仝松利，崔發(fā)財

(1.伊川縣人民醫(yī)院檢驗科，河南 洛陽 471300；2.河南省人民醫(yī)院檢驗科，河南 鄭州 450003)

結(jié)直腸癌(CRC)是一種常見的消化道惡性腫瘤，近年來隨著人們飲食模式和生活方式的改變我國CRC發(fā)病率呈逐年上升趨勢，資料顯示，2015年中國CRC新發(fā)病例38.76萬例，居發(fā)病瘤譜的第4位，新增死亡病例18.71萬例，居死亡瘤譜的第5位，這給人們的生命健康造成了嚴(yán)重威脅[1-2]，因此迫切需要尋找理想的生物標(biāo)志物用于CRC的早期診斷、治療和預(yù)后評估。MiRNAs是一類長度19～25 nt的內(nèi)源性非編碼調(diào)控RNA，可通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄后水平靶基因的表達(dá)參與多種生理病理過程[3]。越來越多的研究表明，miRNA表達(dá)異常與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，由腫瘤組織釋放進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的miRNA能與RNA結(jié)合蛋白緊密結(jié)合而不易被降解，且能通過常規(guī)手段檢測[4-6]。因此循環(huán)miRNA檢測正在成為一種潛在的CRC診斷標(biāo)志物[7]。本研究將檢測miR-1290在CRC患者血清中的表達(dá)水平，分析其與CRC臨床病理特征的關(guān)系，并探討其對CRC的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 連續(xù)收集2017年1月至2019年12月在伊川縣人民醫(yī)院經(jīng)病理確診的80例CRC患者(CRC組)和40例結(jié)直腸腺瘤(CRA)患者(CRA組)的血清樣本，以同時期40例體檢健康者血清樣本作為對照(健康對照組)。CRC患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者均為首次診斷為CRC并進(jìn)行CRC根治術(shù)；(2)既往或現(xiàn)在未患有其他類型的惡性腫瘤疾病或癌前病變，直系親屬中無家族性CRC史；(3)所有患者術(shù)前均未接受免疫治療，未接受放化療；(4)臨床資料完整，且均對本次研究知情同意。CRC排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并嚴(yán)重自身免疫性疾病；(2)合并心、肝、肺、腎等重要臟器功能不全；(3)直系親屬中既往或現(xiàn)在有2人或2人以上患消化系統(tǒng)惡性腫瘤疾病。CRC組患者中男46例，女34例；年齡21～75歲，平均(52.3±8.3)歲；腫瘤位于直腸47例，結(jié)腸33例；腫瘤直徑≤4 cm 36例，>4 cm 44例；高-中分化腺癌55例，低分化腺癌25例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移21例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移59例；參考國際抗癌聯(lián)盟(UICC)第8版惡性腫瘤TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ～Ⅱ期44例，Ⅲ～Ⅳ期36例。本研究經(jīng)伊川縣人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 所有研究對象早晨空腹采集3 mL靜脈血，離心(3 000 r/min，離心半徑13.5 cm)5 min后，吸取上清液置于不含RNA酶的1.5 mL離心管中，在-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2儀器與試劑 TRIzol試劑購于美國Invitrogen公司，miScript Ⅱ RT試劑盒和miScript SYBR Green PCR試劑盒均購自德國Qiagen公司，CEA檢測試劑盒及配套質(zhì)控品均購自美國Roche公司，ABI 7500實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，Cobas e601電化學(xué)發(fā)光(ECL)免疫分析儀購自美國Roche公司。

1.2.3實時熒光定量PCR(qPCR)檢測血清miR-1290表達(dá) 采用TRIzol試劑提取血清總RNA，采用紫外分光光度儀測量總RNA吸光度(A260 nm/A280 nm)，比值在1.7～2.3的樣本用于后續(xù)試驗。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試驗，RNA稀釋至2 ng/μL，加入逆轉(zhuǎn)錄溶液，45 ℃環(huán)境下逆轉(zhuǎn)錄30 min，85 ℃環(huán)境下逆轉(zhuǎn)錄10 min，反應(yīng)結(jié)束后加入80 μL無RNA酶雙純水進(jìn)行稀釋，將cDNA保存于-20 ℃冰箱。采用熒光定量PCR試劑盒檢測miR-1290表達(dá)，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，61 ℃退火30 s，70 ℃ 延伸20 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算血清中miR-1290相對表達(dá)水平。引物序列由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計合成，miR-1290(F)：5′-GCGCGTGGATTTTTGGAT-3′，(R)：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′；U6(F)：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，(R)：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.4ECL法檢測血清CEA表達(dá) 采用ECL免疫分析法測定所有研究對象血清CEA水平，樣本檢測前應(yīng)先進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控測量，室內(nèi)質(zhì)控合格后按照CEA試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

2 結(jié) 果

2.13組血清miR-1290及CEA表達(dá)水平比較 單因素方差分析顯示，血清CRC組患者miR-1290表達(dá)水平顯著高于CRA組和健康對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Cruskal-WallisH檢驗顯示，CRC組患者血清CEA表達(dá)水平顯著高于CRA組和健康組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 3組血清miR-1290及CEA表達(dá)水平比較

