天然結(jié)合酚類化合物的研究進展

肖婧泓,辛嘉英,路雪純,劉青云,宋微,李慧敏,方祁利

(哈爾濱商業(yè)大學 食品工程學院重點實驗室，哈爾濱 150076)

植物酚類化合物是廣泛分布于植物基質(zhì)中的生理活性物質(zhì)，在谷物、水果和蔬菜的保護組織(果皮等)和營養(yǎng)組織(胚芽等)中充當信號或植物防御機制，對病原體入侵提供物理和化學屏障，阻止昆蟲和動物的攻擊，并具有抗菌、抗氧化等生理功能，在植物中的含量僅次于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素[1-2]。酚類化合物是由一個或多個羥基(甲氧基)取代芳香烴苯環(huán)上的氫原子而形成的次生植物代謝物(如酚酸、黃酮等)[3]。酚類化合物因其卓越的生理活性逐漸成為研究熱點。

酚類化合物在植物中有不同的存在形式，一種是游離酚類化合物，另一種是通過酯鍵、醚鍵和碳碳雙鍵與纖維素、蛋白質(zhì)、木質(zhì)素等物質(zhì)相互作用(共軛)，或因離子鍵與膳食纖維相互作用成為植物基質(zhì),或嵌入細胞內(nèi)形成結(jié)合酚類化合物[4]。目前，多數(shù)研究集中在游離酚類化合物的組成和生物學功能上，而存在于表皮、葉子中的結(jié)合酚類化合物被視為廢料。然而，植物中的酚類化合物主要以結(jié)合狀態(tài)存在[5]。近年來，結(jié)合酚類化合物逐漸被發(fā)現(xiàn)和重視，由于自身與不溶性大分子或細胞壁物質(zhì)結(jié)合，不易直接采用傳統(tǒng)的浸漬和索氏提取法獲得[6]。結(jié)合酚類化合物可采用堿性、酸性水解或酶解的方法處理[7-8]，Kim等[9]分別采用堿性、酸性水解處理麩皮釋放結(jié)合酚類化合物，前者處理過的麩皮相較于后者有較強的生理活性。Sanchez-Gonzalez等[10]采用從微生物中提取的酶破壞結(jié)合的酯鏈，從而釋放結(jié)合酚類化合物。除化學方法外,也可采用物理方式處理，如高溫蒸煮、超高壓等方法處理和釋放結(jié)合酚類化合物[11]，Li等[12]研究發(fā)現(xiàn)隨著加工溫度的升高，山楂中結(jié)合酚類化合物的含量增加。Zhang等[13]采用超高壓對芒果葉進行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)不溶性結(jié)合酚類化合物從(20.17±1.40) mg/g增加到29.13 mg/g。

隨著結(jié)合酚類化合物的研究逐漸深入，發(fā)現(xiàn)結(jié)合酚類化合物具有應(yīng)用在食品方面的巨大潛力，鄒月等[14]綜述阿魏酰低聚糖可替代蔗糖添加到食品中作為甜味劑。楊文平等[15]將500 mg/mL燕麥的酚類提取物添加到冷凍豬肉中，可減緩豬肉蛋白氧化。張嶸等[16]概述了植物酚類化合物抗氧化和抗菌功能,可用于防止肉制品微生物污染和氧化。因此，本文將以結(jié)合酚類化合物為綜述對象，從綠色提取方式、生物可給性和生理活性3個方面進行闡述，為后續(xù)在食品添加劑方面的應(yīng)用提供參考。

1 深共熔溶劑提取方式

酚類化合物的提取常采用有機溶劑液-固浸提法，此方法高效、易操作且適用性廣。直接采用有機溶劑浸提法的提取液中，酚類化合物主要以游離酚類化合物的形態(tài)存在。在植物基質(zhì)中，與大分子物質(zhì)通過離子鍵相互作用產(chǎn)生的結(jié)合酚類化合物不易被有機溶劑直接萃取獲得，但水解后可采用有機溶劑萃取，萃取的有機溶劑大多選用乙酸乙酯和乙醚的混合物。有機溶劑提取法因其優(yōu)點在酚類化合物的提取中得到廣泛應(yīng)用，但該方法有不可忽視的缺點：大部分溶劑具有揮發(fā)性強、有毒性、成本高等特點，并且大量使用有機溶劑對人體和環(huán)境會造成危害。為了解決這個問題，近年來學者們不斷探索新興綠色溶劑。

