李青松

（四川省綿陽(yáng)市經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 綿陽(yáng) 621000）

賈第蟲(chóng)是一種最常見(jiàn)的寄生生物，可感染人類(lèi)和多種動(dòng)物［1］。根據(jù)宿主和形態(tài)學(xué)分類(lèi)，賈第蟲(chóng)被分為六個(gè)種，其中只有腸賈第蟲(chóng)（又名藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)、十二指腸賈第蟲(chóng)）可感染人類(lèi)。腸賈第蟲(chóng)的基因型復(fù)雜，根據(jù)遺傳學(xué)和表型，至少分為8 個(gè)集聚體（A～H）［2］。奶牛主要感染集聚體E，其次是集聚體A和B［3］。近年來(lái)許多對(duì)奶牛犢牛感染腸賈第蟲(chóng)的相關(guān)研究顯示，奶牛犢牛斷奶前后腸賈第蟲(chóng)的感染率存在差異，斷奶前后犢牛感染腸賈第蟲(chóng)的基因型也有差異［4-14］。

本研究以成都部分地區(qū)（崇州、青白江、邛崍）奶牛場(chǎng)中的斷奶犢牛為研究對(duì)象，采用巢式PCR擴(kuò)增腸賈第蟲(chóng)β-賈第素（bg）基因、磷酸丙糖異構(gòu)酶（tpi）基因和谷氨酸脫氫酶（gdh）基因位點(diǎn)，確定感染率，并對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行集聚體鑒定。隨后基于三個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增出的序列，對(duì)斷奶犢牛腸賈第蟲(chóng)進(jìn)行亞型分析，最后建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。旨在為奶牛場(chǎng)防治腸賈第蟲(chóng)感染以及腸賈第蟲(chóng)人獸共患病的監(jiān)測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Power Soil?DNA Isolation Kit（糞便DNA提取試劑盒），2×Taq PCR Master Mix，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 樣品采集 在成都市崇州、青白江、邛崍的三個(gè)奶牛場(chǎng)采集圈養(yǎng)斷奶犢牛（2～12月齡）的新鮮糞便共計(jì)104份，每份糞樣約50 g，置于潔凈塑料采樣袋中，做好標(biāo)記、編號(hào)，于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品處理 取每份糞便樣品20 g，放入50 mL小燒杯中，加入適量蒸餾水，攪拌溶解并過(guò)濾。將濾液轉(zhuǎn)移到50 mL 離心管內(nèi)，以3 000 r/min 離心5 min，緩慢棄去上清液，保留沉淀物，一部分沉淀物直接用于DNA提取，另一部分沉淀物儲(chǔ)存于2.5%重鉻酸鉀，并于4 ℃冰箱中保存。

1.4 DNA提取 樣品處理后得到含糞便及卵囊的沉淀物，按照Power Soil?DNA Isolation Kit 說(shuō)明書(shū)提取樣本DNA。提取的DNA 置-20 ℃環(huán)境中保存。

1.5 PCR擴(kuò)增 基于β-賈第素（bg）基因位點(diǎn)對(duì)所有樣品進(jìn)行檢測(cè)，引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增條件參照Sulaiman 等［15］的報(bào)道?；讦?賈第素基因鑒定出的陽(yáng)性樣品，使用磷酸丙糖異構(gòu)酶（tpi）、谷氨酸脫氫酶（gdh）基因位點(diǎn)進(jìn)行基因亞型鑒定，引物設(shè)計(jì)及擴(kuò)增條件參照Appelbee 等［16］和Cacciò等［17］的報(bào)道。PCR反應(yīng)體系均為25 μL，包括：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、去離子水8.5 μL、上下游引物各1 μL、模板DNA 2 μL（第1輪PCR 產(chǎn)物為第2 輪PCR 的模板）。通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)第2 套巢式PCR 產(chǎn)物，置于凝膠成像儀內(nèi)，使用Image Lab Version 3.0 軟件成像拍照。

1.6 測(cè)序及分析 將PCR 陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，通過(guò)DNAMAN Version 8.0 軟件進(jìn)行拼接。將測(cè)序結(jié)果在GenBank中經(jīng)BLAST比對(duì)校正后，使用MEGA 7的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果 基于巢氏PCR擴(kuò)增β-賈第素（bg）基因位點(diǎn)、磷酸丙糖異構(gòu)酶（tpi）基因位點(diǎn)、谷氨酸脫氫酶（gdh）基因位點(diǎn)的目的基因條帶長(zhǎng)度分別為511 bp、532 bp、520 bp。

