鄭 潔,程夢(mèng)華,欒 璐,孔培君,孫 波,蔣瑀霽,*

1 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國科學(xué)院南京土壤研究所), 南京 210008 2 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049 3 南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 南京 210023

根際微生物作為土壤生物群落中最活躍且具有決定性影響的組分之一,在土壤-植物生態(tài)系統(tǒng)中參與了土壤有機(jī)質(zhì)等養(yǎng)分循環(huán)和能量流動(dòng)。揭示植物—根際微生物根際對(duì)話過程及其調(diào)控機(jī)制,對(duì)促進(jìn)植物生長發(fā)育和生產(chǎn)力的提高至關(guān)重要[1—2]。氮是陸地生態(tài)系統(tǒng)中控制植物生長的關(guān)鍵限制營養(yǎng)元素,根際土壤微生物驅(qū)動(dòng)著土壤—植物系統(tǒng)中氮素循環(huán)過程,將氮素轉(zhuǎn)化為可被植物吸收的形態(tài),滿足植物的氮素需求。硝化作用是土壤氮素形態(tài)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵步驟之一,我國農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)硝化活性較高,以自養(yǎng)硝化作用為主[3—4]。作為自養(yǎng)硝化過程的氨氧化過程是第一和限速步驟,主要由含氨單加氧酶基因(amoA)的氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea, AOA)和氨氧化細(xì)菌(ammonia-oxidizing bacteria, AOB)共同驅(qū)動(dòng),在有氧環(huán)境下將氨氧化為亞硝酸鹽[5]。近年來,全程氨氧化微生物(Comammox)的發(fā)現(xiàn)使人們對(duì)氮循環(huán)有了全新的認(rèn)識(shí),但是深入研究發(fā)現(xiàn)Comammox大都來自銨貧瘠的生境,而在高底物濃度的農(nóng)田土壤硝化過程中典型的氨氧化微生物(AOA和AOB)扮演的角色并不能被Comammox所取代[6—7]。農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中,環(huán)境因子(pH、NH4濃度等)和農(nóng)田管理措施(種植方式、施肥管理等)決定著土壤中氨氧化微生物的生態(tài)位分異,影響群落的豐度和硝化潛勢(shì)[8]。研究表明低pH和低NH4濃度條件下,AOA在氨氧化過程中發(fā)揮著主導(dǎo)作用,而AOB則傾向于主導(dǎo)中性和堿性土壤,以及高NH4濃度環(huán)境的氨氧化過程[9—10,11]。Wu等[12]和Su等[13]研究發(fā)現(xiàn),不同的施肥管理方式會(huì)顯著影響AOA和AOB的群落結(jié)構(gòu)?？梢?研究AOA和AOB群落對(duì)農(nóng)田管理措施和環(huán)境因子的響應(yīng)機(jī)制一直是農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)研究的熱點(diǎn)問題,對(duì)深入認(rèn)識(shí)氮素轉(zhuǎn)化機(jī)制具有重要意義。

紅壤是中國南方地區(qū)的主要土壤類型,其分布地區(qū)氣候條件優(yōu)越。由于紅壤酸性強(qiáng),土質(zhì)粘重,脫硅富鐵鋁化現(xiàn)象嚴(yán)重,導(dǎo)致土壤氮素供應(yīng)失衡[11]。與此同時(shí),農(nóng)田過度施用氮肥,加劇土壤酸化,導(dǎo)致氮素轉(zhuǎn)化功能微生物豐度和代謝活性下降,降低了作物生產(chǎn)力和氮素養(yǎng)分利用率,同時(shí)還會(huì)對(duì)環(huán)境造成負(fù)擔(dān)[14]。研究表明,秸稈還田是培肥地力,改良土壤性狀的有效途徑之一。作為土壤養(yǎng)分和有機(jī)物質(zhì)的重要來源,秸稈分解刺激了土壤微生物的活性,通過提高土壤氮素有效性加速氮素循環(huán),促進(jìn)作物生長發(fā)育[15]。但是秸稈還田存在腐解慢、與作物爭(zhēng)氮和土壤疏松等不利因素,導(dǎo)致作物出苗困難、誘發(fā)病蟲害等問題[16]。因此,揭示秸稈還田的高效激發(fā)效應(yīng),對(duì)建立貧瘠紅壤快速培肥的調(diào)控技術(shù)具有重要的實(shí)踐價(jià)值。

