一測多評法測定雙黃連注射液中4 種成份的含量

王奎鵬，徐興敏，方清朝，王均偉，王祖紅

1 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，鄭州 450000；

2 河南科技大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，洛陽 471000；3 河南福森藥業(yè)有限公司，南陽 474450

雙黃連注射液由金銀花、黃芩和連翹按1∶1∶2的比例配伍，并經(jīng)過提取精制而成。其具有清熱解毒、清宣風(fēng)熱之功效，可治療外感風(fēng)熱引起的發(fā)熱、咳嗽、咽痛，也適用于病毒及細(xì)菌感染所致的上呼吸道感染、肺炎、扁桃體炎、咽炎等，收載于原《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第18冊［1］?，F(xiàn)行國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-2104-96-2010通過測定綠原酸、咖啡酸、黃芩苷和連翹苷4 個(gè)成份的含量，對雙黃連注射液進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)。目前雙黃連注射液的含量測定均采用外標(biāo)法（external standard method，EMS），即在相同的色譜條件下，以待測組份的純品為對照，比較對照品和樣品中待測組份的響應(yīng)信號進(jìn)行定量［2-6］。中藥成份復(fù)雜，僅檢測單一藥效成份無法作出客觀全面的評價(jià)，而多組份同時(shí)測定要求具備多個(gè)對照品，部分中藥對照品不易購置或制備，影響了中藥質(zhì)量評價(jià)的研究進(jìn)程［7］。一測多評法（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）基于多指標(biāo)質(zhì)量控制的研究思路，解決了參比物質(zhì)價(jià)格高或制備困難等難題，可實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測多指標(biāo)成份，已成為中藥及其制劑質(zhì)量評價(jià)的新模式［8］。當(dāng)前國內(nèi)外尚無采用QAMS 測定雙黃連注射液成份含量的報(bào)道?；诖?，本實(shí)驗(yàn)以連翹苷為內(nèi)標(biāo)參照物，計(jì)算綠原酸、咖啡酸、黃芩苷的相對校正因子（fs/i），并測定各成份含量。采用EMS 同步測定，驗(yàn)證QAMS 的準(zhǔn)確性和可行性，為評價(jià)雙黃連注射液的質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀［包括四元泵、VWD 檢測器、ChemStation 化學(xué)工作站，安捷倫科技（中國）科技有限公司］；BP211D 電子分析天平（德國賽多利斯公司）；YMC-C18 色譜柱（150mm×4.6mm，5μm，日本YMC 公司）；KQ-700VDE 型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；YB-Z 型真空恒溫干燥箱（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）。

1.2 試藥

綠原酸（批號：110753-201817，純度96.8%）、咖啡酸（批號：110885-201703，純度99.7%）、黃芩苷（批號：110715-201821，純度95.4%）、連翹苷（批號：110821-201816，純度95.1%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純，美國霍尼韋爾公司）；甲酸（色譜純，中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司）；超純水（河南福森藥業(yè)有限公司）；雙黃連注射液（河南福森藥業(yè)有限公司，批號：202009061、202009071、202009081、202009091、202009101）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采 用YMC-C18 色 譜 柱（150mm×4.6mm，5μm）；以乙腈-0.2%甲酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（見表1），程序結(jié)束后運(yùn)行5min；檢測波長為324nm（綠原酸、咖啡酸）和280nm（黃芩苷、連翹苷）；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量10μl；流速為1.0ml/min。理論板數(shù)按連翹苷峰計(jì)算應(yīng)不低于6000，綠原酸、咖啡酸、黃芩苷、連翹苷與相鄰色譜峰的分離度應(yīng)達(dá)到1.5 以上。

表1 洗脫梯度程序

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品溶液的制備

精密稱取綠原酸、咖啡酸、黃芩苷和連翹苷對照品適量，置棕色量瓶中，加 50%甲醇制成質(zhì)量濃度分別為40、30、60、60μg/ml 的混合對照品溶液，室溫保存，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備

精密移取供試品2ml，置50ml 棕色量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，過濾，即得。

2.2.3 陰性對照品溶液的制備

按雙黃連注射液的生產(chǎn)工藝，制備無黃芩、金銀花、連翹的陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。

圖1 混合對照品（A）、陰性對照品（B）和樣品（C）的高效液相色譜（HPLC）圖

2.3.1 線性關(guān)系

分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液1、3、5、10、15、20、30、50、80、100μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，詳見表2。結(jié)果表明，各成份在各自范圍內(nèi)的線性關(guān)系均良好。

表2 4 種成份線性關(guān)系

2.3.2 精密度試驗(yàn)

取同一供試品（批號：202009101），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，連續(xù)進(jìn)樣 6 次，測得綠原酸、咖啡酸、黃芩苷和連翹苷的峰面積RSD 分別為0.18%、0.43%、0.18%、1.67%，表明儀器精密度良好。詳見表3。

表3 4 種成份精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一供試品（批號：202009101）6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄各色譜峰峰面積。綠原酸、咖啡酸、黃芩苷、連翹苷的平均含量分別為0.195、0.065、7.108、0.143 mg/ml，RSD 分別為0.21%、0.63%、0.21%、0.86%，表明該方法重復(fù)性良好。詳見表4。

表4 4 種成份重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品（批號：202009101），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8h進(jìn)樣測定，測得綠原酸、咖啡酸、黃芩苷、連翹苷的RSD 分別為0.11%、0.29%、0.04%、1.42%，表明供試品溶液在8h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。詳見表5。

表5 4 種成份的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn)