2.2 斷奶犢牛腸賈第蟲(chóng)感染情況 所采集的104 份樣品中共有42 份鑒定為腸賈第蟲(chóng)陽(yáng)性，總感染率為40.38%（42/104），其中崇州、青白江、邛崍三個(gè)奶牛場(chǎng)的感染率分別為46.88%（15/32）、41.94%（13/31）、34.15%（14/41），三個(gè)奶牛場(chǎng)皆發(fā)現(xiàn)了集聚體E和集聚體A感染。具體感染情況見(jiàn)表1。

表1 斷奶犢牛腸賈第蟲(chóng)感染情況統(tǒng)計(jì)

2.3 bg、tpi和gdh基因序列分析 經(jīng)過(guò)多次巢氏PCR擴(kuò)增bg、tpi、gdh三個(gè)位點(diǎn)，分別擴(kuò)增出11、8、9 條基因序列，分別發(fā)現(xiàn)6 種基因亞型（A1、E1、E2、E9、E11、E13），5 種基因亞型（A1、E3、E6、E15、E22），6 種基因亞型（A1、E1、E8、E10、E12、E13）?；蛐秃突騺喰蜋z測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 基于bg、gdh和tpi位點(diǎn)的腸賈第蟲(chóng)基因型和基因亞型檢測(cè)結(jié)果

基于bg 基因位點(diǎn)，11 條序列中以A1（n＝2）和E1（n＝2）基因亞型為主。形成的6 種基因亞型在NCBI的序列登錄號(hào)分別為A1（KR051222）、E1（KT922247）、E2（KT922248）、E9（KY769091）、E11（KY769089）、E13（MF671880），據(jù)此構(gòu)建出bg基因位點(diǎn)的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)。

基于tpi基因位點(diǎn)，8條序列中以A1（n＝3）和E3（n＝2）基因亞型為主。形成的5種基因亞型在NCBI 的序列登錄號(hào)分別為A1（KJ888991）、E3（KT922259）、E6（KY432850）、E15（KY432848）、E22（KY710748），據(jù)此構(gòu)建出tpi基因位點(diǎn)的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)。

基于gdh基因位點(diǎn)，9條序列中以A1（n＝2）、E1（n＝2）和E10（n＝2）基因亞型為主。形成的6種基因亞型在NCBI 的序列登錄號(hào)分別為A1（KT922255）、E1（KY769096）、E8（KT369785）、E10（KT698971）、E12（KY432840）、E13（KY432838），據(jù)此構(gòu)建出gdh基因位點(diǎn)的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)。

3 結(jié)論與分析

3.1 腸賈第蟲(chóng)感染情況 我國(guó)斷奶犢牛感染腸賈第蟲(chóng)的情況非常普遍，但感染率多數(shù)偏低。通過(guò)多基因位點(diǎn)分析結(jié)果可知，本研究中斷奶犢牛腸賈第蟲(chóng)的總感染率為40.38%（42/104），其中崇州、青白江、邛崍三個(gè)奶牛場(chǎng)的感染率分別為46.88%（15/32）、41.94%（13/31）、34.15%（14/41），高于廣東（0.94%）［7-8］、吉林（4.39%）［9］、寧夏（2.53%）［9］、江蘇（7.48%）［10］、河北和天津（3.48%）［11］、河南（2.42%）［12］、陜西（17.54%）［13］、新疆（16.60%）［14］。表明這些場(chǎng)中斷奶犢牛感染腸賈第蟲(chóng)的情況較為嚴(yán)重，可能是不同氣候生態(tài)條件、管理水平等因素綜合作用的結(jié)果。提示成都地區(qū)奶牛場(chǎng)中腸賈第蟲(chóng)可能是一種常見(jiàn)的病原體，應(yīng)當(dāng)引起重視。

3.2 腸賈第蟲(chóng)基因型情況 本研究在bg、tpi、gdh三個(gè)基因位點(diǎn)分別擴(kuò)增出了11、8、9條基因序列，分別形成6 種基因亞型（A1、E1、E2、E9、E11、E13），5 種基因亞型（A1、E3、E6、E15、E22），6 種基因亞型（A1、E1、E8、E10、E12、E13），均為已知亞型，且主要為集聚體E，其次為集聚體A，此項(xiàng)結(jié)果與國(guó)內(nèi)陜西［13］、新疆［14］地區(qū)的研究結(jié)果一致，故成都地區(qū)的奶牛場(chǎng)可參照這些地區(qū)的防控方法防治該病。通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，三個(gè)奶牛場(chǎng)中斷奶犢牛腸賈第蟲(chóng)集聚體E 的遺傳種類(lèi)多樣，可能與集聚體的遺傳重組有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)的所有集聚體A均為A1亞型，這種亞型主要在動(dòng)物身上發(fā)現(xiàn)，但也可以感染人類(lèi)，這提示成都地區(qū)奶牛場(chǎng)腸賈第蟲(chóng)感染具有人獸共患風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)當(dāng)引起高度重視?！?/p>