綠色高效提取天然化合物的溶劑是人們關(guān)注的焦點，而深共熔溶劑(deep eutectic solvents，DES)作為一種低熔點、低毒性和可生物降解的新興溶劑備受關(guān)注。DES是由氫鍵受體(hydrogen bond acceptor，HBA)(氯化膽堿)和氫鍵供體(hydrogen bond donor，HBD)(有機酸、糖和醇)根據(jù)具體情況按不同比例組成的溶劑體系，而HBA和HBD之間形成的氫鍵是降低熔點和提高萃取率的主要原因[17]。作為一種溶劑性質(zhì)較好的溶劑，DES在提取酚類化合物方面很受歡迎(見圖1)。邢晨等[18]在概述酚類化合物提取時表明DES對其具有良好的提取效果，并提出水解后的結(jié)合酚類化合物也可采用相同的方法。隨后的實驗證明DES可以用于提取處理后的結(jié)合酚類化合物，而且提取效果遠比傳統(tǒng)的方法更有優(yōu)勢。Wang等[19]分別采用60%甲醇溶液和深共熔溶劑體系進行提取，通過DES提取的結(jié)合酚類化合物為20.8～37.1 μg/g，比傳統(tǒng)方法得到的8.32～18.0 μg/g高12.48～19.1 μg/g，相較之下，DES對結(jié)合態(tài)酚類化合物的溶解性更好。DES對結(jié)合酚類化合物提取效果方面也優(yōu)于游離酚類化合物，Wang等[20]利用DES提取茶籽油中不同類型的酚類化合物，采用氯化膽堿-甘油在50 ℃進行提取的方法，游離酚類化合物和結(jié)合酚類化合物分別增加到51.0%和93.2%，而結(jié)合酚類化合物比游離酚類化合物增加42.3%。DES作為一種綠色健康的提取方式應(yīng)該被廣泛地應(yīng)用到對不同底物結(jié)合酚類化合物的提取，這有助于對后續(xù)結(jié)構(gòu)和生理活性的探究，并對相關(guān)功能性食品開發(fā)具有指導(dǎo)意義。

圖1 DES提取過程

2 生物可給性

植物中以不同形式存在的酚類化合物具有的生物活性需通過生物利用度(釋放(生物可給性)、吸收、代謝和循環(huán))體現(xiàn)對人體健康產(chǎn)生的影響。生物利用度是指生物活性成分被血液循環(huán)系統(tǒng)吸收，從而在目標組織和器官上發(fā)揮生物活性的程度。而生物可給性是指腸道可能吸收的生物活性化合物的數(shù)量，因此生物利用度又嚴格依賴于生物可給性(釋放)[21]。

