周朝彬，饒茂霞，胥國(guó)楠，王志琴，龔 偉，楊永建，田正友，曾伯平

（1.遵義師范學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，遵義 563006，貴州；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，林業(yè)生態(tài)工程省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130；3.九龍縣農(nóng)牧農(nóng)村和科技局，九龍 626200，四川）

花椒為蕓香科(Rutaceae)花椒屬(Zanthoxylum)植物，該植物根系發(fā)達(dá)、喜鈣耐旱，可作為生態(tài)樹種應(yīng)用于植被恢復(fù)實(shí)踐?；ń饭麑?shí)(果皮)主要用作香料[1]。同時(shí)，花椒含有萜類、甾醇、類黃酮、生物堿、皂苷和香豆素等活性成分[2]，常作藥用，可用作驅(qū)蛔蟲、治療哮喘、支氣管炎、消化不良、靜脈曲張、腹瀉、風(fēng)濕和牙痛等多種疾病的中藥制劑[3]，明確列入中華人民共和國(guó)藥典[4]，具有顯著經(jīng)濟(jì)效益。

貴州是我國(guó)花椒主產(chǎn)區(qū)之一，20世紀(jì)90年代在貴州貞豐縣北盤江鎮(zhèn)和關(guān)嶺縣花江鎮(zhèn)大量種植的頂壇花椒(Zanthoxylum planispinum var.dingtanen?sis)，在石漠化治理和促進(jìn)農(nóng)民增收方面發(fā)揮了重要作用。2007年12月31日，貞豐縣被中國(guó)經(jīng)濟(jì)林協(xié)會(huì)授予“中國(guó)花椒之鄉(xiāng)”稱號(hào)。前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，關(guān)嶺縣和貞豐縣種植的頂壇花椒出現(xiàn)以開黃色雄花為典型特征的衰退特征，相關(guān)學(xué)者也報(bào)道了此現(xiàn)象[5]。黃色雄花不結(jié)實(shí)，嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)產(chǎn)出、降低農(nóng)戶種植積極性、威脅石漠化治理成效的鞏固?；ń坊ㄆ鞴兕愋陀写苹?、雄花和兩性花，正?；ń芬源苹橹鳎?0%以上。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，一些頂壇花椒樹體開雄花比例超80%，表明花椒花性分化過(guò)程發(fā)生了變化。

植物花性分化過(guò)程受內(nèi)源激素調(diào)控[6]。目前，已有的研究除了一致認(rèn)同乙烯(ethylene，Eth)促進(jìn)雌花分化的作用外[7-8]，大多數(shù)內(nèi)源激素對(duì)植物花性分化的作用尚未取得一致的認(rèn)識(shí)。核桃(Juglans regia)雄花成花比例與赤霉素(gibberellin，GA)含量正相關(guān)[9]。然而GA3含量增加有利于軟棗獼猴桃(Actin?idia arguta)雌花的發(fā)育[10]。生長(zhǎng)素類物質(zhì)可以促進(jìn)荔枝(Litchi chinen)雌蕊的發(fā)育[11]。但柿子(Diospyros kaki)雄花的發(fā)育與相對(duì)較高的吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)含量相關(guān)[12]。一些研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的玉米素(Zeatin，ZR)促進(jìn)麻瘋樹(Jatropha curcas)雌花分化[13]，然而，在柿子花性分化的研究上則發(fā)現(xiàn)，高濃度的ZR促進(jìn)兩性花分化[12]。脫落酸(abscisic acid，ABA)在不同植物上對(duì)花性分化的調(diào)控作用也不一致[12,14]。

多胺是具有生物活性的低分子量脂肪含氮堿，主要有腐胺(putrescine，Put)、尸胺(cadaverine，Cad)、亞精胺(spermidine，Spd)和精胺(spermine，Spm)等。荔枝雌蕊的發(fā)育與高Spd和Spm含量相關(guān)聯(lián)，Put與雄蕊的發(fā)育相關(guān)聯(lián)[11]。然而黃連木(Pistacia chinen?sis)雌株葉片的Put含量在不同時(shí)期均高于雄株[15]。在陜西大紅袍花椒(Zanthoxylunm bungeanum)花芽分化過(guò)程中，Put和Spd含量的增加有利于雌蕊分化[16]。由此表明，多胺在性別分化過(guò)程中的作用也因植物而異。C/N對(duì)植物花性分化的作用方面，錐栗(Castanea henryi)兩性花序C/N在大多數(shù)時(shí)期均顯著高于雄花序[17]，而C/N則與柿子花性分化無(wú)關(guān)，高的C/N僅與雌蕊和雄蕊的長(zhǎng)度有關(guān)[18]。

