何放晴，李曲文,2，張志珊，鄧艷琴,2

停乳鏈球菌似馬亞種(Streptococcusdysgalactiaesubspeciesequisimilis，SDSE)長(zhǎng)期以來(lái)一直被認(rèn)為是人類(lèi)呼吸道和皮膚的正常菌群之一，但近年來(lái)在世界范圍內(nèi)關(guān)于該菌引起感染的報(bào)道越來(lái)越多，已被視為重要的致病菌[1-2]。與化膿性鏈球菌的臨床癥狀十分相似，SDSE可引起人類(lèi)侵襲性和非侵襲性疾病，如鏈球菌中毒性休克綜合征(STSS)、敗血癥、皮膚和軟組織感染、肺炎和咽炎等[3-4]。SDSE在感染C群鏈球菌(GCS)和G群鏈球菌(GGS)的患者中分離率最高，例如，2006-2007年在印度地區(qū)臨床標(biāo)本中分離的313株GCS和GGS中，約81%的菌株為SDSE[5]。據(jù)報(bào)道，SDSE引起的感染占人類(lèi)鏈球菌疾病的5.8%，通常發(fā)生在老年患者或有基礎(chǔ)疾病的患者中[6]。停乳鏈球菌在女性生殖道中也十分常見(jiàn)[7]，新生兒感染SDSE時(shí)有發(fā)生，余麗陽(yáng)等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，1 歲以?xún)?nèi)的嬰幼兒可通過(guò)母嬰產(chǎn)道或哺乳等垂直傳播方式感染SDSE致病。此外，停乳鏈球菌在畜牧業(yè)的報(bào)道并不罕見(jiàn)，主要多見(jiàn)于牛、羊等哺乳動(dòng)物乳腺炎[9-10]，且國(guó)內(nèi)因酸奶等乳制品導(dǎo)致的群體感染事件時(shí)有發(fā)生[11-13]。然而目前國(guó)內(nèi)對(duì)該菌的相關(guān)性研究還較少，本研究通過(guò)對(duì)24株停乳鏈球菌似馬亞種菌株的臨床分布、鑒定及分子特征分析，旨在提升衛(wèi)生工作者對(duì)SDSE感染性疾病的認(rèn)識(shí)和預(yù)防控制能力。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 24株SDSE分離自2020-2021年福建省各類(lèi)感染病例送檢標(biāo)本。其中，男性13例，女性11例，年齡分布在5～85歲，中位數(shù)為19歲。感染者在入院采集標(biāo)本前均未使用抗菌藥物，剔除同一患者相同部位同一菌株。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 VITEK 2 Compact 全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)及配套的革蘭陽(yáng)性菌鑒定卡(生物梅里埃公司，法國(guó))，CO2恒溫培養(yǎng)箱(太倉(cāng)藝思高科技有限公司，中國(guó))，生物安全柜(東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司，中國(guó))，Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)和電泳儀(伯樂(lè)公司，美國(guó))，PCR擴(kuò)增儀(賽默飛世爾科技公司，新加坡)，血平板(廣東環(huán)凱生物科技有限公司，中國(guó))，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀及MSP 96 孔靶板、 α-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)(HCCA)(Bruker公司，德國(guó))，DL2000 DNA Marker和Premix Taq(寶生物工程有限公司，中國(guó))，所有引物均由福州鉑尚有限公司合成。

1.3 方 法

1.3.1 菌株培養(yǎng)和DNA提取 將采集的各類(lèi)標(biāo)本接種至血平板上，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后觀察，挑取有β溶血環(huán)的菌落進(jìn)行分離純化。

刮取1接種環(huán)純菌苔研磨于300 μL滅菌水中,混勻，100 ℃水浴 10 min。13 500×g離心 5 min，取上清液即為樣品DNA。

1.3.2 菌種鑒定及亞種分型 挑取表面光滑、中等大小的有β溶血環(huán)的菌落，采用VITEK 2 Compact 全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)的革蘭陽(yáng)性菌鑒定卡及基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-MS)，進(jìn)行細(xì)菌鑒定； 采用多重PCR[14]進(jìn)行停乳鏈球菌16S rRNA、SDSE亞種特異性鏈激酶前體基因(streptokinase precursor gene)的檢測(cè)，并測(cè)序上傳NCBI進(jìn)行比對(duì)來(lái)最終確定菌種及亞種分型，所用引物序列和擴(kuò)增長(zhǎng)度見(jiàn)表1。3種鑒定方法均指示為停乳鏈球菌似馬亞種時(shí)即納入待分析菌株。

