高維松，陳榮，吳國志，王隆輝，吳昌新

（海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 骨科，海南 ?？?570311）

骨關(guān)節(jié)炎又稱退行性骨關(guān)節(jié)病，以關(guān)節(jié)軟骨缺損、進行性軟骨變性為主要病理表現(xiàn)，現(xiàn)已成為世界第4 大致殘性疾病。骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制尚未完全闡明，目前臨床多采用對癥治療、保守治療等，患者癥狀可得到部分緩解，但療效不佳[1-2]。因此探尋有效藥物提高骨關(guān)節(jié)炎療效有重要臨床意義。塞來昔布是一種非甾體類抗炎藥，具有抗炎、解熱等作用[3]。熊應(yīng)宗等[4]研究顯示，塞來昔布治療骨關(guān)節(jié)炎短期和遠期療效顯著，且安全可行。目前有關(guān)塞來昔布對骨關(guān)節(jié)炎的作用機制尚未明確。有研究證實，軟骨細(xì)胞凋亡是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵，而軟骨細(xì)胞外基質(zhì)過度降解是軟骨細(xì)胞凋亡的主要原因之一[5]。目前有關(guān)塞來昔布對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞生物學(xué)功能的影響少見報道，因此本研究探究塞來昔布對膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并分析相關(guān)機制，以期為膝骨關(guān)節(jié)炎的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織來源

膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織取自2021年1月—2021年12月在海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院就診的10 例（男、女各5 例）重度膝骨關(guān)節(jié)炎行膝關(guān)節(jié)置換患者。正常膝骨關(guān)節(jié)軟骨組織取自同期本院5 例因下肢嚴(yán)重創(chuàng)傷后需截肢治療的患者（男性3 例，女性2 例，均無膝骨關(guān)節(jié)炎病史）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批并通過（No：2021-016）。

1.2 主要試劑及儀器

塞來昔布，純度：≥98%，批號：20200913（上海吉至生化科技有限公司），DMEM 培養(yǎng)基（上海吉至生化科技有限公司），甲苯胺藍染液、AnnexinVFITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海玉博生物科技有限公司），兔抗人表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）、P38 絲裂原激活蛋白激酶（P38 mitogen-activated protein kinase, P38 MAPK）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9, MMP-9）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）及β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體、山羊抗兔HRP 二抗（上海臻科生物科技有限公司）。

Optima?XPN 超速離心機（美國貝克曼庫爾特生物科技有限公司），NBI1000 型倒置熒光顯微鏡（南京先納光學(xué)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞分離及培養(yǎng)將人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織、人正常膝骨關(guān)節(jié)組織分別置于含雙抗的DMEM 培養(yǎng)基中，PBS 洗滌3 次，削取軟骨組織塊，剪碎至大小約1 mm×1 mm，于0.2%Ⅱ型膠原酶消化液中，37℃、5%二氧化碳環(huán)境下消化；消化結(jié)束后，4℃、3 000 r/min 離心10 min，棄上清液，用DMEM 培養(yǎng)基沖洗，離心棄去上清液，重復(fù)操作3次。加入含10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）的DMEM 完全培養(yǎng)液，過濾細(xì)胞懸液，吹打懸液均勻后，接種于25 m2培養(yǎng)瓶中，每隔1 天更換培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞融合至70%～80%時，用PBS 洗滌2 次，0.25%胰酶消化，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)呈圓形漂浮流動時終止消化，離心取細(xì)胞，用含10% FBS 的DMEM 完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，細(xì)胞接種在新的培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)[6]。上述細(xì)胞均至第3 代時用于后續(xù)實驗。

1.3.2 甲苯胺藍染色第3 代軟骨細(xì)胞長至80%左右時，消化、離心，制成密度為1×105個/mL 的細(xì)胞懸液，接種于24 孔板（1 mL/孔，孔板提前放置蓋玻片），待細(xì)胞長至蓋玻片70%左右時，取出蓋玻片，用4%多聚甲醛固定20 min，PBS 洗滌3 次，1%甲苯胺藍溶液染色30 min，純水沖洗掉多余染液，脫水封片，倒置顯微鏡觀察并拍照[7]。

1.3.3 細(xì)胞分組取第3 代人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞、人正常膝骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞重懸，按1.5×105個/孔的密度接種至48 孔板，待細(xì)胞融合約80%時，更換不含F(xiàn)BS 的培養(yǎng)液。細(xì)胞分為4 組：①空白對照組：人正常膝骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞不做特殊處理；②模型組：人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞不做特殊處理；③塞來昔布低、高劑量組：人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中分別加入含終濃度為50 μmol/L、200 μmol/L 塞來昔布溶液的培養(yǎng)液[8]。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h，每孔設(shè)置6 復(fù)孔，每組實驗重復(fù)3 次。

