張丹丹， 張?jiān)獞c*， 梁 圓， 程 景， 王棟才， 李 博， 孫銳鋒， 靳 光， 徐 芳

(1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院， 山西 太原 030032； 2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 山西 太原 030031)

節(jié)糧型畜牧業(yè)，是指充分利用牧草、農(nóng)副產(chǎn)品、輕工副產(chǎn)品等非糧飼料資源，在減少糧食消耗的同時(shí)達(dá)到高效畜產(chǎn)品產(chǎn)出的畜牧產(chǎn)業(yè)，主要包括奶牛、肉牛、肉羊、絨毛羊、兔和鵝等。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部印發(fā)的《全國節(jié)糧型畜牧業(yè)發(fā)展規(guī)劃(2011—2020年)》中提到，發(fā)展節(jié)糧型畜牧業(yè)是保障畜產(chǎn)品有效供給、緩解糧食供求矛盾、豐富居民膳食結(jié)構(gòu)的重要途徑[1]。我國非糧飼料資源主要有農(nóng)作物副產(chǎn)物類(秸稈類、非主食的莖葉)、糟渣類、餅粕類、林業(yè)副產(chǎn)品類和其他飼草料資源[2]。加大對(duì)非糧飼料資源的開發(fā)利用研究，是草食畜牧業(yè)發(fā)展的重要方向，也是緩解我國肉牛飼料資源不足、提高養(yǎng)殖效益的有效途徑，對(duì)于促進(jìn)飼料業(yè)和畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[3]。

構(gòu)樹(Broussonetiapapyrifera)粗蛋白含量(29.41% DM)較高(苜蓿18.3% DM)[4]，是目前極具開發(fā)價(jià)值的蛋白飼料資源之一。且也因其營養(yǎng)價(jià)值高(中性洗滌纖維42.94% DM，水溶性碳水化合物7.98% DM)[4]，具有抗氧化等生物活性成分，如香豆素、木酚素、1,3-二苯基丙烷、查爾酮、黃酮或黃酮醇等[5]，被廣泛研究。有研究證明構(gòu)樹青貯可以作為新型飼料資源用于畜牧生產(chǎn)中，低蛋白質(zhì)飼糧中添加10%構(gòu)樹全株發(fā)酵飼料可提高育肥豬肌肉中游離氨基酸和肌內(nèi)脂肪含量，改善肉的風(fēng)味和營養(yǎng)價(jià)值[6]。日糧中添加15%構(gòu)樹青貯可以提高肉牛生長性能以及抗氧化性能，通過降低肉質(zhì)pH提高多不飽和脂肪酸進(jìn)而改善肉質(zhì)[7]。10%～15%的構(gòu)樹青貯能夠提高奶牛的免疫和抗氧化能力，以及牛奶中的多不飽和脂肪酸[8]。為促進(jìn)構(gòu)樹作為反芻動(dòng)物飼料利用，孔凡林等[9]比較了構(gòu)樹不同部位的瘤胃降解特性，其中，構(gòu)樹葉可以作為蛋白質(zhì)飼料資源利用，去葉枝條和全株構(gòu)樹可作為優(yōu)質(zhì)粗飼料利用。

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)不同精粗比的日糧，研究以全株玉米青貯為主要粗飼料的日糧中添加不同比例的全株構(gòu)樹對(duì)晉南牛瘤胃發(fā)酵性能的影響，通過主成分分析綜合評(píng)價(jià)組合效應(yīng)，篩選適宜組合比例。一方面為構(gòu)樹在肉牛飼料中的利用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，推動(dòng)非糧飼料資源的開發(fā)利用，另一方面促進(jìn)晉南牛的優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)技術(shù)研究，為緩解中國因牛肉產(chǎn)量不足產(chǎn)生的供需矛盾提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

全株野生構(gòu)樹采自山西省平遙縣，全株玉米青貯和精料取自山西省和順縣大友牛場，65℃烘干后，粉碎制成風(fēng)干試樣。精料配方及構(gòu)樹、全株玉米青貯常規(guī)營養(yǎng)成分見表1，表2。

表1 構(gòu)樹、全株玉米青貯和精料常規(guī)營養(yǎng)成分(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Nutrient levels of Broussonetia papyrifera,whole plant corn silage and Concentrate (Air dry base)

表2 精料組成表(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 2 Composition of concentrate (Air dry base)