表1 16S rRNA和鏈激酶前體基因PCR擴(kuò)增引物序列和產(chǎn)物大小Tab.1 Primer sequences and product size of 16S rRNA and streptokinase precursor gene

1.3.3 分子分型

1.3.3.1emm分型emm分型擴(kuò)增引物(emm-F和emm-R)與emm分型測(cè)序引物(emm-seq)的合成(表2)及PCR反應(yīng)條件參照美國(guó)疾病預(yù)防和控制中心(CDC)網(wǎng)站推薦(https://www.cdc.gov/streplab/protocol-emm-type.html)。擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，將獲得的序列提交到美國(guó)CDC鏈球菌實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)(https://www2.cdc.gov/vaccines/biotech/strepblast.asp)。

1.3.3.2 多位點(diǎn)序列分型 參考文獻(xiàn)[15]，選取7個(gè)管家基因，即葡萄糖激酶(Glucose kinase，gki)、谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Glutamine transport protein，gtr)、谷氨酸消旋酶(Glutamate racemase，murI)、DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白(DNA mismatch repair protein，mutS)、酮糖移轉(zhuǎn)酶(Transketolase，recP)、黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Xanthine phosphoribosyl transferase，xpt)、乙酰乙酰輔酶A硫解酶(Acetoacetyl-coathioloase，atoB)，進(jìn)行擴(kuò)增，所用的引物序列和擴(kuò)增長(zhǎng)度如表2所示。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物送至福州鉑尚公司進(jìn)行測(cè)序，得到的樣本序列上傳至MLST網(wǎng)站(https://pubmlst.org/organisms/streptococcus-dysgalactiae)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)后，MLST網(wǎng)站對(duì)每個(gè)管家基因的等位基因進(jìn)行賦值，根據(jù)每個(gè)菌株的等位基因譜得到其對(duì)應(yīng)序列分型(Sequence Types，STs)。進(jìn)行BURST分析區(qū)分克隆群(Clonal complexes，CCs)，如果SDSE分離株與優(yōu)勢(shì)ST型共享5個(gè)或更多等位基因，則被分配為同一克隆群。采用BioNumerics 6.6軟件對(duì)24株SDSE分離菌的MLST等位基因譜進(jìn)行聚類(lèi)分析。

表2 emm分型及MLST所用引物序列Tab.2 Primer sequences for emm typing and MLST

2 結(jié) 果

2.1 菌株鑒定情況 VITEK 2 Compact 細(xì)菌鑒定儀顯示，24株菌的主要生化特性表現(xiàn)為蔗糖、D-核糖、D-麥芽糖、D-海藻糖、D-甘露糖、D-半乳糖、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、α-葡糖苷酶、精氨酸雙水解酶、丙氨酸芳胺酶、丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶、亮氨酸芳胺酶、酪氨酸芳胺酶陽(yáng)性，D-甘露醇、D-山梨醇、D-棉子糖、尿素酶、L-吡咯烷酮芳胺酶陰性，奧普托欣、新生霉素耐藥等，均符合停乳鏈球菌似馬亞種；且經(jīng)MALDI-TOF-MS的Bruker Biotyper 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定，24株菌均被鑒定為停乳鏈球菌，鑒定分值為2.24±0.07；后續(xù)在停乳鏈球菌16S rRNA及SDSE亞種特異性鏈激酶前體基因的PCR擴(kuò)增中，分別擴(kuò)增出大小約為401 bp及601 bp的目的片段，與預(yù)期擴(kuò)增片段相符，且測(cè)序上傳NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST分析比對(duì)，24株菌的16S rRNA基因的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的停乳鏈球菌比對(duì)相似度最高，為97.98%～100.00%；24株菌的鏈激酶前體基因的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的停乳鏈球菌似馬亞種比對(duì)相似度最高，為98.19%～100.00%。綜上，本研究中24株菌株均鑒定為停乳鏈球菌似馬亞種。