目前，花椒的研究主要集中在栽培管理[19]、花芽分化[20]、果實(shí)性狀以及有效成分提取和活性[21-22]等方面。對(duì)花椒花性分化的生理機(jī)制研究極少。本研究測(cè)定了頂壇花椒不同花性分化時(shí)期花芽?jī)?nèi)源激素、多胺以及C/N比變化，以期為頂壇花椒花性分化機(jī)制及調(diào)控技術(shù)研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

頂壇花椒花芽采自貴州省關(guān)嶺布依族苗族自治縣板貴鄉(xiāng)(25.676°N，105.657°E)，該區(qū)域?qū)儆诘湫偷膩啛釒駶?rùn)季風(fēng)氣候，年均降雨量1 100 mm，年均溫18.4℃。樣地海拔530 m，石漠化嚴(yán)重，基巖裸露率50%～80%，土壤以石灰土為主。花椒樹齡大部分為10～12 a生。在花椒人工林內(nèi)隨機(jī)選擇樣樹8株，在樹冠中部外圍的東南西北4個(gè)方向進(jìn)行取樣。采樣時(shí)期分別為：2020年11月4日采集花序軸分化期的花芽，2021年2月26日采集雄花，2021年3月13日采集雌花。部分花芽濕巾包裹后，置于4℃冷藏箱帶回實(shí)驗(yàn)室采用DMSZ8視頻一體機(jī)拍照(圖1Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ)。同時(shí)在野外對(duì)雌雄花序拍照觀察(圖1Ⅳ，Ⅴ和Ⅵ)。另一部分立刻放入液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-80℃冰箱中保存，用于激素、多胺、可溶性糖和可溶性蛋白指標(biāo)分析。

圖1 不同花性分化時(shí)期頂壇花椒的花芽形態(tài)特征Figure 1 Morphological characteristics of Z.planispinum var.dintanensis flower buds in different floral sex differentiation stages

1.2 花芽激素、多胺、可溶性糖和可溶性蛋白測(cè)定

1.2.1 激素含量測(cè)定

采用酶聯(lián)免疫分析中的雙抗體夾心法測(cè)定頂壇花椒花序軸分化期的花芽(Ⅰ)、雄花(Ⅱ)和雌花(Ⅲ)的GA3、IAA、Eth、ABA和ZR含量，試劑盒由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供，具體方法參照試劑盒使用說(shuō)明書。

1.2.2 多胺含量測(cè)定

多胺提?。簶悠酚谝旱醒心ズ蠡靹?，轉(zhuǎn)入離心管中，加入5 mL 5%高氯酸溶液超聲提取30 min，6 000 r/min離心5 min，取上清，重提一次，合并兩次清液定容至9 mL；用1 mL正己烷凈化2次，取提取液3 mL，加入0.2 mL 2 mol/L的NaOH和100μL苯甲酰氯溶液，渦旋20 s后40℃下保溫30 min，然后向混合液里加入甲醇定容至4 mL并終止反應(yīng)，過(guò)0.22μm濾膜后進(jìn)樣分析。

多胺測(cè)定：采用高效液相色譜測(cè)試花芽多胺含量，多胺種類包括Put、苯乙胺(phenylethylamine，Pea)、Cad、Spd、Spm、色胺(tryptamine，Try)、組胺(histamine，His)和酪胺(tyramine，Tyr)。高效液相色譜儀(Thermo，U3000)的色譜柱為syncronis C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫35℃，流動(dòng)相A：90%乙腈/10%(含0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸銨溶液)，流動(dòng)相B：10%乙腈/90%(含0.1%乙酸的0.01 mol/L乙酸銨溶液)，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20μL。

1.2.3 可溶性糖和可溶性蛋白含量測(cè)定

采用蒽酮比色法測(cè)定可溶性糖含量[23]，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)含量[24]，可溶性糖和可溶性蛋白的比值為C/N。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007整理數(shù)據(jù)，SPSS 19.0對(duì)不同花性分化時(shí)期花芽生理指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan新復(fù)極差進(jìn)行多重比較，采用Pearson相關(guān)性分析各指標(biāo)間的關(guān)系，采用主成分分析，通過(guò)降維中的因子分析，提取主成分后，將主成分得分做散點(diǎn)圖，研究不同花性分化時(shí)期花芽激素、多胺和C/N的可能組合。采用OriginPro 8.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同花性分化時(shí)期頂壇花椒花芽激素含量變化

