甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留檢測方法研究進(jìn)展

郭芫君，黃 茜，王 鳥，占如意，陳露婷，郝香蘭，孟信剛

（1.景德鎮(zhèn)學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，江西景德鎮(zhèn) 334000；2.景德鎮(zhèn)市衛(wèi)生學(xué)校，江西景德鎮(zhèn) 333000；3.六盤水生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，貴州六盤水 553000）

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑是用天然抗生素Strobilurin A為先導(dǎo)物開發(fā)的新型殺菌劑。該類殺菌劑的作用包括防治多種作物病害、清除多種病害的病原菌，有低毒、廣譜性、內(nèi)吸性、高活性等特點(diǎn)[1]，活性基團(tuán)為甲氧基丙烯酸（酯/酰胺），作用機(jī)理是阻擋電子傳遞，抑制線粒體呼吸，進(jìn)而抑制真菌生長，對大多數(shù)真菌性病害具有較好的防治效果[2-3]，適用草坪及蔬菜、水果、谷類、核果類等植物[4]。該類殺菌劑是全球銷量額最高的殺菌劑[5]，2014年銷售額為37.43億美元[6]，在我國銷量也十分巨大[7]，但研究發(fā)現(xiàn)這類殺菌劑對環(huán)境和生物有負(fù)面影響，主要為農(nóng)作物表面的農(nóng)藥殘留難以清除[8]，并對哺乳動物、土壤生物群落存在一定生態(tài)毒性[9-11]。其對環(huán)境、生物及人類的危害需進(jìn)一步深入研究，因此，掌握其檢測方法是十分有必要的。筆者通過查閱標(biāo)準(zhǔn)、科研文獻(xiàn)等資料，闡述該類殺菌劑的種類、殘留量、檢測方法，以期為該類殺菌劑檢測技術(shù)的改進(jìn)和解決該類殺菌劑殘留問題提供參考。

1 甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的種類及其殘留限量

1969年，科學(xué)家MUSILEK等發(fā)現(xiàn)了抗真菌活性的物質(zhì)，并將其命名為Strobilurin A。以后，科學(xué)家們又研發(fā)出系列用Strobilurin A為先導(dǎo)物的殺菌劑，主要種類有吡唑醚菌酯、吡唑嘧菌酯、E-苯氧菌酯、Z-苯氧菌酯、丁香菌酯、啶氧菌酯、氟嘧菌酯、醚菌胺、醚菌酯、嘧菌胺、嘧霉胺、嘧菌酯、嘧螨酯、烯酰嗎啉、烯肟菌酯、肟菌酯、肟醚菌胺、肟嘧菌胺、唑菌胺酯等（圖1）。伴隨甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的大量應(yīng)用，接踵而至的殘留問題引起世界各國的重視，很多國家或國際組織制定了該類殺菌劑殘留限量條例。我國在《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)——食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[12]中也對甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑在谷物、油料或油脂、蔬菜、水果等農(nóng)產(chǎn)品種類中明確規(guī)定，如啶氧菌酯在稻谷中的最大殘留限量為0.20 mg/kg，在黃瓜中的最大殘留限量為0.50 mg/kg，在葡萄中的最大殘留限量為1.00 mg/kg；嘧菌酯在柑橘中的最大殘留限量為1.00 mg/kg，在蓮藕中的最大殘留限量為0.05 mg/kg，在玉米油中的最大殘留限量為0.10 mg/kg；醚菌酯在小麥中的最大殘留限量為0.05 mg/kg，在香蕉中的最大殘留限量為0.50 mg/kg。目前，甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑在水和土壤中的殘留限量值主要參照各類作物上的殘留限量值。