近些年來，植物中存在的結(jié)合酚類化合物的生理活性作用被深入研究，其對人體健康產(chǎn)生影響的前提是結(jié)合酚類化合物的生物可給性和生物利用度。含酚類化合物的食物通過口腔咀嚼后進入胃中，而在胃腸道中不同形式的酚類物質(zhì)遵循著不同的消化吸收途徑。游離酚類化合物可直接被腸道吸收，少部分結(jié)合酚類化合物可通過胃和小腸中的轉(zhuǎn)運蛋白吸收或經(jīng)水解后吸收，陳華敏[22]采用Caco-2單層細胞模型模擬高粱糠提取的游離酚類化合物和結(jié)合酚類化合物在小腸中的吸收，其表觀滲透系數(shù)均大于1×10-6，吸收率均大于20%，都表現(xiàn)出良好的吸收效果，但游離酚類化合物的表觀滲透系數(shù)和吸收率均低于結(jié)合酚類化合物，表明結(jié)合酚類化合物在小腸的吸收率優(yōu)于游離酚類化合物。這些通過胃和小腸吸收的酚類化合物只有5%左右，而90%以上的結(jié)合酚類化合物幾乎都不能被小腸吸收進入大腸(結(jié)腸)[23]。大部分結(jié)合酚類化合物進入大腸(結(jié)腸)后在消化酶、結(jié)腸中雙歧桿菌、乳酸菌(糖酶、蛋白酶和酯酶)和其他類型酶的作用下，破壞共價鍵水解釋放結(jié)合酚類化合物，例如Zhu等[24]研究3種豆科類植物中的結(jié)合酚類化合物在結(jié)腸中釋放，并且結(jié)合酚類化合物通過體外消化測試表明腸道消化優(yōu)于口腔和胃。Genilton等[25]研究表明咖啡和面包中結(jié)合酚類化合物在胃酸和腸道胰蛋白酶作用下生物可給性約為11%～26%，而進一步在大腸中由微生物發(fā)酵24 h，結(jié)合酚類化合物的生物可給性達到50%左右。在腸道微生物群的作用下，結(jié)合酚類化合物被釋放并代謝,因此結(jié)腸上皮被認為是體內(nèi)吸收結(jié)合酚類化合物的主要部位(見圖2)。釋放的酚類物質(zhì)通過循環(huán)系統(tǒng)被身體組織吸收和利用，最終發(fā)揮生物活性作用，如防止氧化損傷、炎癥、癌癥、肥胖、糖尿病等。

圖2 結(jié)合酚類化合物在大腸中的吸收過程Fig.2 The absorption process of bound phenolic compounds in the large intestine

3 生理活性

植物中存在的結(jié)合酚類化合物是由大分子物質(zhì)(蛋白質(zhì)、碳水化合物等)和酚類化合物結(jié)合而成，通過大腸(結(jié)腸)中的微生物作用將其分解釋放，釋放后的結(jié)合酚類化合物穿過腸道上皮細胞進入血液循環(huán)，由血液將其帶到各個器官發(fā)揮作用，因此結(jié)合酚類化合物具有較高的生物可給性，這意味著其生理活性可以對人體健康產(chǎn)生較大的影響。因此近些年，對結(jié)合酚類化合物的生理活性研究和發(fā)現(xiàn)逐漸成為熱點，如抗氧化等生理活性[26-28]。