頂壇花椒花性分化不同時(shí)期中，不同激素含量的變化規(guī)律不一?；ㄐ蜉S分化期的花芽、雄花以及雌花間的IAA含量和ABA含量差異顯著(P＜0.05)，均表現(xiàn)為雌花＞雄花＞花序軸分化期的花芽的規(guī)律，雌花的IAA含量分別是雄花和花序軸分化期的花芽的1.11和1.14倍，雌花的ABA含量分別是雄花和花序軸分化期的花芽的1.05和1.10倍。Eth和ZR在3個(gè)時(shí)期則均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。GA3含量表現(xiàn)出在花序軸分化期花芽為最低，僅(4 534.94±77.17)pg/g，分別比雄花和雌花低5.55%和4.15%(P＜0.05)，而雄花和雌花間差異不顯著(P＞0.05)(圖2)。

2.2 C/N比

頂壇花椒不同花性分化時(shí)期的C/N存在顯著差異。C/N表現(xiàn)為雄花＞雌花＞花序軸分化期的花芽的特征(P＜0.05，圖2)，雄花的C/N分別是雌花和花序軸分化期的花芽的2.04和4.18倍。

圖2 頂壇花椒不同花性分化時(shí)期的激素和C/N特征Figure 2 The hormones and C/N characteristics of Z.planispinum var.dintanensis flower buds during different floral sex differentiation stages

2.3 多胺

本試驗(yàn)中，Put和Pea在3個(gè)時(shí)期的樣品中均未檢出，因此，僅分析Cad、Spd、Spm、Try、His和Tyr含量變化規(guī)律。6種多胺含量在不同時(shí)期的差異特征表明，低含量的Cad和高含量的Tyr有利于雄花發(fā)育，而低含量的Spd、Try和Tyr，以及高含量的Spm則有利于雌花的形成(表1)。

表1 頂壇花椒不同花性分化時(shí)期的多胺特征Table 1 The polyamine characteristics of Z.planispinum var.dintanensis flower buds during different floral sex differentiation stages

2.4 生理指標(biāo)間相關(guān)性

回歸分析表明以下生理變量間存在極顯著相關(guān)(P＜0.01)：GA3和ABA呈正相關(guān)，和Cad、Spd、Try以及His呈負(fù)相關(guān)；IAA和ABA以及Spm呈正相關(guān)，和Spd呈負(fù)相關(guān)；ABA和Spm呈正相關(guān)，和Spd、Try、His呈負(fù)相關(guān)；C/N與Cad呈負(fù)相關(guān)；Cad和Try以及His呈正相關(guān)；Spd和Try以及His呈正相關(guān)；Try和His呈正相關(guān)，Tyr和Spm呈負(fù)相關(guān)(表2)。

以下生理變量間存在顯著相關(guān)(P＜0.05)：GA3和IAA呈正相關(guān)；IAA和Try、His以及Tyr呈負(fù)相關(guān)；C/N和Try呈負(fù)相關(guān)；Cad和Spd呈正相關(guān)；Spd和Spm呈負(fù)相關(guān)(表 2)。

表2 花芽生理指標(biāo)間相關(guān)性Table 2 Correlation matrix between physiological indexes of flower buds

2.5 主成分分析

主成分分析結(jié)果展示了不同花性分化時(shí)期激素、多胺和C/N的分類特征(圖3a)。PC1軸劃分了雄花和雌花(得分為正)以及花序軸分化期的花芽(得分為負(fù))的生理特征，PC2軸劃分了花序軸分化期的花芽和雌花(得分為正)以及雄花(得分為負(fù))的生理特征。

部分頂壇花椒生理指標(biāo)的主成分分析結(jié)果很好區(qū)分了不同花性分化時(shí)期(圖3b)：Spm、IAA、ABA、GA3和C/N對(duì)應(yīng)PC1正值梯度。Cad、Try、His、Spd和Tyr對(duì)應(yīng)PC1負(fù)值梯度。Cad、Try、His、Spm、IAA、ABA和Spd對(duì)應(yīng)PC2正值梯度，Tyr、GA3和C/N對(duì)于PC2負(fù)值梯度。

