超級增強子在前列腺癌中的研究進展

龍軍， 陳林， 楊亞飛， 何江樞， 李嘉， 汪松， 陳書練， 梁國標， 楊進

泌尿系統(tǒng)腫瘤中前列腺癌是最常見的惡性腫瘤。最新世界腫瘤數(shù)據(jù)庫(GLOBOCAN)數(shù)據(jù)顯示,前列腺癌已成為世界第二大常見癌癥,為男性癌癥死亡的第五大因素[1]。目前治療方法包括手術(shù)、放療、化療等，但這些方法效果有限，仍不能很好改善患者的預(yù)后及生存情況。靶向治療能帶來不錯的治療效果，因此，探索新的分子靶點，勢在必行。

增強子是一類非編碼DNA調(diào)控序列，結(jié)合了RNA聚合酶Ⅱ、轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors,TFs)、輔助激活因子、調(diào)節(jié)因子(MED1、OGT等)等，增加啟動子活性并促進靶基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮正向調(diào)控作用[2]。增強子對基因的調(diào)控可以發(fā)生在同一基因的不同位置，或是不同染色質(zhì)上的基因。甚至在某些情況下，單個增強子能對多個基因進行調(diào)控。超級增強子(super-enhancer, SE)是高密度結(jié)合了關(guān)鍵調(diào)控因子和中介子(Mediator)的增強子簇，含有細胞類型特異性轉(zhuǎn)錄因子，在控制細胞身份和調(diào)控細胞命運中發(fā)揮重要作用[3-4]。

在腫瘤發(fā)病機制中，癌細胞在致癌基因和其他基因上生成SE。后來的研究發(fā)現(xiàn)，正常細胞并不表達癌細胞所生成的SE調(diào)控的關(guān)鍵癌基因，這就表明SE可以通過調(diào)控這些關(guān)鍵基因維持腫瘤特性，在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起到關(guān)鍵作用[5]。因此，SE的活化可以作為腫瘤預(yù)診斷的標志以及分子治療的靶點，從而調(diào)控疾病特異性SE及其相關(guān)因子的活性，就有機會實現(xiàn)疾病的精準治療。

1A：為增強子結(jié)構(gòu)；1B：為超級增強子結(jié)構(gòu)圖1 增強子和超級增強子的結(jié)構(gòu)

1 SE的結(jié)構(gòu)特征與疾病中的調(diào)控功能

1.1 SE的結(jié)構(gòu)特征 SE是一類增強子大簇，具有細胞特異性，控制細胞身份基因的表達。SE富集關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基序，可以大量結(jié)合關(guān)鍵TFs(Oct4、Sox2、Nanog、Klf4、Esrrb)，和增強子一樣，促進靶基因的高水平轉(zhuǎn)錄，但SE作用效果較普通增強子高一個數(shù)量級(圖1)。此外，SE的大小、所結(jié)合的TFs的量以及對干擾的敏感性都不同于普通增強子。SE還富含信號途徑TFs DNA基序，從而結(jié)合相應(yīng)信號途徑終端TFs(如Wnt通路的TCF3、TGF-β通路中的SMAD3和LIF中的STATE3)，作為一個信號平臺，匯集來自發(fā)育相關(guān)的信號通路傳來的信號，這些信號協(xié)同調(diào)控SE活性啟動相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[6]。SE除能激活蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄外，還能自身轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生增強子RNA(eRNA)調(diào)控基因表達。通過測定增強子轉(zhuǎn)錄相關(guān)標記分子或組蛋白修飾改變，便可以鑒定SE，這些分子包括輔因子(Mediator和Cohensin)、組蛋白修飾標記(H3K27ac和H3K4me1)、染色質(zhì)修飾分子(p300)等，其中H3K27ac能區(qū)分活性與非活性增強子，常作為鑒定的最佳選擇[7-8]。也有報道發(fā)現(xiàn)增強子RNA(enhancer RNA,eRNA)較H3K27ac更適合用于鑒定增強子活性及新的增強子預(yù)測[9-10]。