圖1 甲氧基丙烯酸酯類幾種具有代表性的殺菌劑

2 農(nóng)產(chǎn)品中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留的檢測方法

2.1 氣相色譜法在甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑檢測中的應(yīng)用

氣相色譜法（gas chromatography，GC）是色譜法的一種，常用于農(nóng)藥殘留檢測，多采用電子捕獲器（ECD）和氮磷檢測器（NPD）[13]。在氣相色譜法檢測甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留相關(guān)文獻(xiàn)中，樣品為含有大量色素、維生素、糖類、水分等物質(zhì)的柑橘、番茄、黃瓜等農(nóng)產(chǎn)品，為去除這些物質(zhì)和水分需對樣品進(jìn)行前處理（提取、分層、凈化），采用有機(jī)溶劑（乙腈、乙酸乙酯-環(huán)己烷）提取，氯化鈉、無水硫酸鎂等吸收水分。如吳潔珊等[14]對柑橘樣品經(jīng)乙腈提取鹽析，固相萃取小柱凈化，使用HP-5MS毛細(xì)管柱分離，GC-ECD檢測，結(jié)果表明，醚菌酯、肟菌酯、唑菌胺酯和烯肟菌酯在含量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)分別為 0.999 4、0.999 3、0.999 6、0.999 4；章虎等[15]對番茄、黃瓜樣品進(jìn)行乙腈提取鹽析，氟羅里硅土柱凈化，使用Varian VF-5MS柱，GC-ECD檢測，結(jié)果表明，醚菌酯、肟菌酯線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 4、0.999 8；薄海波等[16]對西蘭花、荷蘭豆樣品進(jìn)行乙酸乙酯、環(huán)己烷萃取，無水Na2SO4脫水，GC-NPD結(jié)果表明，嘧菌酯在西蘭花、荷蘭豆中的檢出限分別為0.005、0.010 mg/kg。對不同添加濃度進(jìn)行分析，測定添加回收率判斷氣相色譜法的準(zhǔn)確度。以上試驗(yàn)表明添加濃度多數(shù)大于0.01 mg/kg，添加回收率在75.0%～110.0%，符合添加濃度對回收率的要求；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）也均小于 15.0%（表 1）。

表1 氣相色譜法在檢測農(nóng)產(chǎn)品中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留的應(yīng)用

2.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀在甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑檢測中的應(yīng)用

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）檢測甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留相關(guān)文獻(xiàn)中，樣品為食用菌類及大米、番茄等農(nóng)產(chǎn)品，食用菌和大米含有大量的蛋白質(zhì)、淀粉、脂類等，所含基質(zhì)較為復(fù)雜，前處理方法可采用QuEChERS提取法和快速溶劑萃取法。在試驗(yàn)過程中也可對吸附劑的選擇進(jìn)行優(yōu)化[17]，如范良彪等[17]研究對比了C18、石墨化碳黑（GCB）和PSA 3種吸附劑的凈化效果，結(jié)果表明，C18、GCB吸附作用明顯但回收率偏低；PSA吸附劑對殺菌劑吸附較少且能較好地去除基質(zhì)效應(yīng)，檢測準(zhǔn)確度高，所以選擇PSA作為分散固相吸附劑；還對吸附凈化劑配比與用量在試驗(yàn)中采用正交設(shè)計法進(jìn)行了優(yōu)化，如徐鵬等[18]以回收率為指標(biāo)，采用正交設(shè)計三因素（GCB、C18、PSA）三水平，確定了吸附凈化劑的配比及用量為：GCB加入量為25 mg、PSA加入量為200 mg、C18的加入量為150 mg。研究人員還對質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，如鄭兆姍等[19]根據(jù)待測化合物保留時間和相應(yīng)的質(zhì)譜圖，確定了選擇性離子檢測（selected ion monitor，SIM）分析條件，吡唑醚菌酯、啶氧菌酯、氟嘧菌酯、醚菌酯、嘧菌酯、肟菌酯的保留時間分別為7.30、7.71、8.43、10.69、11.59、14.53 min。GC-MS 條件多為毛細(xì)管柱分離，電子轟擊離子源（electron impact ion source，EI）模式電離，質(zhì)譜多采用反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）或SIM模式。以上試驗(yàn)表明添加濃度多數(shù)大于0.01 mg/kg，添加回收率在70.0%～110.0%，添加濃度在0.001～0.010 mg/kg的試驗(yàn)也符合添加濃度對回收率的要求[20]。對相關(guān)試驗(yàn)進(jìn)行重復(fù)性檢測表明，氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有良好重復(fù)性、儀器精密度良好（表2）。

表2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀在檢測農(nóng)產(chǎn)品中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留的應(yīng)用

2.3 液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀在甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑檢測中的應(yīng)用