2.2 標(biāo)本臨床分布情況 24株SDSE主要分離自咽拭子(14株)，占58.33%；其次為皮膚分泌物(5株)、血液(2株)、腹水(1株)、尿液(1株)、陰道分泌物(1株)。根據(jù)美國(guó)嚴(yán)重鏈球菌感染工作組的定義可將SDSE感染分為侵襲性和非侵襲性感染[16]，其中侵襲性感染4例，非侵襲性感染20例。

2.3emm分型 24株SDSE菌株被分成5種emm類(lèi)型(表3)，分別為stCNSRT2.0、stG840.0、stG485.0、stG643.0、stG245.0，其中以stCNSRT2.0(n=16，66.7%)占優(yōu)勢(shì)，其次是stG840.0(n=3，12.5%)。在侵襲性感染中以stG840.0(n=2，50.0%)為主，在非侵襲性感染中以stCNSRT2.0(n=16，80.0%)為主。

表3 SDSE分離株的分子特征Tab.3 Molecular characteristics of SDSE isolates

2.4 MLST分型 對(duì)7個(gè)管家基因的擴(kuò)增和測(cè)序比對(duì)顯示，24株SDSE被分成6種序列型(表3)，分別為ST44、ST128、ST269、ST127、ST323、ST605，流行株以ST44(n=17，70.8%)為主，其次為ST128、ST269各2株。其中ST605為本研究中首次報(bào)告的新的ST型，ST605型的xpt基因與目前數(shù)據(jù)庫(kù)中的等位基因型均不同，上傳數(shù)據(jù)庫(kù)后被定義為一個(gè)新的等位基因型xpt(113)。序列比對(duì)結(jié)果表明新定義的xpt(113)與xpt(85)之間僅存在一個(gè)堿基的差異(圖1)。在侵襲性感染中無(wú)優(yōu)勢(shì)ST型，ST127、ST128、ST323、ST269各1株；在非侵襲性感染中以ST44(n=17，85.0%)為主。在單位點(diǎn)變異(Single Locus Variants，SLV)水平上，這些ST型被分為2個(gè)克隆群(CC)和2個(gè)獨(dú)特型(Singleton)，其中克隆群以CC44/323(n=18，75.0%)占優(yōu)勢(shì)，其次是CC269/605(n=3，12.5%)；獨(dú)特型分別是ST128(n=2，8.3%)和ST127(n=1，4.2%)。在侵襲性感染中，無(wú)優(yōu)勢(shì)克隆群，CC44/323和CC269/605各1株；而在非侵襲性感染中，CC44/323(n=17，85.0%)為優(yōu)勢(shì)克隆群。

圖1 xpt(85)與xpt(113)等位基因的序列比對(duì)Fig.1 Sequence alignment of alleles between xpt(85) and xpt(113)

2.5emm分型與ST型的比較分析 stG485.0與ST128、stG643.0與ST269均具有良好的一致性。在emm分型stCNSRT2.0與ST44之間也觀察到較高的相關(guān)性，在17株ST型為ST44的菌株中有16株emm分型均為stCNSRT2.0，僅1株emm分型為stG245.0。同時(shí)，我們的實(shí)驗(yàn)也觀察到一種emm分型(stG840.0)與一種以上的ST型(ST127、ST323、ST605)相關(guān)聯(lián)。在非侵襲性感染中，stCNSRT2.0與CC44/323具有較好的一致性；在侵襲性感染中，emm分型與克隆群之間未觀察到明顯的相關(guān)性。

2.6 菌株聚類(lèi)分析 通過(guò)Bionumeric 6.6軟件，對(duì)本研究中24株停乳鏈球菌似馬亞種分離株MLST分型的7個(gè)位點(diǎn)、相應(yīng)的ST型、克隆群以及菌株相關(guān)臨床信息進(jìn)行樹(shù)狀圖聚類(lèi)分析(圖2)，菌株間相似度為13.9%～100%。其中ST44和ST323、ST269和ST605親緣關(guān)系較近，在85%相似度水平上，17株ST44與1株ST323聚集成一簇，2株ST269和1株ST605聚集成一簇。

圖2 24株停乳鏈球菌似馬亞種菌株MLST聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖Fig.2 Tree map of MLST cluster analysis of 24 Streptococcus dysgalactiae subspecies equisimilis strains

