吳松，郝小康，張振華，高曉，杜偉平

（1.三二〇一醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗科，陜西 漢中 723000；2.西藏民族大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗科，陜西 咸陽 712082；3.三二〇一醫(yī)院 心胸外科，陜西 漢中 723000；4.陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院 病理科，陜西 咸陽 712000；5.延安大學(xué)附屬醫(yī)院 檢驗科，陜西 延安 716000）

肺癌是全球常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，每年發(fā)病患者約180 萬例，死亡約159 萬例[1]。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是肺癌最常見的類型。雖然分子靶向治療及免疫治療等改善了NSCLC 患者的生存預(yù)后，但5年總體生存率仍較差，僅20%左右[2]。NEDD4 樣E3 泛素蛋白連接酶（NEDD4L）的編碼基因位于18q21.31，其編碼蛋白屬于HECT 域E3 泛素連接酶的NEDD4 家族成員，能將E2 泛素結(jié)合酶轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)底物，從而降解特定蛋白質(zhì)進(jìn)行溶酶體[3]。有研究表明，NEDD4L 在腫瘤中發(fā)揮抑制腫瘤的功能，通過抑制促癌因子（如缺氧誘導(dǎo)因子1α）的表達(dá)，抑制惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，在胃癌及卵巢癌等惡性腫瘤中NEDD4L表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展[4-5]。UNC-51 樣激酶1（ULK1）編碼基因位于12q24.33，編碼蛋白參與ULK1 復(fù)合物構(gòu)成，整合不同磷酸化和泛素化的信號傳導(dǎo)，是促進(jìn)自噬起始的主要因子[6]。有研究表明，腫瘤中ULK1作為一種促癌基因，在乳腺腺癌、胃癌等惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，能使磷脂酰肌醇3 激酶復(fù)合物磷酸化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖[7-8]。本研究通過檢測NSCLC 癌組織中NEDD4L、ULK1 的表達(dá)，初步探討兩者的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年1月—2018年1月三二〇一醫(yī)院收治的88 例NSCLC 患者作為研究對象。其中男性55例，女性33例；年齡36～79歲，平均（59.2±7.8）歲；病理類型：腺癌60 例，鱗癌28 例；腫瘤直徑≤5 cm 52例，＞5 cm 36例；腫瘤TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期57 例，Ⅲ期31例。病理分級：高中分化49例，低分化39 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移19 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移69 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理組織學(xué)檢查明確診斷為NSCLC，由2 位病理科醫(yī)師共同診斷；②初次診治，無放化療、靶向治療史；③臨床及隨訪資料完整；④患者和家屬對本研究知情同意，能夠配合完成隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴肺炎等感染性疾病或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫系統(tǒng)疾?。虎诎槠渌麗盒阅[瘤；③心肺器官衰竭，體能狀態(tài)較差，KPS 評分＜70分。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過。

1.2 主要試劑和儀器

兔單克隆NEDD4L 抗體、兔單克隆ULK1 抗體購自美國Abcam 公司，二步法免疫組織化學(xué)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，顯微鏡購自日本Olymbus 株式會社。

1.3 方法

將癌組織和癌旁組織放入10%甲醛溶液中固定24 h。石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟2遍，10 min/次，梯度酒精脫水，每個梯度5 min。切片放入檸檬酸緩沖液中微波爐加熱至煮沸，維持5 min 抗原熱修復(fù)。避光室溫滴加3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶，一抗4℃避光過夜（NEDD4L 稀釋比1∶500，ULK1 稀釋比1∶400），二抗室溫30 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色30 s，蘇木素核染2 min，鹽酸酒精分化5 s，梯度酒精脫水，中性樹脂封片。200 倍顯微鏡下觀察陽性表達(dá)部位的染色強度和范圍，染色評分根據(jù)染色強度（0 分為無染色，1 分為染色淺，2 分為染色深）和染色面積（0 分為≤25%，1 分為＞25%～＜50%，2 分為≥50%）的乘積評估。總分＜2 分為陰性表達(dá)，≥2 分為陽性表達(dá)。應(yīng)用R 語言分析癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫中NSCLC 及其癌旁組織中NEDD4L 和ULK1 mRNA 的表達(dá)差異?；颊唠S訪3～36 個月，平均（30.1±4.3）個月。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗，非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距[M（P25，P75）]表示，比較用Mann-WhitneyU檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗；相關(guān)性分析用Spearman 法；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較用log-rank χ2檢驗；影響因素的分析用單因素或多因素Cox 回歸模型。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC 癌組織與癌旁組織中NEDD4L、ULK1 mRNA相對表達(dá)量比較