分別精密吸取含量已知的樣品溶液（批號：202009101）2.0ml，共6 份，分別加入各對照品溶液適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定含量，計(jì)算加樣回收率和RSD。綠原酸、咖啡酸、黃芩苷、連翹苷的平均加樣回收率分別為100.97%、100.08%、94.49%、101.10%，RSD 分別為0.26%、0.25%、0.32%、0.45%，表明測定結(jié)果準(zhǔn)確。詳見表6。

表6 4 種成份的加樣回收率試驗(yàn)

2.4 相對校正因子（fs/i）的建立及耐用性評價(jià)

2.4.1 相對校正因子（fs/i）的建立

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液1、3、5、10、15μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄各對照品中各組份的峰面積。以連翹苷為內(nèi)標(biāo)參照物，根據(jù)公式fs/i=（Wi×As）/（Ws×Ai），分別計(jì)算綠原酸、咖啡酸、黃芩苷的相對校正因子。式中，fs/i為相對校正因子；Ws為內(nèi)標(biāo)參照物的質(zhì)量（μg）；As為內(nèi)標(biāo)參照物的峰面積；Wi為待測成份的質(zhì)量（μg）；Ai為待測成份的峰面積。詳見表7。

表7 樣品中待測成份的相對校正因子

2.4.2 相對校正因子（fs/i）的耐用性評價(jià)

考察不同高效液相色譜儀（Agilent 1260、賽默飛 DGP-3600SDN 和Waters E2489）對待測成份相對校正因子（fs/i）的影響。結(jié)果綠原酸、咖啡酸、黃芩苷的相對校正因子（fs/i）RSD 分別為 0.79%、0.76%、0.70%，表明不同色譜儀對3 種成份的相對校正因子（fs/i）無顯著影響。

考察不同型號色譜柱［Agilent Zorbax SBC18（150mm×4.6mm，5μm）、Syncronis C18（150mm×4.6mm，5μm）、YMC-C18（150mm×4.6mm，5μm）］對待測成份相對校正因子（fs/i）的影響。結(jié)果綠原酸、咖啡酸、黃芩苷的相對校正因子（fs/i）RSD 分別為1.20%、1.90%、1.50%，表明不同色譜柱對3 種成份的相對校正因子（fs/i）無顯著影響。

2.5 連翹苷對照品溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn)

取連翹苷（批號：110821-201816，純度95.1%）對照品溶液，分 別于0、1、2、3、4、5、6、7個(gè)月進(jìn)樣測定，測定連翹苷對照品的含量分別為99.98%、100.43%、101.58%、99.97%、98.96%、100.38%、100.30%、99.68%，RSD 為0.09%， 表明連翹苷對照品溶液在7 個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 樣品含量測定

精密吸取 5 個(gè)批次的雙黃連注射液供試品溶液各10μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。采用EMS［9］和QAMS 分別計(jì)算供試品中各待測成份的含量，詳見表8。EMS 和QAMS 所計(jì)算出的結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），表明QAMS 可用于雙黃連注射液中綠原酸、咖啡酸、黃芩苷、連翹苷的定量分析。

表8 4 種成份的含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

依據(jù)2020 年版《中國藥典》和紫外掃描測定結(jié)果可知，黃芩苷、連翹苷、綠原酸、咖啡酸分別在274、280、324、323nm 處有最大吸收，在同一波長處同時(shí)測定4 種成份具有難度。由于連翹苷的含量較低，且在324nm 處基本無吸收，因此確定連翹苷與黃芩苷的檢測波長為 280nm，并在檢測時(shí)增加進(jìn)樣量［5］；綠原酸類化合物和咖啡酸均含有咖啡酰結(jié)構(gòu)，在 324nm 處有最大吸收，故設(shè)定綠原酸和咖啡酸的檢測波長為324nm［6］。綜合考慮各峰高及峰面積的比例，選擇324nm 和280nm 為最終檢測波長，在線進(jìn)行波長切換檢測。

3.2 流動(dòng)相和洗脫梯度的選擇

試驗(yàn)中考察了乙腈-0.07%甲酸溶液［3］、0.6%冰醋酸水溶液-乙腈［10］、乙腈-0.2%甲酸［11］等不同流動(dòng)相以不同比例進(jìn)行成份洗脫，最終以乙腈-0.2%甲酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。該條件下樣品分析時(shí)間短（40min 內(nèi)即完成一針進(jìn)樣檢測），柱效高，色譜圖基線平穩(wěn)，峰形對稱，對照品出峰時(shí)間適中，主峰與其他峰的分離度、主峰的理論板數(shù)等色譜參數(shù)均符合2020 年版《中國藥典》的要求。

3.3 內(nèi)標(biāo)參照物的選擇

連翹苷不耐高溫，50℃以上會破壞連翹苷的結(jié)構(gòu)使其變性，但在室溫條件下穩(wěn)定性良好；溶液的酸堿度對連翹苷穩(wěn)定性影響顯著，pH 為7 時(shí)最穩(wěn)定；連翹苷的光穩(wěn)定性好［12］。本試驗(yàn)在7 個(gè)月內(nèi)連續(xù)8次測定同批號的連翹苷對照品，結(jié)果表明其穩(wěn)定性良好。

綜上，2015 年版《中國藥典》將QAMS 用于中藥提取物及中藥制劑的多指標(biāo)質(zhì)量控制。近年來在中藥材、中藥飲片及中藥制劑的質(zhì)量控制中，QAMS 的應(yīng)用范圍已由同類成份的測定擴(kuò)展至多類成份的測定［13］。本研究結(jié)果表明，QAMS 具有簡便可行、準(zhǔn)確、快速、重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)的特點(diǎn)，可有效降低質(zhì)控成本、提高質(zhì)控效率，可用于雙黃連注射液的質(zhì)量評價(jià)。