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以精粗比40∶60,50∶50,60∶40，設(shè)置15個(gè)混合飼料，每個(gè)處理中精料、構(gòu)樹和全株玉米青貯比例見表3。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，通過體外模擬瘤胃發(fā)酵試驗(yàn)評(píng)價(jià)各組合的瘤胃發(fā)酵性能。

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 3 Experimental design

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1瘤胃液采集 晨飼前利用瘤胃瘺管從2頭晉南牛瘤胃中采集瘤胃液1 000 mL，混勻后，用4層紗布過濾，置于39℃水浴中保存，并持續(xù)充入CO2以確保瘤胃液處于厭氧環(huán)境。

1.3.2體外發(fā)酵試驗(yàn) 按照Menke等[12]介紹的方法配制緩沖液后，持續(xù)通入CO2并預(yù)熱至39℃。將采集的晉南牛瘤胃液與緩沖液以1∶2的比例混合后制成人工瘤胃培養(yǎng)液。準(zhǔn)確稱量0.22 g發(fā)酵底物，加入30 mL人工瘤胃培養(yǎng)液后，在水浴恒溫?fù)u床中反應(yīng)72 h后，終止發(fā)酵。將培養(yǎng)管中發(fā)酵液離心(4℃，5 400 r·min-1，15 min)，所得上清液于-80℃保存，用于揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)、氨態(tài)氮(NH3-N)以及微生物蛋白(microbial protein，MCP)等指標(biāo)測定。多次清洗殘?jiān)?，烘干，測定體外干物質(zhì)降解率(in vitro dry matter degradation rate，IVDMD)。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1產(chǎn)氣量(gas production，GP)的測定 記錄72 h產(chǎn)氣量，按下式計(jì)算：

GPt=(Vt樣-V0樣)-(Vt空-V0空)

式中：GPt，樣品在t時(shí)刻的產(chǎn)氣量(mL)；Vt樣，t時(shí)刻樣品培養(yǎng)管的刻度；V0樣，開始發(fā)酵時(shí)樣品培養(yǎng)管刻度；Vt空，t時(shí)刻空白管的刻度；V0空，開始發(fā)酵時(shí)空白管的刻度。

1.4.2發(fā)酵液pH測定 用便攜式pH計(jì)(雷磁S-25，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)測定終止發(fā)酵的體外發(fā)酵液的pH值。

1.4.3發(fā)酵液氨態(tài)氮(NH3-N)測定 將發(fā)酵液解凍后，利用次氯酸鈉法在630 nm波長處比色(T2602分光光度計(jì)，上海)測定氨態(tài)氮[13]。

1.4.4發(fā)酵液微生物蛋白(MCP)測定 考馬斯亮藍(lán)法測定瘤胃液中的微生物蛋白，在波長595 nm處比色(T2602分光光度計(jì)，上海)[14]。

1.4.5發(fā)酵液揮發(fā)性脂肪酸(VFA)測定 用氣相色譜儀(Aglient 7890A，美國)測定乙酸(acetate，AA)、丙酸(propionate，PA)、丁酸(butyrate，BA)、異丁酸(isobutyrate，IBA)、戊酸(valerate，VA)和異戊酸(isovalerate，IVA)，TVFA=AA+PA+BA+IBA+VA+IVA。以2-乙基丁酸(2EB)作為內(nèi)標(biāo)物。

1.4.6體外干物質(zhì)降解率(IVDMD)的測定 IVDMD=100%×[發(fā)酵底物干物質(zhì)含量-(樣品殘?jiān)晌镔|(zhì)含量-空白管殘?jiān)晌镔|(zhì)含量)]/發(fā)酵底物干物質(zhì)含量

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

用Excel 2016整理數(shù)據(jù)，采用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)選取的13個(gè)與瘤胃發(fā)酵性能相關(guān)的指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan’s進(jìn)行多重比較。P<0.05為差異顯著，P≥0.05為差異不顯著。對(duì)13個(gè)瘤胃發(fā)酵指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析和主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同精粗比日糧中構(gòu)樹比例對(duì)體外發(fā)酵指標(biāo)的影響

由表4可知，精粗比40∶60時(shí)，GP72和IVDMD均表現(xiàn)出相同趨勢，以40∶0∶60組顯著高于其他各組(P<0.05)，NH3-N則為40∶60∶0和40∶45∶15組較高，兩組間差異不顯著(P>0.05)。精粗比50∶50時(shí)，50∶0∶50，50∶12.5∶37.5和50∶25∶25組的GP72較高，且各組間差異不顯著(P>0.05)，50∶50∶0組的IVDMD顯著低于其他各組(P<0.05)，50∶25∶25組的NH3-N含量最高，與50∶50∶0和50∶37.5∶12.5組差異不顯著(P>0.05)。精粗比60∶40時(shí)，60∶0∶40組的GP72顯著高于其他各組(P<0.05)。