Tosti等發(fā)現(xiàn)秸稈豬糞配施通過調(diào)節(jié)秸稈中的碳氮比可以加快微生物的礦化作用,顯著提高有機(jī)氮的礦化與礦質(zhì)氮的微生物固持,進(jìn)而增加作物產(chǎn)量[17]。Yu等發(fā)現(xiàn)秸稈生物炭可以增加微孔生境的可用性,提高微生物生物量和多樣性[18]。不同秸稈還田方式對(duì)培育土壤肥力、增強(qiáng)功能微生物活性具有重要影響,但目前關(guān)于秸稈還田處理對(duì)根際氨氧化微生物群落和功能的影響機(jī)制尚不明確。為此,本研究以南方典型旱地紅壤為研究對(duì)象,依托秸稈還田長期定位試驗(yàn)(9年),通過Illumina高通量測(cè)序技術(shù),研究不同秸稈還田處理對(duì)玉米根際氨氧化微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)、以及硝化潛勢(shì)的影響,旨在揭示不同秸稈還田處理對(duì)根際氮轉(zhuǎn)化微生物調(diào)控機(jī)制,以期為建立科學(xué)高效的秸稈還田措施、提高氮肥利用率提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

田間試驗(yàn)于2010年設(shè)置在江西省鷹潭市中國科學(xué)院紅壤生態(tài)實(shí)驗(yàn)站(116°55E,28°13N),屬中亞熱帶季風(fēng)氣候,年平均氣溫17.8℃,年降水量約為1795 mm,其土壤為第四紀(jì)紅黏土發(fā)育的紅壤(黏化濕潤富鐵鋁土)。田間試驗(yàn)小區(qū)面積為100 m2(5 m×20 m)。土壤酸性較強(qiáng)、有機(jī)質(zhì)低。試驗(yàn)地開始前表層土壤(0—20 cm)的基本理化性質(zhì)為：pH 4.73,有機(jī)碳2.52 g/kg,全氮0.40 g/kg,全磷0.23 g/kg,堿解氮38.30 mg/kg,全鉀11.95 g/kg,速效磷0.76 mg/kg,速效鉀47.58 mg/kg,陽離子交換量12.12 cmol/kg。

1.2 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)置5個(gè)處理,分別為：不施肥(CK)；氮磷鉀肥(NPK)；氮磷鉀肥+秸稈(NPKS)；氮磷鉀化肥+秸稈豬糞配施(秸稈豬糞按9∶1的碳配比施用,NPKSM)；氮磷鉀肥+秸稈生物炭(NPKB)。試驗(yàn)供試作物為玉米(ZeamaysL.,蘇玉24),每年4月份種植,7月份收獲。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù),隨機(jī)區(qū)組排列。秸稈生物炭是利用風(fēng)干玉米秸稈在生物炭爐中450 ℃下通過厭氧悶燒制成。不同秸稈還田處理(NPKS、NPKSM、NPKB)每年的碳輸入量為1000 kg/hm2,各處理的化肥的施入量為：尿素(N, 150 kg/hm2),鈣鎂磷肥(P2O5, 75 kg/hm2),無機(jī)鉀肥(K2O, 60 kg/hm2),所有氮磷鉀肥、秸稈、豬糞和生物炭在玉米種植前一次性施入土壤并翻耕混勻。

1.3 樣品采集與土壤性質(zhì)測(cè)定

1.4 高通量測(cè)序與熒光定量PCR分析

采用MoBio PowerSoil DNA(MIBIO laboratories Inc.,Carsbad,USA)試劑盒提取土壤樣品DNA。通過NanoDrop?ND- 2000檢測(cè)DNA濃度質(zhì)量,然后進(jìn)行1.2%(w/v)的瓊脂糖凝膠電泳,檢測(cè)DNA片段大小。AOA的擴(kuò)增引物為Arch-amoA26F(5′-GACTACATATTCTACACWGACTGGGC- 3′)和Arch-amoA417R(5′-GGTGTCATATATGGAGGCAACGTTGG- 3′)；AOB的擴(kuò)增引物為amoA- 1F(5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT- 3′)和amoA- 2R(5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC- 3′)。PCR反應(yīng)體系為20 μL：2×SYBR Premix 10 μL,0.8 μL上下引物,1 μL DNA模板,加ddH2O補(bǔ)足。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性2 min,94℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72℃延伸30 s,72℃終末延伸10 min,循環(huán)30次。PCR產(chǎn)物純化回收后制備測(cè)序文庫,通過Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。生物信息學(xué)分析采用Mothur軟件包對(duì)原始序列進(jìn)行質(zhì)量篩選,對(duì)保留的序列進(jìn)行修剪。選擇與barcode完全匹配的序列,將其分配到古菌和細(xì)菌的amoA基因的單獨(dú)文件中。使用FrameBot工具進(jìn)一步進(jìn)行篩選后,采用RDP中FunGene數(shù)據(jù)庫對(duì)AOA和AOB的amoA進(jìn)行相似度檢索。最后,對(duì)每個(gè)樣本的序列讀數(shù)進(jìn)行聚類,使用CD-HIT-EST得出基于97%相似度的OTU[20]。

