紅鈴蟲成蟲對4 種中藥材提取物的電生理及嗅覺反應(yīng)

尹海辰，許冬，武懷恒，叢勝波，楊甜甜，萬鵬

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華中作物有害生物綜合治理重點試驗室/ 農(nóng)作物重大病蟲草害防控湖北省重點試驗室/ 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所，武漢 430064）

紅鈴蟲（Pectinophora gossypiella），屬鱗翅目（Lepidoptera）麥蛾科（Gelechiidae），是世界上十分重要的棉花害蟲之一[1]。21 世紀(jì)以前，紅鈴蟲在我國長江流域棉區(qū)為害十分嚴(yán)重，導(dǎo)致棉花產(chǎn)量損失10%～30%，嚴(yán)重影響了我國棉花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。 2000 年后，我國長江流域開始種植轉(zhuǎn)cry1Ac基因棉花，使紅鈴蟲的發(fā)生與危害得到了有效抑制[3]。然而，在印度、巴基斯坦等國家，因為沒有很好地執(zhí)行庇護(hù)所策略，目前已有紅鈴蟲對抗蟲棉產(chǎn)生抗性的相關(guān)報道，例如在印度，紅鈴蟲對轉(zhuǎn)cry1Ac＋cry2Ab棉的抗性已被證實普遍存在[4]。因此，開展紅鈴蟲綜合防控技術(shù)研究對于延緩其抗性發(fā)展具有十分重要的意義。

寄主植物產(chǎn)生的次生代謝物能夠影響昆蟲對寄主植物的發(fā)現(xiàn)、識別、定位、取食、產(chǎn)卵等行為[5-8]。 利用這一特性開發(fā)的各種引誘和驅(qū)避技術(shù)，已成為害蟲監(jiān)測與防治中極具應(yīng)用前景的新技術(shù)[9-10]。充分利用各類植物資源是研發(fā)此類技術(shù)的基礎(chǔ)。 在我國，中草藥是一類重要的植物資源，能產(chǎn)生極其豐富的次生代謝物，是開發(fā)各類昆蟲引誘或驅(qū)避劑的良好原材料。 目前雖未見紅鈴蟲危害中藥材植物的報道，但已有研究證實一些中藥材提取物可以引起棉田害蟲如綠盲蝽（Apolygus lucorum）和中黑盲蝽（Adelphocoris suturalis）的嗅覺反應(yīng)[11]。 本研究以香氣濃郁的4 種中藥材植物花 椒 （Zanthoxylum bungeanum）、 黃 柏（Cortex phellodendri）、云木香（Saussurea costus）、五倍子（Rhus chinensis）的主要藥用部位提取物為對象，研究了紅鈴蟲對這些提取物的電生理和嗅覺反應(yīng)， 并選擇鱗翅目害蟲常見引誘劑芳樟醇與這4種中草藥提取物進(jìn)行復(fù)配， 進(jìn)一步提升嗅覺反應(yīng)，以期為紅鈴蟲監(jiān)測與防治新技術(shù)的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

4 種供試中草藥原材料為風(fēng)干的云木香（根）、花椒（果實）、五倍子（蟲癭）、黃柏（樹皮），均采購自湖北省武漢市中藥材市場。 無水乙醇（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%）采購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，芳樟醇（質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）采購自羅恩化學(xué)品試劑公司。

本研究所用的紅鈴蟲采集自湖北省武漢市、鄂州市等地棉田，在室內(nèi)（26±1）℃、光周期（光/暗時間）16 h/ 8h、相對濕度60%條件下用人工飼料[12]飼養(yǎng)多代。 觸角電位與嗅覺反應(yīng)試驗選用1～3 日齡健康紅鈴蟲成蟲，試驗開始前將供試棉鈴蟲（試蟲）饑餓處理4 h。

1.2 儀器

所用觸角電位儀采購自Syntech 公司（德國）， 信號控制器為IDAC-2， 氣味源控制器為CS-55。

1.3 方法

1.3.1供試中草藥提取物的制備。 中草藥提取物制備方法參考李秀梅等[13]的報道，并有所改進(jìn)。將風(fēng)干的中藥材用粉碎機(jī)磨制成干粉， 稱取100 g粉末置于250 mL 無水乙醇中室溫密封浸泡15 d后用布氏漏斗過濾，濾去藥渣后獲得上清液。 將上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45 ℃、20～30 r·min-1條件下水浴加熱蒸干溶劑，獲得提取物，并保存于4 ℃冰箱中備用。