2.2血清miR-1290、CEA表達(dá)水平與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系 依據(jù)血清miR-1290和CEA表達(dá)水平中位數(shù)將CRC患者分為miR-1290高表達(dá)組、miR-1290低表達(dá)組、CEA高表達(dá)組和CEA低表達(dá)組。χ2檢驗結(jié)果顯示，血清miR-1290表達(dá)水平與CRC患者TNM分期、腫瘤分化程度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)；血清CEA表達(dá)水平與CRC患者TNM分期和腫瘤分化程度有關(guān)(P<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)，見表2。

表2 血清miR-1290、CEA表達(dá)水平與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系(n=80)

2.3血清miR-1290聯(lián)合CEA檢測對CRC的診斷價值 ROC曲線分析結(jié)果顯示，miR-1290診斷CRC的AUC為0.807(95%CI0.863～0.951)，CEA診斷CRC的AUC為0.740(95%CI0.727～0.872)，miR-1290對CRC的診斷效能優(yōu)于傳統(tǒng)的CEA檢測。此外，當(dāng)miR-1290臨界閾值為0.96時，CEA臨界閾值為3.46 ng/mL時，均能獲得最大約登指數(shù)，miR-1290的靈敏度和特異度分別為71.2%、80.1%，CEA的靈敏度和特異度分別為68.8%、76.7%。血清miR-1290聯(lián)合CEA檢測診斷CRC的AUC為0.840(95%CI0.907～0.973)，診斷效能優(yōu)于miR-1290單獨檢測，當(dāng)聯(lián)合檢測預(yù)測概率的臨界閾值為0.738時，約登指數(shù)最大，此時靈敏度和特異度分別為88.8%和85.2%，見圖1。

圖1 血清miR-1290、CEA檢測及聯(lián)合檢測ROC曲線分析

3 討 論

CRC早期發(fā)病隱匿，大多數(shù)患者就診時病程往往已進(jìn)展至中晚期，嚴(yán)重者伴發(fā)遠(yuǎn)距離器官轉(zhuǎn)移，這給臨床救治造成了極大困難，患者預(yù)后情況較差[8]。CEA是目前臨床最常用的CRC篩查腫瘤標(biāo)志物，對于協(xié)助診斷、檢測治療效果和判斷預(yù)后具有重要意義，但存在靈敏度和特異度低的缺點[9]，并不能有效篩檢出潛在CRC患者，因此仍需找尋更有價值的腫瘤生物標(biāo)志物。

MiRNA是一種內(nèi)源性非編碼調(diào)控RNA，在內(nèi)源性前mRNA的選擇性剪接、染色質(zhì)狀態(tài)控制、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。越來越多研究報道，miRNA表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，例如在CRC的研究中，LI等[10]發(fā)現(xiàn)miR-4429在CRC組織中低表達(dá)，其通過調(diào)控SMAD3介導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制CRC細(xì)胞的侵襲和遷移，MO等[11]發(fā)現(xiàn)miR-452在CRC組織中高表達(dá)，其通過抑制血管表皮生長因子A(VEGFA)表達(dá)進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和腫瘤血管再生。MiR-1290是新發(fā)現(xiàn)的一種微小RNA，其在非小細(xì)胞肺癌[12]、食管癌[13]、乳腺癌[14]、CRC[15]等腫瘤組織中的表達(dá)水平顯著升高，與腫瘤多種惡性生物學(xué)性狀密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)一些miRNA不僅在腫瘤組織中異常表達(dá)，其在腫瘤患者體液中也異常表達(dá)，由于其不易受到強酸、強堿影響或不被RNA酶降解，因此循環(huán)miRNA正在成為診斷腫瘤的一種新興的非侵襲性檢測手段。血清miR-1290在口腔鱗癌患者中低表達(dá)，是影響患者預(yù)后不良的獨立危險因素[16]，此外，血清miR-1290在胃癌患者中表達(dá)升高并與臨床病理特征相關(guān)，在診斷胃癌方面具有良好的敏感性和特異性[17]。然而，目前尚鮮有血清miR-1290在CRC患者中的表達(dá)情況及其在CRC診斷效能方面的研究。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清miR-1290在CRC患者中的表達(dá)水平顯著高于CRA患者和健康體檢者，提示其在CRC的發(fā)生、發(fā)展中有著重要作用，這與LIU等[18]研究結(jié)果相一致。此外，本研究發(fā)現(xiàn)血清miR-1290表達(dá)水平與CRC患者TNM分期、腫瘤分化程度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤部位及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，提示血清miR-1290可能與CRC的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究還通過ROC對血清miR-1290診斷CRC效能進(jìn)行了評估，結(jié)果顯示miR-1290單獨診斷CRC的AUC為0.807，靈敏度和特異度分別為71.2%、80.1%，均優(yōu)于傳統(tǒng)的CEA檢測，而當(dāng)miR-1290與CEA聯(lián)合檢測時，AUC為0.840，靈敏度和特異度分別為88.8%和85.2%，表明血清miR-1290聯(lián)合CEA檢測對CRC診斷有著較好的診斷效能，可以用于CRC的早期篩查。

綜上所述，miR-1290在CRC患者血清中高表達(dá)且與患者TNM分期、腫瘤分化程度和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，血清miR-1290檢測可用于CRC早期篩查，miR-1290聯(lián)合CEA檢測可進(jìn)一步提高CRC診斷效能。