NSCLC 癌組織與癌旁組織中NEDD4L mRNA 相對表達(dá)量分別為4.32 （3.62，5.02）、5.46 （5.14，5.79），ULK1 mRNA 分別為4.63（3.92，5.35），4.27（3.98，4.56），經(jīng)Mann-WhitneyU檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=8.433 和3.793，均P=0.000），癌組織NEDD4L mRNA 相對表達(dá)量低于癌旁組織，ULK1 mRNA 相對表達(dá)量高于癌旁組織。見圖1。

圖1 NSCLC癌組織與癌旁組織NEDD4L、ULK1 mRNA相對表達(dá)量比較

2.2 NSCLC癌組織與癌旁組織中NEDD4L、ULK1蛋白表達(dá)及陽性表達(dá)率比較

NSCLC 癌組織中NEDD4L 陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，ULK1 陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞核（見圖2）。癌組織中NEDD4L 的陽性表達(dá)率為26.1%（23/88），癌旁組織為73.9%（65/88），經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=40.091，P=0.000），癌組織低于癌旁組織。癌組織中ULK1 的陽性表達(dá)率為75.0%（66/88），癌旁組織為25.0%（22/88），經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=44.000，P=0.000），癌組織高于癌旁組織。

圖2 癌組織NEDD4L、ULK1蛋白表達(dá) （×200）

2.3 不同臨床特征患者的癌組織中NEDD4L、ULK1陽性表達(dá)率比較

有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不同TNM 分期患者的癌組織NEDD4L、ULK1 陽性表達(dá)率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。其余指標(biāo)的NEDD4L、ULK1 陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同臨床特征患者的癌組織中NEDD4L、ULK1陽性表達(dá)率比較 例（%）

2.4 NSCLC患者NEDD4L與ULK1表達(dá)的相關(guān)性

Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，NEDD4L 與ULK1 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.587，P=0.000）。

2.5 癌組織中NEDD4L和ULK1表達(dá)對NSCLC患者生存預(yù)后影響

隨訪期間死亡32 例，3年總體生存率為63.6%（56/88）。NEDD4L 陽性表達(dá)患者3年總體生存率為87.0%（20/23），NEDD4L 陰性表達(dá)患者為55.4%（36/65），經(jīng)Log-rank χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=6.114，P=0.008），NEDD4L 陰性表達(dá)患者3年總體生存率較陽性表達(dá)患者低。NEDD4L 陽性表達(dá)患者平均生存時間為（32.2±5.0）個月，NEDD4L 陰性表達(dá)患者為（21.4±4.2）個月，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.075，P=0.000），NEDD4L 陽性表達(dá)患者平均生存時間較陰性表達(dá)患者長。見圖3。

ULK1 陽性表達(dá)患者的3年總體生存率為54.55%（36/66），ULK1 陰性表達(dá)患者為90.91%（20/22），經(jīng)Log-rank χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.814，P=0.002），ULK1 陽性表達(dá)患者3年總體生存率較陰性表達(dá)患者低。ULK1 陽性表達(dá)患者的平均生存時間為（33.4±5.3）個月，ULK1 陰性表達(dá)患者為（20.7±4.6）個月，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.041，P=0.000），ULK1 陽性表達(dá)患者平均生存時間較陰性表達(dá)患者長。見圖3。