1.3.2紅鈴蟲觸角電位圖（electroantennogram,EAG）試驗。 試驗方法參考董文霞等[14]的報道，并有所改進(jìn)。 測定時用無水乙醇將提取物稀釋為15 g·L-1和1.5 g·L-1，對照組為無水乙醇。 取15 μL 溶液滴于30 mm×10 mm 的濾紙上，將濾紙塞入1 000 μL 移液槍槍頭中，連接刺激氣體控制裝置。 保持送氣管管口與觸角縱向垂直，并與觸角相距10 mm 左右。用解剖刀從基部切下雌性和雄性成蟲的整個觸角， 并切除少量觸角尖端。將直徑約0.2 mm 的銀絲電極插入到玻璃毛細(xì)管中， 電極內(nèi)徑注入適量濃度為0.9 mol·L-1的電生理鹽水。 將切下的觸角連接于2 個電極上，每次刺激時間為0.5 s，2 次刺激之間間隔30 s，以保證觸角感覺器感覺功能的完全恢復(fù)。 每種提取物與對照溶液交替刺激觸角，取前后對照的平均值作為該提取物每次刺激值的對照值。 雌性和雄性紅鈴蟲各測試8 根觸角，每根觸角用每種提取物刺激3 次。 采用成蟲對提取物的觸角電位反應(yīng)幅度除以前后對照的平均值來計算EAG 反應(yīng)的相對值。

1.3.3紅鈴蟲嗅覺反應(yīng)試驗。 將2 個直徑4 cm、高3 cm 的圓形養(yǎng)蟲盒（開口向上）放入長、寬、高分別為20 cm、15 cm、5 cm 的長方形塑料養(yǎng)蟲盒兩端，并在圓形養(yǎng)蟲盒內(nèi)放入1 張濾紙。 將花椒或云木香提取物用30 μL 無水乙醇溶解成糊狀，再用無菌水將其稀釋為15 g·L-1， 將1 mL 提取物溶液加入其中1 個圓形養(yǎng)蟲盒內(nèi)作為處理組，對照組為30 μL 無水乙醇用無菌水稀釋為1 mL，加入另一端的圓形養(yǎng)蟲盒內(nèi)。 每日17：00 將20頭雌性或雄性紅鈴蟲成蟲冷昏迷后放入長方形養(yǎng)蟲盒正中間處，為防止養(yǎng)蟲盒兩側(cè)氣味聚集在盒底部相互混合產(chǎn)生干擾，盒頂部用透氣紗布覆蓋，使提取物氣味可以自由揮發(fā)至盒外。 試驗在黑暗環(huán)境中進(jìn)行，次日08：00 觀察記錄成蟲選擇情況，成蟲進(jìn)入裝有某一氣味源的圓形養(yǎng)蟲盒內(nèi)或位于反應(yīng)區(qū)則記為對該氣味源產(chǎn)生選擇反應(yīng)（圖1）。 為防止氣味源方向或試蟲個體差異造成的影響，本試驗重復(fù)6 次，共計測試雌蟲和雄蟲各120 頭，每次重復(fù)均更換一批新試蟲，并更換處理組氣味源與對照組氣味源方向，每次試驗結(jié)束后將養(yǎng)蟲盒用無水乙醇擦洗。

圖1 嗅覺反應(yīng)試驗裝置示意圖Fig. 1 Schematic diagram of olfactory response experiment device

1.3.4棉花植株對提取物引誘作用的影響。 選擇1.3.3 試驗中篩選出的具有引誘作用的提取物，測試其在存在寄主植物棉花葉片氣味條件下對紅鈴蟲的引誘作用。 將2 個金字塔形養(yǎng)蟲籠（底面25 cm×25 cm，高度40 cm，外部覆蓋透氣紗布）用玻璃管（長20 cm，直徑10 cm）連接（圖2）。 其中1 個養(yǎng)蟲籠內(nèi)放入1 盆棉花苗期植株，另一籠中放入1 張白色黏蟲板（20 cm×15 cm）。 處理組為提取物按照1.3.3 試驗中方法溶解后， 取100 μL于1.5 mL 離心管（EP 管）內(nèi)，對照組為100 μL 清水， 將裝有提取物或清水的EP 管放置于黏蟲板中心處。 每次試驗將10 頭冷昏迷的紅鈴蟲雌蟲或雄蟲放于玻璃管中央處，每個提取物或?qū)φ战M均重復(fù)試驗8 次，共測試雌蟲和雄蟲各80 頭。 試驗在黑暗環(huán)境中進(jìn)行， 每日17：00 開始試驗，次日08：00 結(jié)束。 記錄在有寄主植物氣味條件下，帶有提取物的黏蟲板和清水對照黏蟲板分別誘捕到的紅鈴蟲數(shù)量。