3.1 抗氧化活性

近幾年，關(guān)于結(jié)合酚類化合物的大量研究表明，其本身具有較強的抗氧化活性[29]。Xu等[30]研究發(fā)現(xiàn)，荔枝中與膳食纖維結(jié)合的酚類化合物FRAP和ABTS分別為6.88～13.49 mg/g和5.64～9.98 mg/g。Takoudijou等[31]從高粱種子中提取的結(jié)合酚類化合物在DPPH和FRAP的檢測中結(jié)果相似，并得出了結(jié)合酚類化合物具有較強抗氧化活性的結(jié)論。并且在一些從水果、谷物和農(nóng)林廢物中提取不同存在形式的酚類化合物的文章中發(fā)現(xiàn)，有些從植物中提取的結(jié)合酚類化合物的抗氧化性優(yōu)于游離酚類化合物，例如Prakash等[32]從葡萄柚中提取不同存在形式的酚類化合物并進行DPPH、ABTS和FRAP等抗氧化檢測，其結(jié)合酚類化合物的DPPH(IC50為(13.81±0.36) g/mL)、ABTS(IC50為(12.22±0.47) g/mL)和FRAP抗氧化活性最高。裘芳成等[33]從茶油中提取出的酯化、糖苷和不溶性結(jié)合酚類化合物在DPPH、ABTS、FRAP和ORAC的檢測中其抗氧化活性皆高于游離酚類化合物，并且抗氧化活性隨著含量的增加而升高。Koubala等[34]利用有機溶劑從干果和鮮果中提取結(jié)合酚類化合物，在DPPH、ABTS和FRAP等抗氧化檢測中發(fā)現(xiàn)相似結(jié)果，表現(xiàn)出較強的抗氧化活性?？梢缘贸鰪牟煌孜镏刑崛〉慕Y(jié)合酚類化合物抗氧化活性較強的結(jié)論，這可能源于其含量或結(jié)合后性質(zhì)的增強，需開展進一步研究?，F(xiàn)階段多數(shù)研究中提取物為混合物，其中包含游離酚類化合物和結(jié)合酚類化合物，將提取物進行總抗氧化活性測試，其中結(jié)合酚類化合物具有較大的貢獻。Iftikhar等[35]研究黑麥麩皮及其不溶性膳食纖維中酚類物質(zhì)對總抗氧化活性的影響，發(fā)現(xiàn)黑麥麩皮和不溶性膳食纖維的結(jié)合酚類化合物對DPPH的貢獻率分別超過60%和70%；黑麥麩皮和不溶性膳食纖維的結(jié)合酚類化合物的FRAP值分別占總FRAP值的70%和87%；而黑麥麩皮和不溶性膳食纖維的結(jié)合酚類化合物的ABTS值分別占總ABTS值的69%和84%；黑麥麩皮和不溶性膳食纖維的結(jié)合酚類化合物分別占總還原力值的67%和90%。這些結(jié)果都表明結(jié)合酚類物質(zhì)不僅為總抗氧化活性的主要貢獻者，而且結(jié)合酚類化合物在4種抗氧化方法中都有較高的抗氧化能力。因此，可考慮采用結(jié)合酚類化合物作為綠色抗氧化劑替代人工合成抗氧化劑用于食品中，以避免人工合成抗氧化劑帶來的負面影響。

3.2 抑菌能力

酚類化合物在植物中起到防御作用并且被認為具有廣譜抗菌性，不僅可以減緩(甚至停止)病原菌的生長，而且能夠限制病原菌產(chǎn)生毒素。Bibiana等[36]通過抑制黃曲霉的α-淀粉酶活性研究大豆結(jié)合和共軛酚類化合物抗真菌和毒素污染的效果，結(jié)合酚類化合物提取物可以有效抑制α-淀粉酶活性從而限制黃曲霉生長，由此檢測出黃曲霉毒素B1低水平，這與Wang等[37]研究早、晚熟櫻桃中共軛酚類化合物幾乎完全抑制鏈格孢菌的生長和降低毒素的產(chǎn)生的結(jié)果相似。因此，結(jié)合酚類化合物不光對真菌微生物有一定抑制作用，而且可以降低生長過程中產(chǎn)生的毒素。

結(jié)合酚類化合物對革蘭氏陽性菌(Gram-positive bacteria， G+)和革蘭氏陰性菌(Gram-negative bacteria，G-)同樣具有抑制作用，杜小燕[38]從小麥麩皮中提取游離酚類化合物、酯化和糖苷結(jié)合酚類化合物，發(fā)現(xiàn)其對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌通過抑菌圈(mm)表示均有抑制作用，而酯化結(jié)合酚類化合物對供試菌的抑制作用優(yōu)于游離酚類化合物，尤其對革蘭氏陰性菌大腸桿菌O157的抑制效果最佳，為(47.10±1.84) mm，此結(jié)果與陳彩薇[39]從脫脂米糠中提取的游離酚類化合物和酯化、糖苷結(jié)合酚類化合物的抑制結(jié)果相同。其中，酯化結(jié)合酚類化合物(800 g/mL)對大腸桿菌O157的抑制效果最佳，為(19.67±0.49) mm。從谷物中提取的結(jié)合酚類化合物相較于G+，對G-表現(xiàn)出顯著的抑制作用，但從不同底物中提取的結(jié)合酚類化合物可能表現(xiàn)出不同的抑制效果，Singh等[40]從辣木籽粉中提取出的結(jié)合酚類化合物和游離酚類化合物對供試菌的最小抑菌濃度分別為0.060%～0.157%和0.117%～0.191%，并在相同濃度下結(jié)合酚類化合物對G+(蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌)的抑制作用優(yōu)于G-(大腸桿菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌)。因此，從不同底物中提取的結(jié)合酚類化合物對于G+和G-抑制效果產(chǎn)生的差異，可能源于結(jié)合酚類化合物中結(jié)合的酚類物質(zhì)的類型、含量或者結(jié)合部位不同，但其真正的原因還需要今后進一步的研究，并為后續(xù)在食品中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