1.3.4 CCK-8法檢測各組細(xì)胞增殖能力取第3 代人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，消化并按1.5×105個/孔的密度接種至48 孔板，嚴(yán)格按照CCK-8 試劑盒說明書操作，分別于培養(yǎng)24 h 后加入CCK-8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，檢測490 nm 處各孔細(xì)胞光密度（optical density, OD）值，重復(fù)3 次，取平均值[9]。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD 值/空白對照組OD 值）×100%。每組6 個復(fù)孔，實驗重復(fù)3 次。

1.3.5 AnnexinV-FITC/PI 檢測各組細(xì)胞凋亡取第3 代人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，PBS 溶液沖洗，棄上清液，制成密度為1×105個/mL 的細(xì)胞懸液，取100 μL加入5 μL AnnexinV-FITC 及10 μL PI（20 μg/mL）混勻，孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。每組6個復(fù)孔，實驗重復(fù)3 次[10]。

1.3.6 Western blotting 檢測細(xì)胞增殖、凋亡及EGFR/MAPK 通路蛋白的表達取第3 代人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，以RIPA 裂解并提取總蛋白，檢測濃度及純度，電泳，轉(zhuǎn)膜，放入5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h，分別加入一抗EGFR、p-P38 MAPK、P38 MAPK、MMP-9、Caspase-3、內(nèi)參β-actin，均按照1∶500 稀釋，4℃過夜，加入HRP 標(biāo)記山羊抗兔二抗（1∶1 000 稀釋），室溫孵育1 h，顯影、定影，根據(jù)各蛋白條帶灰度值計算目標(biāo)基因蛋白相對表達量[11]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)對比

甲苯胺藍染色結(jié)果顯示，人正常膝骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞內(nèi)均見藍紫色異染顆粒，細(xì)胞核呈深藍色，細(xì)胞質(zhì)呈淺藍色；與人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞形態(tài)比較，人正常膝骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞體積較大，形態(tài)較規(guī)則，藍紫色異染顆粒較多。見圖1。

圖1 兩組軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 （甲苯胺藍染色×200）

2.2 各組細(xì)胞增殖情況比較

空白對照組、模型組、塞來昔布低和高劑量組細(xì)胞存活率分別為（100.00±0.00）% 、（45.96±6.89）%、（60.69±9.12）%和（82.78±12.45）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=47.770，P=0.000）。進一步兩兩比較結(jié)果：與空白對照組比較，模型組，塞來昔布低、高劑量組細(xì)胞存活率降低（P＜0.05）；與模型組比較，塞來昔布低、高劑量組細(xì)胞存活率升高（P＜0.05）；與塞來昔布低劑量組比較，塞來昔布高劑量組細(xì)胞存活率升高（P＜0.05）。

2.3 各組細(xì)胞凋亡情況比較

空白對照組、模型組、塞來昔布低和高劑量組細(xì)胞凋亡率分別為（9.98±1.50）%、（36.77±5.52）%、（28.35±4.26）%和（16.58±2.47）%，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=60.236，P=0.000）。進一步兩兩比較結(jié)果：與空白對照組相比，模型組，塞來昔布低、高劑量組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與模型組比較，塞來昔布低、高劑量組細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）；與塞來昔布低劑量組比較，塞來昔布高劑量組細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05）。

2.4 各組細(xì)胞增殖、凋亡及EGFR/MAPK 通路蛋白相對表達量比較

空白對照組、模型組、塞來昔布低和高劑量組EGFR、p-P38 MAPK/P38 MAPK、MMP-9、Caspase-3 蛋白相對表達量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較結(jié)果：與空白對照組比較，模型組，塞來昔布低、高劑量組EGFR、MMP-9、Caspase-3蛋白相對表達量升高（P＜0.05），p-P38 MAPK/P38 MAPK蛋白相對表達量降低（P＜0.05）；與模型組比較，塞來昔布低、高劑量組EGFR、MMP-9、Caspase-3 蛋白相對表達量降低（P＜0.05），p-P38 MAPK/P38 MAPK蛋白相對表達量升高（P＜0.05）；與塞來昔布低劑量組相比，塞來昔布高劑量組EGFR、MMP-9、Caspase-3 蛋白相對表達量降低（P＜0.05），p-P38 MAPK/P38 MAPK蛋白相對表達量升高（P＜0.05）。見表1 和圖2。