1.2 SE在疾病中的調(diào)控作用 Dowen等[11]研究發(fā)現(xiàn)了SE結(jié)構(gòu)域，能將SE的作用限制在結(jié)構(gòu)域內(nèi)而不影響鄰近基因的表達，因此其結(jié)構(gòu)完整性對鄰近基因正常表達至關(guān)重要，若失去該限制功能，將可能導(dǎo)致鄰近基因被SE異常激活而發(fā)生腫瘤。腫瘤細胞產(chǎn)生的SE也會結(jié)合許多腫瘤相關(guān)的信號通路TFs。在結(jié)直腸腫瘤中， Wnt信號通路相關(guān)的SE區(qū)域富集了大量TCF4，激活或者抑制該通路，便能調(diào)控SE相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄[6]。Raisner等[12]通過實驗證實BAMBI基因(一種TGF-β通路抑制因子)為三陰乳腺癌所依賴，并在該基因近端和遠端均發(fā)現(xiàn)有SE元件。這些SE元件與BAMBI基因之間相互關(guān)聯(lián)，在敲除BAMBI基因后，HCC38細胞生長被顯著抑制。

綜上所述，SE由于其結(jié)構(gòu)特殊性，可以通過多種方式調(diào)節(jié)疾病相關(guān)基因的表達，并影響疾病的預(yù)后，包括前列腺癌。進一步探究SE相關(guān)機制，將有助于尋找新的治療靶點、研究新的靶向藥物和優(yōu)化疾病的診治。

2 SE相關(guān)分子在前列腺癌中的作用

SE上結(jié)合了大量轉(zhuǎn)錄因子(如BRD4、CDKs、ERG、FOXA1等)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)、輔因子、染色質(zhì)調(diào)節(jié)子、RNA聚合酶等[13-14]，作為一個信號平臺發(fā)揮作用接收不同信號通路傳來的信號，從而激活啟動子調(diào)控下游關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄，包括腫瘤信號。(圖2)2.1 BET/BRD4 BRD4是SE的重要組成部分，能識別并結(jié)合乙?；M蛋白，協(xié)助Mediator募集到啟動子區(qū)域，在轉(zhuǎn)錄啟動后，促進正性轉(zhuǎn)錄延長因子(P-TEFb)募集到RNA pⅡ并通過P-TEFb激活聚合酶Ⅱ CTD的磷酸化，從而增加聚合酶Ⅱ依賴的轉(zhuǎn)錄[15]，是組織特異性SE的關(guān)鍵鑒別因素。

注：超級增強子結(jié)合多種轉(zhuǎn)錄因子，通過中介子與啟動子相連，形成一定的結(jié)構(gòu)域。接收不同信號通路的信息，進而影響靶基因的轉(zhuǎn)錄圖2 SE在前列腺癌中的作用機制

在前列腺癌中，BRD4與雄激素受體(Androgen receptor,AR)的N端結(jié)合驅(qū)動AR介導(dǎo)的基因的表達[16]。AR陽性細胞系(VCaP等)對BET抑制劑(BET inhibitor,BETi)選擇性敏感，而AR陰性細胞系(PC3等)不敏感[17-18]。在趨勢抵抗性前列腺癌(castration- resistant prostate cancer，CRPC)，中BRD4也可以與ERG互作來控制常見基因的上調(diào)。此外，在前列腺癌中還有許多參與主要染色質(zhì)相關(guān)程序和改變的蛋白也含有BRD4[19]。靶向BRD4和相關(guān)BET蛋白的溴結(jié)構(gòu)域的抑制劑在臨床前列腺癌模型中顯示出療效。

