抗病性最高，中科804 &五優(yōu)稻4號(hào)組合互補(bǔ)抗病性最低(表8)。第二積溫帶水稻品種的互補(bǔ)抗病性平均值為94.19%，綏粳8 &龍樺2號(hào)組合互補(bǔ)抗病性最高，綏粳21 &龍粳21組合互補(bǔ)抗病性最低(表9)。第三積溫帶水稻品種的互補(bǔ)抗病性平均值為97.90%，龍粳51 &龍粳3407組合、龍粳1624 &龍粳3407組合和龍粳1624 &龍粳3047組合互補(bǔ)抗病性最高，龍粳51 &龍粳1624組合、龍粳3047 &龍粳3767組合和龍粳3407 &龍粳3767組合互補(bǔ)抗病性最低(表10)。

表8 第一積溫帶部分水稻品種互補(bǔ)抗病性分析

表9 第二積溫帶部分水稻品種互補(bǔ)抗病性分析

表10 第三積溫帶部分水稻品種互補(bǔ)抗病性分析

2.3 水稻品種抗穗頸瘟相似度分析

從水稻品種抗穗頸瘟能力的相似度角度分析，第一積溫帶10份水稻品種的抗性相似系數(shù)介于0.58～0.88之間，平均抗性相似系數(shù)為0.69；其中，中科804和中科發(fā)5號(hào)的抗性相似系數(shù)最大，松粳16和松粳18的抗性相似系數(shù)最小。以抗性相似系數(shù)0.70為閾值，供試水稻品種可為劃分為3個(gè)抗性類群，即類群Ⅰ：松粳16；類群Ⅱ：龍稻18；類群Ⅲ：松粳18及其余品種(圖1)。第二積溫帶7份水稻品種的抗性相似系數(shù)介于0.57～0.78之間，平均抗性相似系數(shù)為0.68；其中，綏粳8和龍粳21的抗性相似系數(shù)最大，綏粳8和齊粳10號(hào)的抗性相似系數(shù)最小。以抗性相似系數(shù)0.70為閾值，供試水稻品種可為劃分為2個(gè)抗性類群，即類群Ⅰ：齊粳10號(hào)；類群Ⅱ：綏粳8及其余品種(圖2)。第三積溫帶及以上16份水稻品種的抗性相似系數(shù)介于0.66～0.88之間， 平均抗性相似系數(shù)為0.73； 其中， 龍粳3047和龍粳3407的抗性相似系數(shù)最大，龍粳43和龍粳52的抗性相似系數(shù)最小。以抗性相似系數(shù)0.70為閾值，供試水稻品種可為劃分為3個(gè)抗性類群，即類群Ⅰ：龍粳52；類群Ⅱ：龍粳3007；類群Ⅲ：龍粳43及其余品種(圖3)。

3 討論與結(jié)論

從品種的抗穗頸瘟角度分析，2019年應(yīng)用的接種菌株數(shù)量較少，易產(chǎn)生誤差，故暫時(shí)將抗性頻率≥70.00%的水稻品種列為抗穗頸瘟候選品種。2020年在增加接種菌株數(shù)量后進(jìn)行再次鑒定，33份候選品種抗性頻率整體較高，說明試驗(yàn)結(jié)果沒有問題，同時(shí)也驗(yàn)證了該鑒定技術(shù)的可靠性。此外，雖然2020年應(yīng)用的接種菌株數(shù)量有了大幅提升，但菌株群體依然偏小，故進(jìn)一步將抗性閾值提高為抗性頻率≥80.00%，共篩選得到抗穗頸瘟水稻品種11份，為病害的綠色防控奠定了資源基礎(chǔ)。此外，前人的研究多采用的是田間自然感病或注射接種混合菌株的鑒定方式，接種的菌株理論上來說都屬于混合菌株，得到的也多是品種或抗病或感病等一類定性化結(jié)果，很多細(xì)節(jié)受菌株個(gè)體間的相互作用而難以看到。而稻瘟病病菌屬于“基因-基因”假說模式菌，受自身遺傳特性影響，致病性分化明顯，必須接種足夠多的單個(gè)菌株，完成品種的抗性頻率計(jì)算，才能定量化明確品種在某一地區(qū)的真實(shí)抗性，從而使結(jié)果更接近生產(chǎn)現(xiàn)實(shí)，準(zhǔn)確指導(dǎo)田間生產(chǎn)。

從聯(lián)合抗病性角度分析，各積溫帶品種搭配后抗病效果差別較明顯，第三積溫帶及以上水稻品種搭配種植的效果最好，抗穗頸瘟能力最強(qiáng)，同時(shí)感病風(fēng)險(xiǎn)最??；第一積溫帶水稻品種搭配種植的效果次之，第二積溫帶水稻品種搭配種植的效果最差，不適合搭配。從互補(bǔ)抗病性角度分析，筆者認(rèn)為，在實(shí)際生產(chǎn)中可能達(dá)不到上述那么高的抗性頻率，因?yàn)殡m然品種搭配后利用生物多樣性的優(yōu)勢(shì)將大量減少稻瘟病病菌的寄主，壓縮其生存、繁殖空間，但依然有一部分適宜的寄主存在，依然會(huì)造成一定的侵染，只有將搭配品種自身攜帶的抗瘟基因類型摸索清楚，同時(shí)將有效的抗瘟基因全部聚合到一個(gè)水稻品種體內(nèi)，才可能達(dá)到預(yù)期的高抗效果。因此，互補(bǔ)抗病性的分析依然有其理論意義，可為基因發(fā)掘及聚合提供現(xiàn)實(shí)策略。

從抗穗頸瘟相似度角度分析，各積溫帶品種的相似度均較高，可能與供試品種來源相對(duì)單一、骨干親本血緣相近、交叉應(yīng)用相對(duì)頻繁等有一定關(guān)系，也從側(cè)面說明黑龍江省水稻品種的抗穗頸瘟遺傳基礎(chǔ)相對(duì)狹窄，急需引進(jìn)新型抗源。