表1 各組細(xì)胞增殖、凋亡及EGFR/MAPK通路蛋白相對表達量比較 （±s）

表1 各組細(xì)胞增殖、凋亡及EGFR/MAPK通路蛋白相對表達量比較 （±s）

注：①與空白對照組比較，P ＜0.05；②與模型組比較，P ＜0.05；③與塞來昔布低劑量組比較，P ＜0.05。

組別空白對照組模型組塞來昔布低劑量組塞來昔布高劑量組F 值P 值Caspase-3 0.36±0.06 1.18±0.18①0.82±0.13①②0.55±0.09①②③49.820 0.000 EGFR 0.29±0.05 1.13±0.17①0.80±0.12①②0.58±0.09①②③56.015 0.000 p-P38 MAPK/P38 MAPK 1.27±0.19 0.31±0.05①0.69±0.11①②0.88±0.13①②③56.672 0.000 MMP-9 0.45±0.07 1.26±0.18①0.99±0.15①②0.63±0.09①②③46.524 0.000

圖2 各組細(xì)胞增殖、凋亡及EGFR/MAPK通路蛋白的表達

3 討論

膝骨關(guān)節(jié)炎是膝關(guān)節(jié)軟骨進行性破壞、膝關(guān)節(jié)功能受損的一種退行性病變，目前臨床仍缺乏有效治療方法，導(dǎo)致多數(shù)患者關(guān)節(jié)畸形、活動受限，甚至致殘，給患者生活質(zhì)量及家庭帶來嚴(yán)重影響及巨大經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[12]。塞來昔布是新一代非甾體抗炎鎮(zhèn)痛藥，可通過抑制環(huán)氧合酶-2 阻止前列腺素類炎癥物質(zhì)產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛作用[13]。王嘯等[14]研究顯示，塞來昔布可減輕膝關(guān)節(jié)疼痛、改善膝關(guān)節(jié)功能，進而對膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)揮治療作用。馬瑞等[15]研究顯示，塞來昔布可有效緩解早期膝骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)疼痛，改善關(guān)節(jié)功能。目前塞來昔布對膝骨關(guān)節(jié)炎治療作用的具體機制尚未明確。有研究表明，軟骨細(xì)胞是膝關(guān)節(jié)軟骨中主要細(xì)胞，能夠合成軟骨中特異性細(xì)胞外基質(zhì)成分，以及合成代謝及分解代謝所需的多種因子，當(dāng)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解多于基質(zhì)合成，則使軟骨細(xì)胞不能攝取較多營養(yǎng)物質(zhì)，進而導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡，最終加重膝關(guān)節(jié)損傷[16]。

本研究體外分離并培養(yǎng)人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組及塞來昔布低、高劑量組人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞凋亡率升高；但塞來昔布低、高劑量組人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞存活率比模型組升高，細(xì)胞凋亡率比模型組降低，且塞來昔布高劑量組人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞存活率比低劑量組升高，細(xì)胞凋亡率比低劑量組降低，說明塞來昔布可促進人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖，抑制軟骨細(xì)胞凋亡。EGFR 是一種跨膜受體酪氨酸激酶，是細(xì)胞增殖及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的受體之一，其活化可介導(dǎo)關(guān)節(jié)炎破骨細(xì)胞生長、增殖及分化等生物學(xué)過程[17]。蔣毅等[18]研究顯示，過表達EGFR 可促進類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎破骨細(xì)胞生成及滑膜細(xì)胞生長。MAPK 是機體廣泛表達的絲氨酸/酪氨酸激酶，由3 種激酶復(fù)合物組成，其中P38 MAPK是MAPK 家族一員，能夠調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生長及代謝。既往研究顯示，EGFR 可抑制P38 MAPK 發(fā)生磷酸化反應(yīng)，促進下游因子MMP-9 產(chǎn)生，MMP-9 可促進軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解，進而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡基因Caspase-3 升高，最終促進軟骨細(xì)胞凋亡[19]。云昕矞[20]研究顯示，上調(diào)EGFR 表達可抑制P38 MAPK 通路活化并促進軟骨細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組及塞來昔布低、高劑量組人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞EGFR、MMP-9、Caspase-3 蛋白相對表達量升高，p-P38 MAPK/P38 MAPK 相對表達量降低，但塞來昔布低、高劑量組人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞EGFR、MMP-9、Caspase-3 蛋白相對表達量低于模型組，塞來昔布高劑量組人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞EGFR、MMP-9、Caspase-3 蛋白相對表達量低于低劑量組，說明塞來昔布可能通過抑制EGFR 表達，促進P38 MAPK 通路活化，促進離體人膝骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，進而促進軟骨細(xì)胞生長，對人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞發(fā)揮保護作用。

綜上所述，塞來昔布能夠促進離體人膝骨關(guān)節(jié)炎細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡進而促進軟骨細(xì)胞生長，對人膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞發(fā)揮保護作用。其作用可能是通過抑制EGFR表達，促進P38 MAPK通路活化實現(xiàn)的。然而本研究并未能明確塞來昔布對EGFR/P38 MAPK通路的具體調(diào)控作用，后期應(yīng)進行深入闡述。