Wilflingseder等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在腎損傷早期，下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)被激活從而在增強子和SE上募集關(guān)鍵信號依賴轉(zhuǎn)錄因子(如STAT3或AP-1)進而使組蛋白發(fā)生乙?；⑴cBRD4結(jié)合，促進腎修復(fù)關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄。在缺血再灌注損傷前，BRD4的功能缺失，將會導(dǎo)致急性腎損傷后出現(xiàn)恢復(fù)受損并且增加死亡率。因此，我們猜測在其他非腫瘤疾病中，或許SE也參與調(diào)控，但這還需要研究人員進一步探索。

2.2 CDKs CDKs控制關(guān)鍵細胞周期點和轉(zhuǎn)錄并對細胞內(nèi)外增殖信號作出響應(yīng)。CDKs相關(guān)的SE調(diào)控AR的募集以及RNA pII的磷酸化來促進靶基因的表達，也因此成為CDK抑制劑的治療靶點。

TFIIH激酶CDK7通過磷酸化RNA pⅡ的C端域，從而發(fā)揮調(diào)控SE活性的作用[21]。此外，CDK7還能通過磷酸化AR來促進轉(zhuǎn)錄激活活性以及后續(xù)的蛋白降解[22-24]。在前列腺癌中，CDK7通過配體特異磷酸化激活MED1，被募集到AR結(jié)合的SE上導(dǎo)致SE相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子高密度裝配[18]。在MED1的參與下，通過CDK7抑制能迅速阻斷癌基因驅(qū)動因子AR等的表達[25-28]。在膀胱癌中，CDK7還能促進募集組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SETD1A/B和SETD2來影響染色質(zhì)修飾[29-30]。

P-TEFb是轉(zhuǎn)錄過程中最主要的限速步驟和調(diào)控環(huán)節(jié)，它也位于SE上。P-TEFb復(fù)合物包含CDK9和cyclinT1，其活性形式cyclinT-CDK9-BRD4[31]。CDK9通過促進RNA pII的CTD中Ser2的磷酸化，啟動轉(zhuǎn)錄延長。BRD4也可以在RNA pII的CTD促進CDK9調(diào)節(jié)的Ser2的磷酸化。CDK9能調(diào)節(jié)AR的穩(wěn)定性，是下游AR靶基因的表達所需。CDK9通過N端磷酸化延長AR半衰期和活性，而未被磷酸化的AR將被降解。因此抑制CDK9可能為CRPC的治療提供新的思路[15，32]。

CDK12主要通過磷酸化RNA pⅡ的C端域絲氨酸2(Ser2)來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄延長過程，已經(jīng)證實CDK12為一些惡性腫瘤的致癌驅(qū)動因子(如胃癌、乳腺癌、前列腺癌)[33-36]。

2.3 ERG ERG是細胞特異性譜系分化和表達模式的必要轉(zhuǎn)錄因子，比如內(nèi)皮細胞、造血細胞和官腔細胞分化[37-40]。其發(fā)揮作用主要是通過調(diào)控譜系特異性增強子和SE實現(xiàn)。ERG與染色質(zhì)易位，產(chǎn)生不同融合基因，如前列腺癌中TMPRSS2-ERG、急性髓系白細胞中FUS-ERG和尤因肉瘤中EWS-ERG。TMPRSS2-ERG陽性的前列腺癌中，ERG過表達導(dǎo)致SE的形成并促進腫瘤發(fā)展相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性，也是腫瘤晚期、高Gleason評分、轉(zhuǎn)移以及短生存時間的因素[41]。ERG的SE相關(guān)的譜系特異性機制與前列腺癌特異性轉(zhuǎn)錄因子FOXA1和HOXB13相關(guān)，通過物理互作協(xié)同作用。其機制是通過BRG1相關(guān)的染色質(zhì)重塑復(fù)合物來建立SE染色質(zhì)可及性和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)從而部分增加SE的活性[18]。此外，ERG還能與BRD4互作并共定位在許多細胞增殖和侵襲相關(guān)的靶基因上。最近研究在前列腺癌中發(fā)現(xiàn)ERG下游靶點CBP/p300作用轉(zhuǎn)錄激活子2(CTTED2),可以促進p300和蛋白精氨酸易位，并與核仁形成多聚復(fù)合物刺激細胞遷移并最終導(dǎo)致前列腺癌轉(zhuǎn)移。