圖3 不同花性分化時(shí)期頂壇花椒花芽生理指標(biāo)的主成分分析Figure 3 Principal component analysis(PCA)of physiological indexes in Z.planispinum var.dintanensis flower buds during different floral sex differentiation stages

3 討論

內(nèi)源激素對(duì)植物花性分化的作用研究報(bào)道較多，已有的研究表明，GA、IAA、Eth、ABA和ZR都可能對(duì)花性分化有影響[12,25]。在本研究中，測(cè)定的5種內(nèi)源激素中，頂壇花椒花性分化不同時(shí)期的Eth和ZR間無(wú)顯著差異(P＞0.05)，雄花和雌花間GA3含量無(wú)顯著差異(P＞0.05)，但均顯著高于花序軸分化期的花芽的GA3含量，表明較高的GA3含量有利于雌花和雄花的發(fā)育。僅IAA和ABA在3個(gè)時(shí)期差異顯著，且均分別表現(xiàn)出雌花含量最高，花序軸分化期的花芽含量最低的規(guī)律(圖2)，表明IAA和ABA是影響頂壇花椒花性分化的主要內(nèi)源激素類型。

IAA被認(rèn)為與花粉內(nèi)源物質(zhì)和能量的代謝有關(guān)，高IAA含量導(dǎo)致百合(Lilium)花粉敗育[26]，并對(duì)癭椒樹(Tapiscia sinensis)雌配子體發(fā)育至關(guān)重要[27]。短日光周期處理下絲瓜(Luffa cylindrica)幼苗葉片較低的IAA含量與雌花分化相關(guān)[28]。IAA應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子ARF6和ARF8可以通過(guò)劑量效應(yīng)調(diào)節(jié)擬南芥(Arabidopsis thaliana)雄蕊和雌蕊的成熟[29]。在麻瘋樹雄性和雌性器官成熟階段，IAA相關(guān)基因均有上調(diào)[30]。本研究中，頂壇花椒雌花中IAA含量為(16.13±0.08)μg/g，比雄花IAA含量顯著高出10.78%，表明較高的IAA濃度與頂壇花椒的雌花發(fā)育相關(guān)聯(lián)，這與前人的研究結(jié)果一致[10,31]。

ABA對(duì)不同植物的花性別分化具有不同的調(diào)控作用[32-33]。中等含量水平的ABA有利于棗(Ziziphus jujuba)花芽分化[34]。高水平ABA可刺激柿樹雄蕊原基的敗育而促進(jìn)雌蕊原基的發(fā)育[31]，對(duì)文冠果(Xan?thoceras sorbifolium)花性分化研究發(fā)現(xiàn)，高水平的ABA具有促雌作用[14]。棕櫚(Trachycarpus fortunei)雌花的ABA含量在相對(duì)應(yīng)的時(shí)期均高于雄花，表明較高濃度的ABA更有利于雌花的發(fā)育與成熟[35]。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，頂壇花椒雌花的ABA含量為(59.93±0.73)μg/g，顯著高于雄花中ABA含量(P＜0.05，圖2)，表明高濃度ABA有利于雌花發(fā)育。