圖3 NEDD4L和ULK1表達(dá)對NSCLC患者生存預(yù)后的影響

2.6 單因素及多因素Cox 回歸分析影響NSCLC預(yù)后的危險因素

將年齡（＜60 歲= 0，≥60 歲= 1）、性別（男= 0，女= 1）、腫瘤直徑（≤5 cm= 0，＞5 cm= 1）、病理類型（腺癌= 0，鱗癌=1）、病理分級（高中分化= 0，低分化=1）、TNM 分期（Ⅰ、Ⅱ期= 0，Ⅲ期= 1）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（無= 0，有= 1）、NEDD4L（陽性= 0，陰性= 1）、ULK1（陰性= 0，陽性= 1）作為自變量，將NSCLC 患者隨訪過程中的生存狀態(tài)作為因變量（死亡= 1，存活=0），做單因素及多因素Cox 回歸分析。

表3 影響NSCLC患者預(yù)后的單因素Cox回歸分析參數(shù)

多因素Cox 回歸分析結(jié)果顯示，NEDD4L 陰性表達(dá)[=1.878（95% CI：0.961，2.995）]、ULK1 陽性表達(dá)[=1.679（95% CI：0.785，2.884）]及腫瘤TNM分 期Ⅲ期[=1.937（95% CI：1.131，3.317）] 是NSCLC 患者不良預(yù)后的獨立危險因素（P＜0.05）。見表4。

表4 影響NSCLC患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析參數(shù)

3 討論

NSCLC 作為肺癌的最常見類型，約占85%[9]，大多數(shù)NSCLC 患者初次診斷時癌細(xì)胞即發(fā)生轉(zhuǎn)移[10-11]。在過去20年里，隨著腫瘤生物學(xué)和腫瘤進(jìn)展機(jī)制的研究，NSCLC 的治療取得了重要進(jìn)展。然而，NSCLC 的總體治愈率和存活率仍然很低。因此，需要研究新的預(yù)后判斷的腫瘤標(biāo)志物，以改善NSCLC 的療效[12]。

NEDD4L 是一種E3 泛素蛋白連接酶，包含1 個HECT 結(jié)構(gòu)域。NEDD4L 的下游靶點多數(shù)是膜蛋白，包括離子通道和轉(zhuǎn)運蛋白，NEDD4L 活性對于維持血壓和正常生理機(jī)能發(fā)揮重要的作用[13]。有研究表明，NEDD4L 在腫瘤中發(fā)揮抑癌因子的作用，其通過調(diào)控腫瘤信號通路的Dvl2 蛋白質(zhì)的降解，導(dǎo)致Wnt信號通路抑制，抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。近年來研究表明，多種腫瘤中存在NEDD4L 表達(dá)下調(diào)，通過影響腫瘤細(xì)胞的線粒體代謝，促進(jìn)腫瘤的惡性增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移[15]。本研究中NSCLC 癌組織中NEDD4L 在mRNA 及蛋白表達(dá)均明顯降低，與WANG等[16]報道結(jié)果一致。NEDD4L 表達(dá)下調(diào)的機(jī)制與微小RNA 調(diào)控有關(guān)。有研究表明，微小RNA-513a-5p能夠結(jié)合于NEDD4L mRNA 的3’非編碼區(qū)域，促進(jìn)NEDD4L mRNA 的降解，抑制NEDD4L 的表達(dá)[17]。此外，WANG 等[16]報道Zeste 同源物2（EZH2）介導(dǎo)的多梳組蛋白增強子H3K27 甲基化，能夠抑制NEDD4L的表達(dá)，敲低EZH2 的表達(dá)后NEDD4L 的表達(dá)再次升高，進(jìn)一步證實了EZH2 對NEDD4L 的調(diào)控功能。本研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC 腫瘤分期Ⅲ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC 癌 組織中NEDD4L 表達(dá) 較低，提示NSCLC 中NEDD4L 的低表達(dá)與腫瘤惡性進(jìn)展有關(guān)。分析其原因，NEDD4L 的表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致下游靶蛋白SMAD2和SMAD7 的積累，SMAD2 和SMAD7 能夠?qū)е罗D(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）信號通路激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移及侵襲，導(dǎo)致腫瘤的進(jìn)展[18]。此外，JIANG 等[4]發(fā)現(xiàn)NEDD4L 能夠泛素化降解缺氧誘導(dǎo)因子1A，NEDD4L 表達(dá)下調(diào)后導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)因子1A 的下游靶點如血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)升高，促進(jìn)腫瘤血管生成，促進(jìn)腫瘤的惡性發(fā)展。