3.3 抗炎作用

可能引起機體患病的炎癥由細胞免疫反應(yīng)產(chǎn)生的促炎癥因子(內(nèi)源性多肽)引發(fā)，促炎癥因子包括一氧化氮(NO)、TNF-α和白細胞介素(IL-1～IL-38)[41]。植物中存在的結(jié)合酚類化合物可以通過多種方式防止炎癥：降低促炎癥細胞因子和腫瘤壞死細胞；增強抗炎因子的表達(IL-10)；調(diào)節(jié)炎癥信號通路(NF-kB和MAPK)的方式，使其成為有效的抗炎物質(zhì)之一。Li等[42]將從紅高粱中提取的結(jié)合酚類化合物用于脂多糖(LPS)激活RAW 264.7細胞，在濃度為300～500 μg/mL時，對IL-6和IL-1β的抑制作用顯著(P<0.05)。通過降低細胞產(chǎn)生NO和白細胞介素以達到抑制炎癥的作用。最近研究表明，從茶油中提取的糖苷性結(jié)合酚類化合物也表現(xiàn)出抑制RAW 264.7細胞產(chǎn)生NO的特性，并在10 μg/mL濃度下其抑制細胞產(chǎn)生NO的作用最強，其抗炎活性表現(xiàn)為NO、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)和白細胞介素-6(IL-6)的含量降低[43]。從谷物等中提取的結(jié)合酚類化合物對于LPS激活RAW 264.7中的多種促炎癥因子都表現(xiàn)出顯著的抑制作用。除了抑制細胞中的促炎癥因子外，結(jié)合酚類化合物還可以抑制細胞信號通路和增強抗炎因子。Fang等[44]用從米糠中提取的阿魏酰寡糖處理RAW 264.7細胞，其中的抗炎因子IL-10增加。NF-kB通路的異常激活會導(dǎo)致許多疾病，并且NF-kB異常激活的調(diào)控被認為是治療包括炎癥在內(nèi)的疾病的重要治療靶點。 Ajiboye等[45]研究發(fā)現(xiàn)丁香葉中400 mg/kg 濃度下的結(jié)合酚類化合物可通過降低炎癥信號通路NF-kB等實現(xiàn)較強的抗炎作用。鑒于上述情況，結(jié)合酚類化合物是有效治療炎癥的潛在物質(zhì)。

3.4 降血糖

糖尿病被稱為世界第五大健康殺手，已經(jīng)成為全球關(guān)注的人類疾病。糖尿病的特征是機體對胰島素不敏感，使血糖水平升高，同時還可能帶來多種并發(fā)癥進而威脅身體健康。α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶等在多糖代謝中的活性在糖尿病中起著至關(guān)重要的作用。但是在其治療過程中采用的藥物會引起一些不良反應(yīng)如腹部不適和脹氣。因此，尋找天然抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶等的物質(zhì)是目前的研究熱點。近些年研究發(fā)現(xiàn)，天然結(jié)合酚類化合物對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶等具有抑制作用，可以減少腸道內(nèi)單糖的吸收從而達到控制血糖的目的。