圖2 寄主植物對提取物引誘效果影響試驗裝置示意圖Fig. 2 Schematic diagram of the device for the influence of host plants on the attractive effect of extracts

1.3.5提取物與芳樟醇不同比例復(fù)配的增效作用。 為了進(jìn)一步提升引誘效果，選擇鱗翅目害蟲常見引誘劑芳樟醇與花椒提取物進(jìn)行復(fù)配。 將花椒提取物配制成15 g·L-1的溶液，與芳樟醇原液按照9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9（體積比，下同）復(fù)配得到復(fù)配劑，以蜂蜜水為對照組，進(jìn)行氣味選擇試驗，試驗方法同1.3.3。

1.3.6紅鈴蟲對復(fù)配劑、提取物和芳樟醇的嗅覺反應(yīng)試驗。 為驗證復(fù)配劑增效作用，檢驗復(fù)配劑對紅鈴蟲的引誘作用是否高于2 種單劑， 選擇1.3.5 篩選出的復(fù)配劑分別與花椒提取物和芳樟醇原液2 種單劑進(jìn)行氣味選擇試驗，分為復(fù)配劑與花椒提取物、 復(fù)配劑與芳樟醇原液2 類處理。其余方法同1.3.3。

1.4 數(shù)據(jù)處理

參照周麗梅等[15]方法計算選擇反應(yīng)率（RSR），公式：RSR（%）＝N1/（N1＋N0）×100%。 式中，N1為處理組氣味源蟲數(shù)，N0為對照組氣味源蟲數(shù)。

紅鈴蟲對4 種中藥材提取物的EAG 反應(yīng)相對值，以及花椒提取物與芳樟醇不同比例復(fù)配劑的RSR采用單因素方差分析和最小顯著差數(shù)法進(jìn)行多重比較。 紅鈴蟲雌雄蟲對花椒和云木香提取物的嗅覺反應(yīng)， 以及復(fù)配劑增效作用的驗證，均采用卡方檢驗對處理組與對照組蟲數(shù)進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)處理利用SPSS 17.0 軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅鈴蟲觸角EAG 反應(yīng)

由圖3 可知， 當(dāng)氣味源質(zhì)量濃度為15 g·L-1時， 由花椒提取物引起的雌雄蟲觸角EAG 反應(yīng)相對值均最高，分別為1.89 和1.56，顯著高于其他提取物引起的雌蟲和雄蟲觸角EAG 反應(yīng)；云木香提取物引起的雄蟲觸角EAG 反應(yīng)相對值極顯著高于五倍子提取物。

圖3 紅鈴蟲對4 種中草藥提取物的觸角電位圖（EAG）反應(yīng)相對值Fig. 3 Relative electroantennogram (EAG) values of P. gossypiella antennas to extracts from four Chinese herbal medicines

經(jīng)方差分析， 當(dāng)氣味源質(zhì)量濃度降低到1.5 g·L-1時，4 種提取物引起的雌蟲 [F（3, 28）＝1.69＜F0.05（3, 28）＝2.95]和雄蟲觸角[F（3, 28）＝0.97＜F0.05（3, 28）＝2.95）] EAG 反應(yīng)相對值間均無顯著差異。

2.2 紅鈴蟲嗅覺反應(yīng)

根據(jù)2.1 結(jié)果，選擇EAG 反應(yīng)相對值較高的花椒和云木香提取物進(jìn)行嗅覺反應(yīng)試驗。 經(jīng)卡方檢驗，相對于對照組，花椒提取物對紅鈴蟲雌雄蟲均有極顯著的引誘作用（χ2雌蟲＝26.92＞χ20.01＝6.64，χ2雄蟲＝66.28＞χ20.01＝6.64），120 頭供試紅鈴蟲中分別有76 頭雌蟲和89 頭雄蟲選擇了花椒提取物，選擇反應(yīng)率分別為67.26%和76.72%。云木香提取物對于紅鈴蟲雄蟲具有極顯著的引誘作用（χ2＝44.37＞χ20.01＝6.64），供試雄蟲有84頭選擇了云木香提取物， 選擇反應(yīng)率為71.19%，但雌蟲則對云木香提取物的嗅覺反應(yīng)不明顯（χ2＝0.442＜χ20.05＝3.84）。