2.4 FOXA1 FOXA1是前列腺癌發(fā)生發(fā)展的因子，其編碼的先鋒因子可以打開染色質(zhì)增加AR的可及性，使得FOXA2直接與AR互作產(chǎn)生AR信號，從而驅(qū)動癌細胞的生長和存活[42-43]。另外還能通過非AR依賴途徑發(fā)揮作用。FOXA1不能與Wnt通路抑制因子TLE3互相作用，進而激活Wnt通路增加癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[44]。因此，靶向FOXA1調(diào)控通路將為前列腺癌的治療提供一種新的思路。

2.5 LncRNA/eRNA eRNA是一類由SE轉(zhuǎn)錄生成的非編碼RNA，它能通過多種方式調(diào)控增強子活性以及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。順式eRNA可以通過去除NELF并激活p-TEFb復(fù)合物，從而增加RNA pII的延長，正性調(diào)節(jié)鄰近mRNA。隨著對eRNA的研究增多，有研究人員發(fā)現(xiàn)反式eRNA也能發(fā)揮功能[45-46]，反式eRNA可以將DNMT1募集到PSA等基因末端區(qū)域并增加其5mC甲基化水平。其機制在于碳C富集區(qū)域是反式eRNA結(jié)合DNMT1并發(fā)揮功能的關(guān)鍵。通過細胞實驗證實，AR與反式eRNA存在關(guān)聯(lián)，因此進一步探究其互作關(guān)系將有助于尋找新的治療方式。

此外，最近關(guān)于前列腺癌的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXA1驅(qū)動的SE激活LncRNA DSCAM_AS1的表達，DSCAM_AS1能與YBX1互作影響YBX1募集到啟動子上FOXA1區(qū)域，從而促進前列腺癌的進展[47]。LncRNA MANCR在PC3中選擇性表達，并能增加癌細胞的遷移和侵襲能力[48]。此外，在膀胱癌中新發(fā)現(xiàn)的LncRNA LINC00162能促進腫瘤的進展，其機制是結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白THRAP3抑制PTTG1IP的表達從而促進細胞增殖[49]。

3 靶向SE治療前列腺癌

前列腺癌治療核心是抑制AR驅(qū)動的癌基因信號及下游轉(zhuǎn)錄。多年來，AR途徑已成功用于早期和晚期前列腺癌的治療，最初采用手術(shù)和化學(xué)閹割，ADT是治療首選，但常發(fā)生去勢抵抗。故ADT聯(lián)合AR抑制劑治療轉(zhuǎn)移性或非轉(zhuǎn)移性前列腺癌成為研究熱點。(表1)

表1 前列腺癌中靶向SE相關(guān)因子藥物

Darolutamide被用于治療具有高風(fēng)險進展為轉(zhuǎn)移性疾病的患有非轉(zhuǎn)移性趨勢抵抗性前列腺癌的男性患者[50]。它對AR配體具有高親和力，結(jié)合后能阻斷AR的同源二聚化，抑制AR進入細胞核從而降低雄激素靶基因的表達及前列腺癌細胞的增殖。此外，它還能通過減少FOXA1與AR結(jié)合發(fā)揮藥效。但是，AR信號抑制劑對前列腺患者生存質(zhì)量帶來的益處有限，因此需要探索新的治療靶點。

THZ531是CDK12的共價抑制劑，最早用于T細胞淋巴瘤，其作用機制是下調(diào)AR信號并優(yōu)先抑制CDK12抑制敏感轉(zhuǎn)錄子(CDK12-ISTs)，包括前列腺癌譜系特異性基因，以及促進細胞存活。研究人員利用CRISPR/Cas9對激酶進行篩選發(fā)現(xiàn)CDK12是前列腺癌細胞存活的保守必需因子。[51]此外，THZ531還能與AR拮抗劑協(xié)同作用，其協(xié)同效應(yīng)可能是由于AR靶點H3K27ac信號減弱及SE相關(guān)凋亡通路強化所致。因此，Darolutamide聯(lián)合THZ531治療是否可行，仍有待探究。