液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）殺菌劑殘留檢測以液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜和超高液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜為主。在運(yùn)用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測殺菌劑殘留相關(guān)文獻(xiàn)中，樣品為果蔬或果酒，樣品中有色素和糖類等共提取物，在試驗(yàn)中易產(chǎn)生干擾和基質(zhì)效應(yīng)，需配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行濃度校準(zhǔn)。試驗(yàn)提取劑多采用乙腈，并對凈化條件進(jìn)行優(yōu)化，采用氨基柱固相萃取或優(yōu)化后的QuEChERS提取法較多。為提高試驗(yàn)準(zhǔn)確度和精密度，還對前處理?xiàng)l件、色譜條件、質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化以及對標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行穩(wěn)定性研究，如王云鳳等[21]將果蔬樣品進(jìn)行乙腈提取、氯化鈉鹽析、固相萃取柱凈化、GCB凈化，采用大氣壓化學(xué)電離（atmospheric pressure chemical iosziaa-lion，APCI），SIM分析條件檢測，選擇離子為碎片離子、［M+H］+、［M+Na］+，試驗(yàn)靈敏度有所提高。徐瀟穎等[22]對3種凈化方法（凝膠固相萃取柱、氨基柱、QuEChERS）進(jìn)行凈化效果比較，結(jié)果表明，采用凝膠固相萃取柱凈化時，吡唑嘧菌酯、啶氧菌酯、氟嘧菌酯、嘧菌酯、醚菌酯、嘧螨酯、肟菌酯的回收率均低于其余兩種方法；氨基柱凈化時的結(jié)果精密度在1.0%～5.2%，QuEChERS方法凈化時的結(jié)果精密度在2.1%～6.9%，選擇氨基柱凈化。果蔬樣品也可以進(jìn)行乙腈提取，氨基柱凈化，電噴霧電離（electrospray ionization，ESI），正離子模式電離，MRM模式檢測，如黃笑晨等[23]比較了乙腈∶水和甲醇∶水分別為流動相時對待測農(nóng)藥分離效果的影響，結(jié)果表明，乙腈∶水作為流動相時的靈敏度高于甲醇∶水且分離效果好，選擇乙腈∶水為流動相。果酒樣品以乙腈提取，C18、無水MgSO4凈化，在ESI+模式下電離，MRM模式檢測時，添加濃度水平為0.001～0.050 mg/kg，添加回收率在70.0%～110.0%，RSD均小于20.0%。周瑤等[24]優(yōu)化質(zhì)譜條件，調(diào)節(jié)錐孔電壓、毛細(xì)管電壓等參數(shù)后進(jìn)行子離子掃描，優(yōu)化碰撞能量，每個化合物選擇2個子離子，以響應(yīng)值高的子離子作為定量離子。果蔬樣品以乙腈提取，固相萃取柱凈化，ESI+模式電離，MRM模式檢測吡唑醚菌酯、E－苯氧菌胺、啶氧菌酯、嘧菌酯、醚菌酯、肟菌酯在橙子、香蕉、蘋果、菠蘿中的回收率為60.4%～120.0%，RSD為2.15%～15.10%（表3）。

表3 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜在檢測農(nóng)產(chǎn)品中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留的應(yīng)用

2.4 高效液相色譜法在甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑檢測中的應(yīng)用

在運(yùn)用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留的相關(guān)文獻(xiàn)中，梁沛等[25]在前處理技術(shù)上進(jìn)行創(chuàng)新，采用分散微固相萃取技術(shù)，以石墨烯作為分散微固相萃取吸附材料，進(jìn)行萃取富集和凈化；曾啟華等[26]選擇樣品為果汁、香蕉、雞肉組織（雞肝、雞腎和雞肉），前處理采用三氯甲烷等，乙腈凈化洗脫，利用色譜柱分離，對波長、流動相、流速的選擇進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，225 nm為最適檢測波長、流動相為乙腈∶水、0.6 mL/min為最佳流速；王素茹等[27]將香蕉和土壤樣品經(jīng)乙腈提取、氯化鈉鹽析，固相萃取柱凈化，正己烷淋洗NH2小柱，正己烷∶丙酮洗脫。以上試驗(yàn)表明，添加濃度均大于0.010 mg/kg，添加回收率在70.0%～110.0%，RSD均小于15.0%（表4）。

表4 高效液相色譜法在檢測農(nóng)（畜）產(chǎn)品中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留的應(yīng)用

2.5 其他方法

采用其他方法檢測甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留在國外文獻(xiàn)中也有報道，如酶聯(lián)免疫吸附分析法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 結(jié)合QuEChERS法建立一種檢測殘留量的方法；采用環(huán)境電離技術(shù)，解吸電噴霧（desorption electrospray ionization，DESI） 源耦合線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜（lon-trap tandem mass spectrometry，LT MS） 和直接分析實(shí)時（direct analysis of real-time，DART）離子源耦合飛行時間質(zhì)譜（time of flight mass spectrometer，TOFMS）并與LC-MS/MS方法對比；采用近紅外光譜法（near-infrared spectroscopy，NIRS）測定殘留量。以上試驗(yàn)添加回收率為70.0%～110.0%，符合添加濃度對回收率的要求[28-30]（表5）。

表5 其他方法在檢測農(nóng)產(chǎn)品中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留的應(yīng)用