表4 不同精粗比日糧中構(gòu)樹比例對(duì)體外發(fā)酵指標(biāo)的影響Table 4 Effects of BP levels in diet with different concentrate to forage ratio on in vitro fermentation parameters

2.2 不同精粗比日糧中構(gòu)樹比例對(duì)體外發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸的影響

由表5可知，當(dāng)精粗比為40∶60時(shí)，乙酸、異丁酸、異戊酸、戊酸和TVFA的濃度隨著構(gòu)樹比例降低呈降低的趨勢(P<0.05)。精粗比50∶50時(shí)，50∶50∶0和50∶25∶25組的異丁酸濃度顯著高于50∶37.5∶12.5和50∶12.5∶37.5組(P<0.05)，與50∶0∶50組差異不顯著(P>0.05)。50∶0∶50組丁酸的濃度顯著高于其他各組(P<0.05)，戊酸濃度則以50∶50∶0和50∶25∶25組顯著高于其他各組(P<0.05)。精粗比60∶40時(shí)，60∶10∶30組的乙酸、丙酸和TVFA濃度顯著高于其他各組(P<0.05)。

2.3 不同組合飼料各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性分析

對(duì)15個(gè)組合的13個(gè)瘤胃發(fā)酵指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析(表6)。有20對(duì)指標(biāo)間呈極顯著相關(guān)(P<0.01)，18對(duì)指標(biāo)呈顯著相關(guān)(P<0.05)。GP72與丁酸濃度呈顯著的相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)為0.462。IVDMD與乙酸、丁酸、異戊酸、戊酸、TVFA、乙丙比呈顯著的正相關(guān)(P<0.05)，與異丁酸呈極顯著相關(guān)(P<0.01)。在所有指標(biāo)中，乙酸與TVFA的相關(guān)系數(shù)最大，為0.993(P<0.01)，其次為丙酸與TVFA的相關(guān)系數(shù)，為0.901(P<0.01)。

2.4 主成分分析不同精粗比日糧中全株玉米青貯與構(gòu)樹的組合效應(yīng)

將特征值≥1作為判別條件，可提取3項(xiàng)主成分因子(表7)。主成分1的特征值為6.119，貢獻(xiàn)率為47.068%；主成分2的特征值為2.968，貢獻(xiàn)率為22.834%；主成分3的特征值為1.274，貢獻(xiàn)率為9.802%。前3個(gè)主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)79.704%，具有較好的代表性，可用于評(píng)價(jià)不同飼料組合的瘤胃發(fā)酵性能。

表5 不同精粗比日糧中構(gòu)樹比例對(duì)體外發(fā)酵揮發(fā)性脂肪酸的影響Table 5 Effects of BP levels in diet with different concentrate to forage ratio on VFA content in vitro fermentation

表6 飼料組合的各項(xiàng)指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)Table 6 Correlation analysis of various indicators of combination

表7 各指標(biāo)系數(shù)及貢獻(xiàn)率Table 7 Coefficients and proportion rates of various comprehensive indicators

本研究選取了前3個(gè)主成分，將得到的特征向量與標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)相乘，然后就可以得出主成分表達(dá)式。依據(jù)主成分所對(duì)應(yīng)的特征值占所提取主成分總的特征值之和的比例作為權(quán)重得出主成分綜合模型：

F=-0.0894p1+0.2117p2+0.0193p3+0.2218p4+0.1435p5+0.1710p6+0.0928p7+0.2421p8+0.1240p9+0.2477p10+0.2691p11+0.1704p12+0.2107p13。

將標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)代入，可以得出根據(jù)主成分綜合模型計(jì)算出的綜合主成分值，并對(duì)其按綜合主成分值進(jìn)行排序。各組合的標(biāo)準(zhǔn)化主成分值、組合效果的綜合值(F值)及排序見表8。在15個(gè)組合中，精料∶構(gòu)樹∶全株玉米青貯比例為60∶10∶30，組合效果最佳。

表8 標(biāo)準(zhǔn)化主成分值及組合效果評(píng)價(jià)排序Table 8 Standard values of principal component and evaluated ranking of combination