3 討 論

停乳鏈球菌屬于鏈球菌屬，根據(jù)蘭氏血清分群，可分為G群(約3/4)、C群(約1/4)、A群和L群(偶爾)[2]。停乳鏈球菌分為停乳鏈球菌似馬亞種(SDSE)和停乳鏈球菌停乳亞種(Streptococcusdysgalactiaesubspeciesdysgalactiae，SDSD)。SDSD在很大程度上被認(rèn)為是一種動(dòng)物病原，大多對(duì)動(dòng)物致病，極少有報(bào)道人類(lèi)感染的病例[17]。而SDSE是一種人獸共患病原體，近10年來(lái)，在中國(guó)、日本、韓國(guó)、美國(guó)等世界各地，由停乳鏈球菌似馬亞種引起侵襲性感染并導(dǎo)致暴發(fā)播散的報(bào)道越來(lái)越多[18]。在本研究中， 16.7%的SDSE菌株分離自侵襲性感染患者，低于Loubinoux等[19]研究中的高發(fā)病率(60%)。長(zhǎng)期以來(lái)SDSE被認(rèn)為可寄居健康人咽部，但2003—2020年我國(guó)各地就陸續(xù)出現(xiàn)多起由SDSE引起的以上呼吸道癥狀為主的聚集性發(fā)熱事件[2,12-13,20-22]，且在本研究中大多數(shù)的SDSE菌株(58.3%)均分離自咽部，提示該菌可能通過(guò)呼吸道傳播感染咽部引起致病，需引起臨床醫(yī)生的注意。同時(shí)，本研究中20.8%的SDSE菌株來(lái)自皮膚，僅次于咽部，在其他已報(bào)道的研究中分離率分別為30.8%[19]和51%[23]，提示皮膚也是SDSE菌引起臨床感染的重要部位。

分子流行病學(xué)研究是追蹤人類(lèi)和動(dòng)物病原體出現(xiàn)和傳播的重要方法[24]。M蛋白是SDSE和化膿性鏈球菌的主要毒力因子，由emm基因編碼[25]。M蛋白通過(guò)阻止補(bǔ)體在細(xì)胞表面的附著從而保護(hù)細(xì)菌免受吞噬作用，編碼M蛋白的基因emm中的核苷酸變異被用來(lái)在亞種水平上對(duì)SDSE和化膿性鏈球菌進(jìn)行分型[26]。現(xiàn)在許多研究已將emm分型用于人類(lèi)SDSE分離株的流行病學(xué)調(diào)查[19,27-28]。在我們的研究中，emm分型流行株以stCNSRT2.0、stG840.0為主，占所有SDSE分離株的79.2%，與挪威[29](stG485、stG6 和stG643為主)，日本[30-31](st6792或亞型 stG6792.3、stG485和stG2078為主)，美國(guó)[32](stG6、stG245、stG2078和stG643為主)，中國(guó)北京地區(qū)[25](stG245.0、stG652.0和stG485.0為主)都不同，故推測(cè)優(yōu)勢(shì)株的不同可能是由于地理位置差異造成的。本研究中咽拭子來(lái)源菌株的emm分型均為stCNSRT2.0，而其他感染來(lái)源的菌株和emm類(lèi)型之間沒(méi)有觀察到明顯的關(guān)聯(lián)。Lu BH等[25]的研究結(jié)果顯示在引起血液感染的分離株中，stG245.0和stG485.0是最常見(jiàn)的emm型，在本研究中，這2種emm類(lèi)型則分布在皮膚軟組織和腹水標(biāo)本中，未出現(xiàn)在血液標(biāo)本中。由于本研究的樣本量較少，福建地區(qū)的優(yōu)勢(shì)emm分型及emm類(lèi)型與感染來(lái)源的聯(lián)系還有待未來(lái)更大規(guī)模的科學(xué)臨床研究來(lái)驗(yàn)證。