ULK1 是哺乳動物中ATG1 基因的同源物，能與自噬蛋白如FIP200 等形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，調(diào)節(jié)自噬的啟動，是自噬過程中重要的細(xì)胞質(zhì)激酶[19]。研究表明，ULK1在人類乳腺癌及胃癌等多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，作為重要的致癌基因，能夠在營養(yǎng)缺乏的環(huán)境中通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用誘導(dǎo)自噬發(fā)生，并促進(jìn)腫瘤的增殖[7-8]。因此，ULK1 是腫瘤中一種具有潛力的重要的診斷治療靶點。本研究中，NSCLC 癌組織中ULK1 的表達(dá)量明顯高于癌旁組織，表明NSCLC 中ULK1 表達(dá)上調(diào)。分析其原因，ULK1 參與構(gòu)成ULK 復(fù)合物，ULK 復(fù)合物誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，ULK 復(fù)合物直接受mTOR 和AMP 活化蛋白激酶（AMPK）的調(diào)控，其在腫瘤中的表達(dá)促進(jìn)ULK1 的表達(dá)[20]。此外，本研究中NSCLC癌組織中ULK1 的表達(dá)與腫瘤TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，表明ULK1 可能促進(jìn)NSCLC 腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。有學(xué)者報道，腫瘤中ULK1 的過度活化增強線粒體自噬能力，促進(jìn)NLRP3 炎癥小體過度激活，大量趨化因子的分泌導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的骨轉(zhuǎn)移[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，自噬在腫瘤發(fā)展的各個階段會有所不同，在腫瘤發(fā)展的早期，自噬通過直接殺傷來限制腫瘤細(xì)胞的增殖。然而，在腫瘤已經(jīng)形成之后，對缺血缺氧壓力的反應(yīng)增加腫瘤細(xì)胞的存活、侵襲和轉(zhuǎn)移[22]。因此，ULK1 在腫瘤進(jìn)展期及晚期中可能發(fā)揮更為重要的腫瘤促進(jìn)功能。

筆者進(jìn)一步分析NEDD4L、ULK1 與NSCLC 患者生存預(yù)后關(guān)系，結(jié)果NEDD4L 陰性表達(dá)、ULK1 陽性表達(dá)的NSCC 患者生存預(yù)后較差，提示NEDD4L、ULK1 是判斷NSCLC 患者預(yù)后的重要指標(biāo)。本研究利用單因素及多因素Cox 回歸分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤TNM分期Ⅲ期、NEDD4L 陰性表達(dá)和ULK1 陽性表達(dá)是NSCLC 患者不良預(yù)后的獨立危險因素。因此，NEDD4L、ULK1 是重要的NSCLC 的腫瘤標(biāo)志物，檢測NSCLC 癌組織中NEDD4L、ULK1 的表達(dá)有助于患者的預(yù)后。筆者發(fā)現(xiàn)，NSCLC 癌組織中NEDD4L 與ULK1 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，表明兩者可能存在相互作用的關(guān)系。LEE 等[23]報道，NEDD4L 通過降低抑制腫瘤細(xì)胞ULK1 的磷酸化激活，抑制自噬和線粒體代謝，從而抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖。因此，在NSCLC 中NEDD4L 通過對ULK1 活性的調(diào)控，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的線粒體代謝過程，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。但NSCLC 中兩者的具體作用機(jī)制有待深入探索。

綜上所述，NSCLC 中NEDD4L 表達(dá)下調(diào)，ULK1表達(dá)上調(diào)，兩者表達(dá)與腫瘤TNM 分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。NEDD4L 低表達(dá)、ULK1 的高表達(dá)的NSCLC 患者預(yù)后較差，且是NSCLC 患者不良生存預(yù)后的獨立危險因素，其有望成為新的判斷NSCLC 預(yù)后的分子標(biāo)志物。但本研究樣本例數(shù)有限，且是回顧性研究，有待今后設(shè)計大樣本、前瞻性臨床研究證實。