THZ1選擇性共價結(jié)合抑制CDK7磷酸化從而減弱AR信號且在CRPC和Enzalutamide抵抗前列腺癌細胞中維持效益。進一步研究表明，該藥可以選擇性靶向SE驅(qū)動的轉(zhuǎn)錄過程，包括MYC依賴的轉(zhuǎn)錄放大過程以及其他腫瘤特異性癌基因TFs和信號分子的表達過程[52-53]。THZ2能促進前列腺癌細胞的增殖和侵襲，與前列腺癌不良預(yù)后相關(guān)，在許多腫瘤中過表達，已成為潛在治療靶點，許多相關(guān)抑制劑的臨床試驗已經(jīng)進行[54]。

Enzalutamide是配體結(jié)合域的結(jié)合子，能有效阻斷前列腺癌中AR的結(jié)合與激活。但一些患者在治療一段時間后出現(xiàn)Enzalutamide抵抗。在Enzalutamide抵抗前列腺癌中，AR-V7表達升高，KI-ARv-03可以靶向CDK9導(dǎo)致AR-V7磷酸化降低，從根本上調(diào)節(jié)AR及AR-V7依賴的轉(zhuǎn)錄[32]。

Triptolide是雷公藤中提取的活性成分，具有抗前列腺癌作用。其機制是通過抑制AR磷酸化和AR-V7從而抑制AR結(jié)合到靶基因啟動子上，并減少TFIIH和RNA PII 的募集，使癌基因轉(zhuǎn)錄被抑制來達到抗癌目的。此外，在CRPC小鼠異種移植實驗中發(fā)現(xiàn)，低劑量Triptolide還能與Enzalutamide協(xié)同作用增加Enzalutamide的抗癌效果。這使得Triptolide成為潛在CRPC治療藥物。[26]

JQ1通過抑制BRD4與H3K27ac來抑制SE與啟動子互作，從而改變腫瘤基因轉(zhuǎn)錄而抗增殖。其作用靶點是LncRNA MANCR，RNA-seq分析顯示，在敲低MANCR后，癌細胞遷移和侵襲相關(guān)基因的表達發(fā)生了改變[48]。AR(-)的CRPC具有高度的侵襲和耐藥能力，JQ1能抑制前列腺癌細胞的惡性表型，在異種移植小鼠模型中，JQ1較Enzalutamide表現(xiàn)出更強的拮抗效果[55]。其抗腫瘤作用在膀胱癌中也得到了驗證[56]。

4 結(jié)語及展望

綜上所述，SE及其調(diào)控的相關(guān)分子在疾病的發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵節(jié)點發(fā)揮調(diào)控作用，檢測這些分子將有助于疾病的診斷及預(yù)后判斷，比如前列腺癌kinedin超家族蛋白4A(KIF4A)可作為前列腺癌預(yù)后標志物[57]。相比治療，腫瘤的診斷在腫瘤診治中更為重要。目前主要依賴組織活檢及影像學(xué)檢測確診，腫瘤液體活檢(如血漿循環(huán)游離DNA)的應(yīng)用及發(fā)展，提高了診斷的特異性及敏感性[58]。將二代測序技術(shù)與之相結(jié)合，有望實現(xiàn)更準確的腫瘤診斷并為治療提供更準確的方向。亦或?qū)E相關(guān)因子深入探究，可能發(fā)現(xiàn)新的作用靶點，如潛在靶點DSCAM_AS1，為靶向藥物的選用及開發(fā)提供了依據(jù)。在一種疾病中可能有多個SE相關(guān)因子參與，聯(lián)合用藥或老藥新用也值得進一步探究。