多位點(diǎn)序列分型(Multilocus Sequence Typing，MLST)是一種基于核酸序列測(cè)定的基因分型方法，它通過(guò)對(duì)多個(gè)管家基因進(jìn)行測(cè)序分析，從而鑒定其位點(diǎn)上的遺傳變異情況[15]。MLST與傳統(tǒng)分子生物學(xué)分型方法相比，具有更高的分辨能力，能將細(xì)菌區(qū)分為更多不同的型，確定它們之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及與疾病的聯(lián)系，因此近年來(lái)逐漸被廣泛接受和使用[33]。本研究使用MLST對(duì)24株SDSE分離株進(jìn)行分型，菌株間相似度為13.9%～100%，展現(xiàn)出該菌具有多樣性。結(jié)果顯示，本研究中SDSE分離株的優(yōu)勢(shì)ST型是ST44，占總分離株的70.8%，在北京地區(qū)[25]臨床分離的56株SDSE菌株中以ST127、ST271、ST44為流行ST型,而目前國(guó)內(nèi)其他省份仍缺乏關(guān)于該菌分子分型的相關(guān)報(bào)道信息。此外，本研究中所有咽拭子標(biāo)本的MLST分型均為ST44，與此同時(shí)，2013年在我國(guó)成都某醫(yī)院30名醫(yī)護(hù)人員暴發(fā)的集體性扁桃體咽炎事件中分離出ST44型的SDSE分離株[2]，因此推測(cè)出SDSE菌株的ST44型可能通過(guò)感染咽部引起致病，有必要提高對(duì)該種ST型的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)以達(dá)到早期預(yù)防與診斷。

ST605為本研究中新發(fā)現(xiàn)的型別，其他地區(qū)尚未報(bào)道。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，ST605與ST474之間僅存在xpt位點(diǎn)的差異，且ST605的xpt(113)與ST474的xpt(85) 也僅有一個(gè)堿基的變異，表明ST605與ST474親緣關(guān)系很近，此次新發(fā)現(xiàn)的ST605很可能是由ST474菌株變異而來(lái)的，其流行病學(xué)意義尚有待進(jìn)一步觀察。

目前，emm分型和MLST都是研究停乳鏈球菌的主要分子分型技術(shù)，能將不同實(shí)驗(yàn)室間的結(jié)果比對(duì)，各有優(yōu)劣。前者應(yīng)用廣泛，系統(tǒng)性最強(qiáng)；后者分辨率高，從而進(jìn)行菌株溯源和遺傳進(jìn)化分析[34]。在本研究中，24株SDSE菌株被分為5個(gè)emm類(lèi)型和6個(gè)ST型，MLST分辨率略高于emm分型，這與Beatriz等人[16]的研究相符。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，83%左右的SDSE分離株具有emm分型和ST型的獨(dú)特組合(stCNSRT2.0- ST44、stG485.0- ST128、stG643.0- ST269)，表明SDSE的emm分型和MLST分型具有一定的關(guān)聯(lián)性，這與Yin J等人[35]的研究發(fā)現(xiàn)是一致的。同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)了emm分型stG840.0與3種遺傳距離相差較遠(yuǎn)的ST型(ST127、ST323、ST605)相關(guān)聯(lián)，一些研究者認(rèn)為，emm基因可在β溶血性鏈球菌之間水平轉(zhuǎn)移，有利于SDSE的emm基因發(fā)生變異[36-37]，這可能解釋了本研究中emm分型和ST型不具有完全一致性的原因。有數(shù)據(jù)表明，重組是SDSE發(fā)生遺傳多樣化的主要機(jī)制，其發(fā)生頻率是管家基因點(diǎn)突變的4倍[27]。由此，可推測(cè)SDSE基因中存在某些特殊的特征使它們?cè)诓煌貐^(qū)占優(yōu)勢(shì)，鑒于其人獸共患的潛力，仍需持續(xù)關(guān)注該菌的自然遺傳進(jìn)化。

綜上所述，本研究應(yīng)用兩種分型技術(shù)揭示了福建地區(qū)SDSE存在的某些特定emm分型和ST型，豐富了福建省對(duì)該菌株的分子流行病學(xué)研究，將為今后探索SDSE毒力的進(jìn)化和種群遺傳學(xué)提供一定基礎(chǔ)。但是本研究的SDSE菌株數(shù)量有限，且侵襲性菌株僅4株，代表性不夠，不足以完全闡明該菌株的分子生物學(xué)特征，仍有待將來(lái)更多科學(xué)的、更大樣本量的研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：何放晴，李曲文，張志珊，等. 24株停乳鏈球菌似馬亞種的分子鑒定和基因分型[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(7)：607-613. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.086