從谷物中提取的結(jié)合酚類化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用要強于α-淀粉酶，Wu等[46]從黑米、秈米和粳米3個品種米糠中提取的結(jié)合酚類化合物對α-淀粉酶的抑制率均高于相應(yīng)的游離酚類化合物，而除黑米外其他的結(jié)合酚類化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制率均高于游離酚類化合物，其粳米結(jié)合酚類化合物對α-葡萄糖苷酶的IC50為11.02 g/mL，黑米的結(jié)合酚類化合物對α-淀粉酶的IC50為103.42 g/mL，因此結(jié)合酚類化合物對α-葡萄糖苷酶的抑制優(yōu)于α-淀粉酶，抑制率隨含量的增加而增加。Yang等[47]用乙酸乙酯提取裸燕麥中的酯化結(jié)合酚類化合物相較于α-淀粉酶的抑制，對α-葡萄糖苷酶具有更強的抑制作用。谷物中的結(jié)合酚類化合物對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的不同抑制效果源于結(jié)合酚類化合物與α-葡萄糖苷酶活性位點有較高的親和力[48]。因此，谷物中提取的結(jié)合酚類化合物較強的α-葡萄糖苷酶抑制活性和溫和的α-淀粉酶抑制活性是降低血糖反應(yīng)和避免高度抑制α-淀粉酶使腸道中未消化淀粉產(chǎn)生發(fā)酵異常而引發(fā)腹脹等不良反應(yīng)的潛在物質(zhì)。谷物中提取的結(jié)合酚類化合物具有良好的調(diào)節(jié)血糖和維持機體健康的潛力。

結(jié)合酚類化合物除了對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶具有抑制作用外，還可以通過抑制其他途徑達到降低血糖的作用。從水楊樹中提取的結(jié)合酚類化合物對晚期糖基化結(jié)束(advanced glycation end, AGE)產(chǎn)生較強的抑制作用(IC50為(0.43±0.03) mg/mL)[49]，AGE是機體長期暴露在高糖環(huán)境中引起一種異常的生理變化，被認為與高血糖與糖尿病并發(fā)癥的主要發(fā)病機制有關(guān)，通過抑制AGEs的形成能夠緩解糖尿病并發(fā)癥，改善糖尿病患者的健康狀況。糖尿患者的腸道會在較短時間內(nèi)吸收較多的葡萄糖，而通過抑制患者腸道內(nèi)的葡萄糖轉(zhuǎn)運體，從而影響葡萄糖的吸收是一種有效治療方法，以Caco-2為模型研究腸道中葡萄糖的吸收，從小麥中提取的不溶性結(jié)合酚類化合物能抑制Caco-2模型對葡萄糖的吸收，并且葡萄糖攝取抑制程度與結(jié)合酚類化合物含量呈正相關(guān)[50]。因此，結(jié)合酚類化合物通過抑制導(dǎo)致血糖升高的消化酶(α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶)、異常生理變化和葡萄糖吸收從而達到降低血糖的效果，可作為有效降低血糖的潛在物質(zhì)應(yīng)用在特殊人群的食品中，并對其潛在抑制機制開展進一步研究。

4 結(jié)論

植物中廣泛分布的酚類化合物具有卓越的生理活性，而植物中的酚類化合物絕大部分的存在形式為與大分子物質(zhì)相互作用的結(jié)合型。近幾年，對于結(jié)合酚類化合物的研究越來越受到重視，深共熔溶劑法作為一種綠色環(huán)保的提取方式，使結(jié)合酚類化合物提取新方法得到進一步的開發(fā)。結(jié)合酚類化合物本身具有多種生理活性，如抗氧化、降血糖等，而所具有的生理活性要比游離酚類化合物更優(yōu)越。通過腸道體外模擬測試，發(fā)現(xiàn)其在大腸微生物和酶的作用下釋放并在不同的部位或器官上發(fā)揮活性。本文對結(jié)合酚類化合物現(xiàn)階段的研究進行了總結(jié)，為后續(xù)在抗氧化劑、防腐劑和功能食品添加劑等食品行業(yè)的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，以期為科學開發(fā)富含酚類化合物的產(chǎn)品提供更多參考。