AOA和AOB的amoA基因拷貝數(shù)用熒光定量法測(cè)定,反應(yīng)在ABI StepOne TM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行。所用引物與上述相同,反應(yīng)體系為：2×SYBR?Premix Ex Taq 10 μL,上下引物各0.5 μL,DNA模板1 μL,最后用ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性1 min,94℃變性45 s,57℃退火45 s,72℃延伸45 s,72℃終末延伸10 min,重復(fù)循環(huán)40次。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù),并設(shè)3個(gè)用無菌水作為空白對(duì)照。

1.5 氨氧化微生物功能的測(cè)定

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用Chao 1指數(shù)表征豐富度,以Shannon指數(shù)表征多樣性。采用主坐標(biāo)分析(principal co-ordinates analysis,PCoA)計(jì)算兩兩樣本間Bray-Curtis距離,研究樣本群落組成的差異性。相關(guān)性分析和方差分析等在SPSS 24.0中完成,不同處理之間利用Tukey法進(jìn)行單因素方差分析,不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。多元分析統(tǒng)計(jì)在Rstudio軟件中完成,其中微生物多樣性、主坐標(biāo)分析(PCoA)和相似性分析(ANOSIM)通過vegan包完成。隨機(jī)森林分析通過randomForest程序包計(jì)算,并通過rfUtilities和rfPermute程序包分別檢驗(yàn)?zāi)Ｐ秃兔總€(gè)變量的P值。結(jié)構(gòu)方程模型(SEM)在AMOS 23.0軟件中分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同秸稈還田處理的土壤理化性質(zhì)和硝化潛勢(shì)

圖1 不同秸稈還田處理的土壤硝化潛勢(shì) Fig.1 Potential nitrification activity under treatments with straw returning誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)誤；不同小寫字母表示PNAAOA和PNAAOB分別在各個(gè)處理間的差異顯著性(P<0.05);CK：不施肥；NPK：氮磷鉀肥；NPKS：氮磷鉀肥+秸稈；NPKSM：氮磷鉀肥+秸稈豬糞配施；NPKB：氮磷鉀肥+秸稈生物炭AOA:氨氮氧化古菌; AOB:氨氧化細(xì)胞

表1 不同秸稈還田處理的土壤理化性質(zhì)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Table 1 Soil physic-chemical properties under different straw returning treatments(Mean±SE)

2.2 不同秸稈還田處理的氨氧化微生物amoA基因豐度

通過熒光定量PCR對(duì)不同秸稈還田處理下土壤AOA和AOB的amoA基因拷貝數(shù)進(jìn)行分析,結(jié)果表明,所有處理中AOA的amoA基因的平均拷貝數(shù)(2.6×106拷貝/g)顯著高于AOB(2.73×104拷貝/g)(P<0.05,圖2)。AOA的amoA基因拷貝數(shù)介于0.31×105—7.16×106拷貝/g,與NPK處理比較發(fā)現(xiàn),NPKS、NPKSM和NPKB處理下AOA的amoA基因拷貝數(shù)分別增加了4.88、9.64和1.93倍。AOB的amoA基因拷貝數(shù)介于0.26×104—4.93×104拷貝/g之間,NPKS、NPKSM和NPKB處理下AOB的amoA基因拷貝數(shù)分別比NPK處理增加了4.36、3.93和5.42倍。NPKSM處理下AOA的amoA基因拷貝數(shù)最高,而NPKB處理下AOB的amoA基因拷貝數(shù)最高。

圖2 不同秸稈還田處理的AOA和AOB的amoA基因豐度Fig.2 The amoA gene abundance of AOA and AOB under treatments with straw returning不同小寫字母表示各處理間差異顯著(P<0.0)

2.3 不同秸稈還田處理的氨氧化微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)特征

不同秸稈還田處理的AOA和AOB群落多樣性的Shannon和Chao1指數(shù)在各處理間均顯著改變(P<0.05,圖3)。與CK處理相比,NPK處理提高了AOA的Shannon和Chao1指數(shù),但降低了AOB的Shannon和Chao1指數(shù)。與CK和NPK處理相比,NPKS、NPKSM和NPKB處理的AOA和AOB的群落多樣性指數(shù)均顯著增加(P<0.05),在AOA群落中,NPKB處理的Shannon指數(shù)最高,NPKS處理的Chao1指數(shù)最高；在AOB群落中NPKS處理的Shannon指數(shù)最高,NPKSM的Chao1指數(shù)最高。