3 討論

3.1 不同精粗比日糧中構(gòu)樹比例對(duì)體外發(fā)酵指標(biāo)的影響

構(gòu)樹，桑科落葉喬木，具有適應(yīng)性強(qiáng)，生長快，生物產(chǎn)量高的優(yōu)勢，目前已經(jīng)作為一種新型的飼料資源而被廣泛種植。構(gòu)樹不僅富含粗蛋白及高度易消化的纖維和礦物質(zhì)，另外其含有的多種生物活性成分能提高反芻動(dòng)物的抗氧化和抗炎癥的能力，這些優(yōu)點(diǎn)使得構(gòu)樹應(yīng)用于畜禽飼料中有很大的發(fā)展?jié)摿?。Li等[15]用構(gòu)樹代替部分苜蓿制作青貯，減少了青貯過程中的氮損失。張生偉等[16-17]在飼料中利用青貯雜交構(gòu)樹替代部分豆粕可提高杜湖雜交肉羊的增重和免疫力，改善肉品質(zhì)。構(gòu)樹的樹葉、莖稈的抗氧化物質(zhì)含量較高，且灌木和喬木的總抗氧化能力要高于精料、牧草和干草，飼料中補(bǔ)充構(gòu)樹可以促進(jìn)肉牛提高抗氧化能力[18-19]，可以考慮在日糧中補(bǔ)充構(gòu)樹緩解飼料短缺的問題。

本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了不同精粗比的日糧，研究以全株玉米青貯為主要粗飼料的日糧中添加不同比例的全株構(gòu)樹對(duì)晉南牛瘤胃發(fā)酵性能的影響。體外常用來評(píng)價(jià)瘤胃發(fā)酵性能的指標(biāo)有產(chǎn)氣量、體外干物質(zhì)降解率、氨態(tài)氮、揮發(fā)性脂肪酸等。產(chǎn)氣量的差異很大程度上取決于日糧的化學(xué)成分、降解速率和程度。日糧經(jīng)過發(fā)酵后產(chǎn)生氣體主要由于日糧中的可發(fā)酵成分在微生物的作用下生成揮發(fā)性脂肪酸的同時(shí)產(chǎn)生甲烷和二氧化碳等，所以日糧中成分的差異會(huì)導(dǎo)致氣體產(chǎn)生量的不同。與碳水化合物發(fā)酵相比，蛋白質(zhì)和脂肪發(fā)酵產(chǎn)生的氣體產(chǎn)量相對(duì)較少。本研究中構(gòu)樹比例提高了日糧中的蛋白比例，相應(yīng)的產(chǎn)氣量呈降低的趨勢；日糧的精粗比增加，日糧中快速發(fā)酵的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物增加，瘤胃微生物活力增強(qiáng)，導(dǎo)致產(chǎn)氣量改變[14,20]。IVDMD通常會(huì)被用來衡量日糧營養(yǎng)價(jià)值，Unnawong[21]認(rèn)為日糧蛋白水平與日糧的降解率呈正相關(guān)，Silva等[22]則認(rèn)為日糧中的蛋白水平對(duì)營養(yǎng)成分降解率影響不大，主要是蛋白組成的影響。本研究中構(gòu)樹比例的增加，并未增加日糧的IVDMD。分析原因，日糧中蛋白比例增加，碳水化合物比例減少，碳氮比降低，瘤胃微生物增殖需要的碳源受到限制，導(dǎo)致IVDMD降低。

pH是反映瘤胃發(fā)酵水平的綜合性指標(biāo)之一，pH過高過低都會(huì)影響瘤胃的發(fā)酵性能。瘤胃液pH的變化與發(fā)酵日糧中營養(yǎng)成分以及組成比例有關(guān)，不同日糧配方導(dǎo)致的pH變化范圍在5.6～7.5[23]，一般常用瘤胃液pH的變化來評(píng)價(jià)瘤胃內(nèi)部環(huán)境及瘤胃微生物區(qū)系。本試驗(yàn)中，日糧精粗比和構(gòu)樹比例對(duì)體外發(fā)酵液的pH影響不顯著，均保持在5.98～6.12，略低于Wang和曾鈺等[23-24]的研究結(jié)果(6.60～6.62和6.16～6.31)，但均處在瘤胃正常發(fā)酵所需的pH范圍內(nèi)(5.5～7.0)[25]。隨著精粗比增加，非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量增加，產(chǎn)生的VFA和乳酸增加，導(dǎo)致pH降低，但是由于體外發(fā)酵裝置的密閉系統(tǒng)，瘤胃pH低于6.2時(shí)抑制了對(duì)酸堿度敏感的纖維分解菌的生長繁殖，所以對(duì)于纖維素降解能力下降，各組間pH變化不大[25]。