3 生態(tài)環(huán)境（水環(huán)境、土壤環(huán)境）中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留的檢測方法

王璐芳等[31]將土壤樣品經(jīng)乙腈提取，PSA和C18凈化，C18色譜柱分離，ESI+模式電離，MRM模式測定，UPLC-MS/MS檢測丁香菌酯、肟菌酯、唑菌酯、醚菌胺、醚菌酯、啶氧菌酯、氯啶菌酯、氟嘧菌酯、E-苯氧菌胺、烯肟菌胺、肟醚菌胺在不同植被類型土壤的殘留量。試驗(yàn)結(jié)果表明，檢測的這些殺菌劑的平均回收率為65.1%～103.9%，RSD為0.082%～14.000%。郭敏等[32]將土壤樣品降解，批平衡法和HPLC法進(jìn)行吸附試驗(yàn)，結(jié)果表明，HPLC法測定啶氧菌酯和肟菌酯在土壤、地下水中的回收率為74.4%～93.9%，RSD為3.80%～11.5%。付樹卿[33]將農(nóng)田水樣品采用SPE方法進(jìn)行富集和凈化，二氯甲烷提取，GC-MS/MS檢測農(nóng)田灌溉水中啶氧菌酯殘留量。試驗(yàn)結(jié)果顯示，檢測樣品的回收率大于82.00%，RSD小于1.90%。吳潤[34]經(jīng)丙酮提取、甲醇定容，弗羅里硅土柱凈化，C18柱分離，液相色譜建立土壤中的嘧菌酯的測定方法，結(jié)果表明，嘧菌酯在土壤中的回收率為88.82%～94.21%，RSD為2.56%～6.22%。李彩霞等[35]將土壤樣品經(jīng)乙腈提取，氯化鈉鹽析，正己烷定容，氣相色譜GC-ECD檢測，結(jié)果表明，醚菌酯在土壤中的回收率為88.00%～109.00%，RSD小于2.4%。

4 結(jié)論與展望

4.1 結(jié)論

筆者綜述了農(nóng)產(chǎn)品和生態(tài)環(huán)境（水環(huán)境、土壤環(huán)境）中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留的檢測方法。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的前處理多采用乙腈、乙酸乙酯作為提取劑；QuEChERS方法前處理方法以C18、PSA、GCB、無水 MgSO4為凈化劑，相比常規(guī)凈化處理更加快捷、高效且無害，該前處理方法的推廣也會減輕檢驗(yàn)工作量。在相關(guān)文獻(xiàn)中，研究人員采用正交設(shè)計法進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，對前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，以求試驗(yàn)的高精確度和準(zhǔn)確度。儀器分析方面，國內(nèi)文獻(xiàn)多采用GC、GC-MS或LC-MS/MS檢測；HPLC檢測對甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的回收率低于GC、GC-MS或LC-MS/MS，因此，較少采用。國外文獻(xiàn)中提到的 ELISA、DART-TOF MS、DESI-LIT MS、NIRS等方法，雖然技術(shù)新穎先進(jìn)，但技術(shù)不太成熟、靈敏度低且成本高，還有待改進(jìn)，在國內(nèi)的應(yīng)用較少。

4.2 展望

甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑對環(huán)境有較好的相容性，國內(nèi)外對農(nóng)產(chǎn)品的殘留檢測試驗(yàn)較多，而在生態(tài)環(huán)境方面的研究相對較少，甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑對于環(huán)境的危害尚不明確。筆者認(rèn)為不僅要關(guān)注甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑在食品安全方面的危害，還要關(guān)注其在生態(tài)安全方面的危害。雖然該類殺菌劑對環(huán)境有較好的相容性，但前文也指出其對農(nóng)產(chǎn)品和生態(tài)環(huán)境（水環(huán)境、土壤環(huán)境）存在一定的生態(tài)毒性。隨著我國乃至全世界對農(nóng)藥殘留越來越嚴(yán)格的管理，為了食品安全健康和生態(tài)環(huán)境良好，政府對檢測機(jī)構(gòu)的投入越來越多，對于ELISA、DART-TOF MS、DESI-LIT MS、NIRS等國內(nèi)研究較少的技術(shù)，應(yīng)加強(qiáng)研究，從而使其檢測技術(shù)體系更加完備。筆者對甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留檢測的建議：一是加強(qiáng)對生態(tài)環(huán)境中甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的殘留檢測，生態(tài)安全與食品安全同樣重要；二是加大對新興技術(shù)的研究力度，積極引入國外先進(jìn)技術(shù)并且加強(qiáng)國內(nèi)外交流；三是完善對甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑殘留限量的管理制度。