2.3 棉花植株對提取物引誘作用的影響

根據(jù)2.2 試驗結(jié)果， 由于云木香對紅鈴蟲雌蟲引誘作用不明顯，因此本試驗設(shè)置花椒引誘雌蟲、雄蟲以及云木香引誘雄蟲3 個處理。 在棉花植株氣味干擾下，共有38 頭雌蟲被花椒誘捕，10頭雌蟲被清水對照誘捕；對于雄蟲，有42 頭被花椒誘捕，9 頭被清水對照誘捕。 經(jīng)卡方檢驗，相比于清水對照，花椒提取物具有極顯著的引誘作用（χ2雌蟲＝32.67 ＞χ20.01＝6.64，χ2雄蟲＝42.71 ＞χ20.01＝6.64）。 云木香提取物對雄蟲也具有顯著的引誘作用（χ2＝25.04＞χ20.01＝6.64），共誘捕了40頭， 而清水對照僅誘捕到14 頭。 從誘捕數(shù)量來看，2 種提取物與棉花葉片引誘效果相當(dāng)， 因此須篩選具有增效作用的復(fù)配劑， 進(jìn)一步提升提取物引誘效果。

2.4 提取物與芳樟醇不同比例復(fù)配的增效作用

經(jīng)方差分析，花椒提取物與芳樟醇不同配比對雄性[F（8, 45）＝6.783＞F0.05（8, 45）＝2.15]和雌性紅鈴蟲[F（8, 45）＝5.999＞F0.05（8, 45）＝2.15]的選擇反應(yīng)率有顯著影響。 如圖4 所示，當(dāng)花椒提取物與芳樟醇體積比為7∶3、6∶4、5∶5 時，雄性紅鈴蟲的選擇反應(yīng)率分別為68.89%、72.22%和70.00%，均顯著高于其他復(fù)配比例。 對于雌性紅鈴蟲而言， 當(dāng)花椒提取物與芳樟醇體積比為3∶7 和2∶8 時， 雌性紅鈴蟲的選擇反應(yīng)率高于其他配比， 其中當(dāng)體積比為3∶7 時最高，為68.55% 。

圖4 花椒提取物與芳樟醇按不同比例復(fù)配后的引誘作用比較Fig. 4 Attractive effect of Z. bungeanum extract mixed with linalool in different proportions

2.5 紅鈴蟲對復(fù)配劑、提取物和芳樟醇的嗅覺選擇試驗

根據(jù)復(fù)配增效試驗結(jié)果，分別選擇對雌蟲引誘效果最好的和對雄蟲引誘效果最好的復(fù)配比例，檢驗其增效作用。 經(jīng)卡方檢驗可知，花椒提取物與芳樟醇復(fù)配劑（3∶7）對雌蟲的引誘效果均顯著高于單一的花椒提取物（χ2＝6.353＞χ20.05＝3.84）和芳樟醇（χ2＝4.29＞χ20.05＝3.84）；而花椒提取物與芳樟醇復(fù)配劑（6∶4）對雄蟲的引誘效果則極顯著高于花椒提取物單劑（χ2＝8.96＞χ20.01＝6.64）， 并且顯著高于芳樟醇 （χ2＝4.74＞χ20.05＝3.84）。 表明相比于單劑，2 種復(fù)配比例均具有顯著的增效作用。

3 討論與結(jié)論

篩選對昆蟲具有嗅覺反應(yīng)活性的植物資源是昆蟲驅(qū)避劑和引誘劑開發(fā)的基礎(chǔ)[16-18]，其中對一些具有強(qiáng)烈特殊香氣的中藥材植物的研究已取得一些成果。 目前主要研究了此類植物的驅(qū)避活性，例如茆國鋒等[19]研究表明白木香（Aquilaria sinensis） 精油在一定質(zhì)量濃度范圍可對褐飛虱（Nilaparvata lugens）雌成蟲表現(xiàn)出明顯的驅(qū)避作用；而花椒精油也被證實對B 型煙粉虱（Bemisia tabaci）具有驅(qū)避作用[20]。然而本研究結(jié)果表明，云木香和花椒這2 種非寄主中草藥提取物對紅鈴蟲具有引誘作用。 前人研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲有時也會被非寄主植物所吸引，如張獻(xiàn)英等[21]報道了洋蔥（Allium cepa） 鱗莖揮發(fā)物對褐飛虱的引誘作用。 Zhang 等[22]則發(fā)現(xiàn)暗黑鰓金龜（Holotrichia parallela）在田間會被非寄主植物蓖麻（Ricinus communis）所吸引，且蓖麻氣味可提高雌雄成蟲的抱對率和飛行活動能力。 因此，在篩選引誘劑時，也不應(yīng)忽視一些非寄主植物資源。