多胺在植物體內(nèi)的生理代謝中起著類似于“鈣調(diào)素”的關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[36]。生理分化期的Spd含量可能與蒿柳(Salix viminalis)的花性分化有關(guān)[37]。Zhu L.H.等[38]的研究表明，蘋果的花芽形成與Spm含量呈正相關(guān)。Spm還可和Spd共同作用，促進(jìn)砂梨花芽分化[39]。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，頂壇花椒僅在雌花中可檢測(cè)出Spm，含量達(dá)(7.89±0.31)μg/g，而在花序軸分化期的花芽和雄花中均未檢出(表1)，表現(xiàn)出Spm與頂壇花椒雌花發(fā)育強(qiáng)烈的關(guān)聯(lián)性。這與學(xué)者在荔枝、煙草上的研究結(jié)果一致[11,40]。另外，研究發(fā)現(xiàn)隨著頂壇花椒花性分化過(guò)程的進(jìn)行，從花序軸分化期的花芽到雄花和雌花發(fā)育，Cad含量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，雄花和雌花的Cad含量均比花序軸分化期的花芽的Cad含量低，但比較雌花和雄花的Cad含量發(fā)現(xiàn)，雌花的Cad含量是雄花的2.18倍，二者差異顯著(圖2)，表明較高的Cad含量可能有利于雌花發(fā)育。陳學(xué)好等[41]對(duì)黃瓜雌雄花不同發(fā)育時(shí)期多胺研究也發(fā)現(xiàn)，雌花從大孢子母細(xì)胞時(shí)期到花器官成熟，整個(gè)過(guò)程Cad含量均高于雄花。與Cad變化規(guī)律不同的是，隨著花性分化過(guò)程的進(jìn)行，Spd、Try和His則表現(xiàn)為持續(xù)降低的規(guī)律，進(jìn)一步比較雄花和雌花后發(fā)現(xiàn)，雄花中Spd、Try和His含量均顯著高于雌花(圖2)，尤其是雌花中檢測(cè)不出His，表明較高的Spd、Try和His含量可能有利于雄花發(fā)育。另外，雄花中Tyr含量分別是花序軸分化期的花芽以及雌花中Tyr含量的1.83和13.60倍，表明Tyr強(qiáng)烈的促進(jìn)雄花發(fā)育的特性。

碳水化合物和蛋白質(zhì)等為植物提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)植物花芽分化[42]。大量研究表明，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)中的C和N含量決定的C/N是決定花性分化的關(guān)鍵。錐栗兩性花的C/N比在大部分時(shí)期均顯著高于雄花[17]，表明高的C/N促進(jìn)雌花發(fā)育。而在柿子花器官發(fā)育中，高的C/N比僅與雌蕊和雄蕊的長(zhǎng)度相關(guān)聯(lián)，與花性分化無(wú)關(guān)[18]，表明C/N對(duì)花性分化是否起作用取決于植物種類。我們研究發(fā)現(xiàn)，花序軸分化期的花芽的C/N比較低，僅4.16±0.22。雄花和雌花的C/N則顯著升高，且雄花的C/N遠(yuǎn)高于雌花，雄花的C/N是雌花的2.04倍(圖2)，凸顯出高C/N與雄花發(fā)育之間的關(guān)聯(lián)。

通過(guò)生理指標(biāo)間相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，與雄花發(fā)育密切關(guān)聯(lián)的生理指標(biāo)(Spd、Try、His、Tyr)和與雌花發(fā)育密切關(guān)聯(lián)的生理指標(biāo)(IAA、ABA、Spm)間大多數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)(表2)，表明這些生理指標(biāo)與頂壇花椒雄花或雌花發(fā)育關(guān)系間的區(qū)別性。大多數(shù)生理指標(biāo)在雌花或雄花中均能檢出(除了雌花中未檢出His，在花序軸分化期的花芽和雄花中未檢出Spm)，表明生理指標(biāo)促進(jìn)雄花或雌花發(fā)育的劑量效應(yīng)。進(jìn)一步采用主成分分析結(jié)果表明，花序軸分化期的花芽的PC1值最小，對(duì)應(yīng)的Try、His和Spd的PC1值最低(圖3)，表明Try、His和Spd值較高有利于花序軸分化期的花芽發(fā)育。雌花的PC1和PC2值為正，對(duì)應(yīng)Spm、IAA和ABA的PC1和PC2值為正，而雄花的PC2值為負(fù)且PC1值為正，對(duì)應(yīng)象限的生理指標(biāo)為C/N(圖3)，表明調(diào)控頂壇花椒雌花和雄花分化的生理因子明顯不同，較高的Spm、IAA和ABA值是有利于雌花分化的主要生理因子，而較高的C/N值是有利于雄花發(fā)育的主要生理因子。在頂壇花椒雌花中，Spm、IAA和ABA含量顯著高于雄花，雄花中C/N顯著高于雌花也印證了該結(jié)果(圖2，表1)。

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明較高含量的IAA、ABA和Spm促進(jìn)雌花分化，未來(lái)可進(jìn)一步研究外源激素或多胺對(duì)花椒花性分化的調(diào)節(jié)作用，為生產(chǎn)實(shí)踐中雄花控制提供理論基礎(chǔ)。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)較高的Tyr和C/N有利于雄花發(fā)育，通過(guò)人工施用多胺或礦質(zhì)養(yǎng)分，能否調(diào)控頂壇花椒開雄花，尚需進(jìn)一步研究。