圖3 不同秸稈還田處理的AOA和AOB群落的Shannon指數(shù)與Chao 1指數(shù)Fig.3 The Shannon indices and Chao 1 richness of AOA and AOB under treatments with straw returning

不同秸稈還田處理的AOA群落主要由Nitrosotalea(70.8%)、Nitrososphaera(25.1%)和Nitrosopumilus(0.24%)組成(圖4),系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明NitrosotaleaCluster 1.1的相對(duì)豐度占70.8%,NitrososphaeraCluster 9的相對(duì)豐度占12.3%,其余主要由NitrososphaeraCluster 1.1(4.5%)、NitrososphaeraCluster 2(3.9%)和NitrososphaeraCluster 7.2(3.1%)組成,其中NitrosotaleaCluster 1.1的相對(duì)豐度在CK處理中最高(90.1%),NitrososphaeraCluster 2在NPKSM處理中相對(duì)豐度最高(8.5%),NitrososphaeraCluster 9在NPKB處理中的相對(duì)豐度最高(37.1%)。AOB群落主要由Nitrosospira組成,其中NitrosospiraCluster 9的豐度占61.9%,NitrosospiraCluster 3a豐度占18.3%,其余主要由NitrosospiraCluster 10(6.8%)、NitrosospiraCluster 3b(3.86%)、NitrosospiraCluster 9(1.9%)等組成,NitrosospiraCluster 9在CK處理中豐度最高(7.9%),NitrosospiraCluster 12在NPK處理中豐度最高(85.8%),NitrososphaeraCluster 3a在NPKSM處理中豐度最高(36.1%),NitrosospiraCluster 10在NPKB處理中豐度最高(21.3%)。主坐標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)(PCoA),PCoA1軸和PCoA2軸分別解釋了AOA群落結(jié)構(gòu)45.27%和22.63%的差異,解釋了AOB群落結(jié)構(gòu)44.49%和27.82%的差異(圖4)。不同秸稈還田處理下AOA和AOB群落結(jié)構(gòu)在PCoA1軸和PCoA2軸上明顯分異,ANOSIM分析表明不同秸稈還田處理下AOA(r=0.752,P<0.01)和AOB(r=0.834,P<0.01)群落結(jié)構(gòu)的組間差異顯著大于組內(nèi)差異。

圖4 不同秸稈還田處理的AOA和AOB群落組成和結(jié)構(gòu)Fig.4 The composition and structure of AOA and AOB under different straw returning treatments

2.4 土壤氨氧化微生物群落與理化性質(zhì)、硝化潛勢(shì)的關(guān)系

圖5 土壤AOA和AOB群落與理化性質(zhì)、硝化潛勢(shì)的Pearson相關(guān)系數(shù)Fig.5 Pearson correlation coefficients between soil properties, PNA and AOA and AOB communityamoA基因的拷貝數(shù)代表群落豐度(Abundance)；第一主坐標(biāo)值(PCoA1)代表群落組成(Composition)；PNAAOA代表AOA群落的硝化潛勢(shì)；PNAAOB代表AOB群落的硝化潛勢(shì),PNAAOA/AOB表示在AOA熱圖中是PNAAOA,而在AOB熱圖中是PNAAOB;*：P<0.05,**：P<0.01

圖6 隨機(jī)森林分析生物因子和非生物因子對(duì)土壤硝化潛勢(shì)(PNAtotal)的平均預(yù)測(cè)重要性；土壤硝化潛勢(shì)(PNAtotal)影響因子的結(jié)構(gòu)方程模型Fig.6 Mean predictor importance (% of increased mean square error, MSE) of abiotic and biotic factors on PNAtotal based on random forest analysis; Structural equation modelling (SEM) to predict the influence factors of PNAtotal *： P<0.05,**： P < 0.01,***： P < 0.001;單項(xiàng)箭頭表示數(shù)據(jù)之間的因果關(guān)系,箭頭上的數(shù)字表示標(biāo)準(zhǔn)化的路徑系數(shù),連線的粗細(xì)和路徑系數(shù)呈比例縮放。實(shí)線表示正相關(guān),虛線表示負(fù)相關(guān);Abundance: amoA基因的拷貝數(shù),Diversity：群落的Chao 1指數(shù), PNAtotal：AOA與AOB的總硝化潛勢(shì)

3 討論

3.1 不同秸稈還田處理對(duì)土壤理化性質(zhì)和硝化潛勢(shì)的影響

3.2 不同秸稈還田處理對(duì)根際氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響

3.3 不同秸稈還田處理對(duì)根際氨氧化微生物群落功能的影響

4 結(jié)論