根據(jù)前人研究，我們推測花椒和云木香提取物中的揮發(fā)物與紅鈴蟲寄主植物揮發(fā)物可能存在一定的相似性。 研究表明花椒果實揮發(fā)物中含有大量的檸檬烯和月桂烯[23]，而這些化合物在許多亞洲棉 （Gossypium arboreum） 和陸地棉（G.hirsutum）中均存在，如石遠(yuǎn)321、SGK321、遼陽多毛棉等，這類化合物還可以引起一些棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）、 綠盲蝽等害蟲的電生理反應(yīng)，具有較強(qiáng)的引誘作用[24]。云木香揮發(fā)物中也含有對棉花害蟲具有吸引作用的鄰苯二甲酸二乙酯[25-26]。 然而，目前有關(guān)中草藥植物揮發(fā)物對紅鈴蟲引誘作用的研究仍相對較少，因此未來應(yīng)進(jìn)一步明確云木香和花椒提取物中對紅鈴蟲有引誘作用的具體有效成分，這對于這2 種中草藥的開發(fā)與利用具有重要意義。

芳樟醇是一種廣泛存在于植物揮發(fā)物中的化合物，在花椒和棉花揮發(fā)物中也存在，并已發(fā)現(xiàn)其對多種害蟲有引誘活性[24-25,27]。例如劉永梅等[28]研究表明10 μL 的50 g·L-1芳樟醇處理可以引起4 齡飛蝗（Locusta migratoria）強(qiáng)烈的電生理反應(yīng)，10 μL 的100 g·L-1芳樟醇處理對飛蝗雌雄蟲均有顯著的引誘作用；此外，李曉峰等[29]則發(fā)現(xiàn)將芳樟醇與鄰苯二甲酸二丁酯和順-3- 己烯基乙酸酯制成復(fù)配劑對華北大黑鰓金龜（Holotrichia oblita）雄成蟲有較好的引誘效果。 將多種引誘劑組合成復(fù)配劑是提高引誘劑引誘效果的重要手段[16]，復(fù)配劑的引誘效果與復(fù)配比例有很大關(guān)系[28,30]。 因此，本研究將花椒提取物與芳樟醇進(jìn)行復(fù)配，并篩選出了最佳復(fù)配比例，在該配比下的嗅覺選擇試驗中紅鈴蟲對復(fù)配劑的選擇性均高于花椒提取物和芳樟醇單劑，這表明添加芳樟醇有助于提升花椒提取物的引誘效果。 此外，這種增效作用、最佳復(fù)配比例與紅鈴蟲性別有關(guān)：復(fù)配劑中芳樟醇比例適當(dāng)升高對雌蟲引誘效果增強(qiáng)， 配比為3∶7 時對雌蟲的引誘效果最強(qiáng)；而復(fù)配劑中花椒提取物比例較高時則對雄蟲引誘作用較高， 配比為6∶4 時對雄蟲引誘作用最強(qiáng)。 這表明紅鈴蟲雌雄蟲之間存在嗅覺反應(yīng)差異，在寄主選擇過程中對寄主揮發(fā)物中不同氣味的反應(yīng)各有側(cè)重。 然而目前對于紅鈴蟲嗅覺機(jī)理的研究較少，對于該蟲寄主定位過程中究竟哪些化合物發(fā)揮了作用仍不明確，因此這種復(fù)配劑的增效作用原理仍有待研究。

綜上所述，本研究通過一系列室內(nèi)試驗初步篩選出了2 種對紅鈴蟲有較高活性的引誘劑配方，對紅鈴蟲的防治具有潛在的應(yīng)用價值。 近年來中草藥植物在農(nóng)業(yè)病蟲害防治領(lǐng)域的作用日益受到關(guān)注[19,31]，本研究的發(fā)現(xiàn)也可為中藥材資源利用開發(fā)提供依據(jù)。 但由于田間環(huán)境的復(fù)雜性，本研究篩選的引誘劑仍需田間試驗進(jìn)一步檢驗引誘效果。