瘤胃內(nèi)的NH3-N主要是微生物降解日糧蛋白質(zhì)和內(nèi)源含氮物質(zhì)的產(chǎn)物，一部分用于合成MCP，一部分溶解在發(fā)酵液中。隨著構(gòu)樹比例增加，NH3-N濃度顯著提高，各組的NH3-N濃度變化范圍24.51～34.00 mg·100 mL-1，滿足瘤胃微生物生長的最佳濃度(15～30 mg·100 mL-1)[26]，同時(shí)也能提供合成MCP所需的NH3-N(5～30 mg·100 mL-1)[20]，全株玉米青貯比例大的組，其可溶性碳水化合物比例也高，能夠促進(jìn)微生物生長，瘤胃微生物利用氮合成MCP增加，導(dǎo)致NH3-N濃度降低[27]，本研究中微生物蛋白含量差異不顯著，但基本符合這個(gè)規(guī)律。

VFA主要來源于瘤胃微生物對(duì)日糧碳水化合物的降解，一般可以用來是反映瘤胃微生物的活性，有維持瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定以及為動(dòng)物機(jī)體提供能量等作用[28]。VFA濃度受到NDF和ADF降解率的影響，因?yàn)榱鑫肝⑸锝到饫w維主要產(chǎn)生VFA[27]，在各精粗比日糧中，都表現(xiàn)出構(gòu)樹比例為100組的乙酸和TVFA濃度較高，但是干物質(zhì)降解率較低，與Castro M等[29]研究結(jié)果TVFA的含量與日糧的DM降解率正相關(guān)相反，這個(gè)可能與構(gòu)樹纖維含量有關(guān)系。VFA的積累可以抑制引起破壞的微生物的生長，構(gòu)樹比例增加有提高乙酸比例的趨勢，表明添加構(gòu)樹趨使瘤胃發(fā)酵模式向乙酸型發(fā)酵模式變化，這可能是因?yàn)楸敬嗡杉癁橐吧鷺?gòu)樹，其纖維含量相對(duì)要高[30]，相對(duì)來說，野生構(gòu)樹更合適作為粗飼料應(yīng)用于肉牛養(yǎng)殖中。隨著精粗比增加，組合的乙酸、丙酸比例都呈顯著增加，這與通常的研究結(jié)果不一致，這可能與精粗比和粗飼料比例對(duì)乙酸、丙酸有極顯著的互作效應(yīng)有關(guān)。楊艷等[31]結(jié)果表明隨著發(fā)酵底物精料比例的增加，乙酸含量降低，而丙酸、丁酸、總VFA含量升高。但也有研究結(jié)果為高精料日糧乙酸和丙酸都略高于高粗料飼糧[32-33]。

3.3 主成分分析精料、構(gòu)樹和全株玉米青貯的組合效應(yīng)

對(duì)于飼料的瘤胃發(fā)酵性能，一般我們會(huì)用產(chǎn)氣量、體外干物質(zhì)降解率以及揮發(fā)性脂肪酸等來評(píng)價(jià)。本研究選取了13個(gè)指標(biāo)，對(duì)15個(gè)不同比例的精料、構(gòu)樹和全株玉米青貯組合進(jìn)行了瘤胃發(fā)酵性能評(píng)價(jià)。通過相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)有20對(duì)指標(biāo)呈極顯著相關(guān)(P<0.01)，有研究表明，各指標(biāo)間呈高度相關(guān)會(huì)造成不同指標(biāo)所反映結(jié)果因?yàn)橹貜?fù)而導(dǎo)致結(jié)果的不準(zhǔn)確。利用主成分分析將多個(gè)復(fù)雜的單項(xiàng)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為幾個(gè)綜合指標(biāo)，可以確保在原有信息不損失的前提下降低了單一指標(biāo)的片面性，提高評(píng)價(jià)的準(zhǔn)確性[34]。主成分分析結(jié)果為精料∶構(gòu)樹∶全株玉米青貯比例60∶10∶30，符合實(shí)際生產(chǎn)中肉牛育肥中后期日糧能量水平提高。

4 結(jié)論

構(gòu)樹蛋白含量相對(duì)較高，在本試驗(yàn)條件下，日糧中添加構(gòu)樹可以改善肉牛瘤胃發(fā)酵性能。利用主成分分析，精料∶構(gòu)樹∶全株玉米青貯比例為60∶10∶30，組合效果最佳。生產(chǎn)中可以考慮將構(gòu)樹作為晉南牛的粗飼料來源，但適宜的添加比例仍需動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。