劉 坤，王淑婷，田麗華，王玉東*，宋翠平*

(1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品衛(wèi)生質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，山東 青島 266032；2.青島市黃島區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東 青島266400)

頭孢噻呋(ceftiofur)又名“賽得?！?，是第一個(gè)專(zhuān)門(mén)用于動(dòng)物的第三代頭孢類(lèi)抗菌素[1]，由Benard Labeouw在1984年率先合成，后由美國(guó)法瑪西亞-普強(qiáng)公司[2]制作成鹽酸鹽懸濁液和鈉鹽凍干粉。1988年，該藥在美國(guó)首次上市，因其抗菌活性?xún)?yōu)良，藥物動(dòng)力學(xué)良好的特點(diǎn)，先后被日本、美國(guó)等國(guó)家正式批準(zhǔn)用于動(dòng)物的呼吸道感染疾病的治療，顯示了在獸醫(yī)臨床應(yīng)用的廣闊前景[3]。近年來(lái)，該藥物在我國(guó)被廣泛使用，被制成各種劑型，廣泛用于獸醫(yī)臨床。2021年我國(guó)批準(zhǔn)了美國(guó)2家公司的鹽酸頭孢噻呋注射液2種新獸藥的進(jìn)口注冊(cè)[4]。頭孢噻呋在體內(nèi)分布廣泛，在體內(nèi)生成有活性的代謝產(chǎn)物，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成無(wú)活性的產(chǎn)物，從糞和尿中排泄[5-6]。對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的抗菌活性較強(qiáng)[7]，具有廣譜殺菌作用，對(duì)頭孢噻呋敏感的病原菌主要有溶血性巴氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、胸膜肺炎放線桿菌[8-9]，及葡萄球菌、鏈球菌等。其作用機(jī)制為作用于細(xì)菌內(nèi)的轉(zhuǎn)肽酶，阻斷粘肽的合成,可使細(xì)菌缺失細(xì)胞壁而死亡,達(dá)到快速殺菌的效果[10]。臨床主要用于治療溶血性巴氏桿菌和胸膜肺炎放射桿菌引起的動(dòng)物呼吸道感染疾病。

頭孢噻呋對(duì)動(dòng)物的的毒性作用較小，不良反應(yīng)一般在用藥幾天后才出現(xiàn)，主要表現(xiàn)為皮疹等過(guò)敏癥狀。頭孢噻呋與妥布霉素或氨基糖苷類(lèi)藥物聯(lián)合使用對(duì)腎有毒性作用，如何減少毒副作用，對(duì)藥物進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究非常必要。本試驗(yàn)旨在通過(guò)比較三種鹽酸頭孢噻呋注射液在白羽雞體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化規(guī)律，以判斷新研制的鹽酸頭孢噻呋的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)是否符合有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)，為國(guó)內(nèi)創(chuàng)新藥物研究和現(xiàn)有藥物的臨床合理用藥，以及確定用藥間隔及頻次、制定休藥期和防止獸藥殘留提供參考。

1 材 料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 40只健康白羽雞，25日齡，體重1.4 kg左右，由山東亞太中慧雞場(chǎng)提供，雞群已按規(guī)定日齡接種新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊病等疫苗，未使用過(guò)任何藥物。飼養(yǎng)在試驗(yàn)雞舍普通飼養(yǎng)籠具內(nèi)，溫度控制在(20±2)℃。飼喂不含任何抗菌藥物的飼料，每天定時(shí)定量給料兩次。臨床觀察一周，表現(xiàn)健康。試驗(yàn)前12小時(shí)及給藥后4小時(shí)禁食，供給充足飲水，禁食后水中加1%的葡萄糖以補(bǔ)充試驗(yàn)動(dòng)物體力。

1.2 試驗(yàn)器材 Agilent 2100高效液相色譜儀；電子天平JY2012型，北京科技儀器廠；臺(tái)式離心機(jī)LGT-18G型，上海滬西儀器廠；微型渦旋混合儀WH-6型，天津精密科學(xué)儀器有限公司；分析天平AUY180型，島津試驗(yàn)計(jì)測(cè)事業(yè)部；液體快速混合機(jī)YKZ型，哈爾濱醫(yī)療器械廠；超聲波清洗機(jī)XKQ-200B，南京超聲儀器有限公司；高速分散均質(zhì)機(jī) FJ-400型，成都標(biāo)本模型廠；軌道式搖床KS510 digital型，德國(guó)IKA公司；MCX小柱MCX BondElut Varian 1CC 100MG，德國(guó)CNM公司。

1.3 試驗(yàn)藥品及試劑 鹽酸頭孢噻呋注射液：美國(guó)鹽酸頭孢噻呋：規(guī)格：100 mL∶5 g美國(guó)碩騰，含量5%，批號(hào)0A4SM。大中農(nóng)鹽酸頭孢噻呋：規(guī)格：100 mL∶5 g河南大中農(nóng)動(dòng)物藥業(yè)有限公司，含量5%，批號(hào)獸藥6288288。新研制鹽酸頭孢噻呋：規(guī)格：100 mL∶5 g山東某生物科技公司，含量5%。

乙腈(南京化學(xué)試劑股份有限公司)、氯化鉀(上海市化學(xué)試劑廠)、四硼酸鈉(上海化學(xué)試劑有限公司)、三氟乙酸(美國(guó)TEDIA天地試劑有限公司)、二硫赤鮮醇(Amrosce 02450)、碘乙酰胺(美國(guó)ACROS生物有限公司)、乙酸銨(天津化工有限公司)

1.4 主要溶液的配制 頭孢噻呋儲(chǔ)備液：稱(chēng)取頭孢噻呋對(duì)照品，用0.05 mol/L的乙酸銨溶液稀釋成每1 mL中約含頭孢噻呋1000 μg的溶液，作為頭孢噻呋備用液，臨用前用0.05 mol/L的乙酸銨溶液配成梯度濃度為0.5-200 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)液。

2 方 法

2.1 動(dòng)物試驗(yàn)

2.1.1 分組及給藥 40只健康白羽雞，隨機(jī)分成四組?？瞻捉M10只，注射生理鹽水，2.5 ml/kg體重。另外三組肌肉注射(美國(guó)鹽酸頭孢噻呋、大中農(nóng)鹽酸頭孢噻呋、新研制鹽酸頭孢噻呋)給藥進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)試驗(yàn)，試劑均為2.5 mg/kg體重。

空白組(10只)：編號(hào)K1～K10

試驗(yàn)1組(10只)：美國(guó)鹽酸頭孢噻呋編號(hào)A1～A10

試驗(yàn)2組(10只)：大中農(nóng)鹽酸頭孢噻呋編號(hào)B1～B10

試驗(yàn)3組(10只)：新研制鹽酸頭孢噻呋編號(hào)C1～C10

2.1.2 采樣及保存 通過(guò)雞翅下靜脈采集血液樣品。給藥前采一次空白血。按照2.5 mg.kg-1b.w劑量給試驗(yàn)雞肌肉注射(美國(guó)鹽酸頭孢噻呋、大中農(nóng)鹽酸頭孢噻呋、新研制鹽酸頭孢噻呋)給藥后分別于15、30、45 min及1.5、2、2.5、4、6、8、24、30、48、72、96、144 h采集血樣。每次采血1.5-2 mL，放入含EDTA-2K的離心管中，離心、分離血漿、-20 ℃保存，待測(cè)。

2.2 血漿中藥物含量分析方法

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm,ID)；流動(dòng)相A為0.1%三氟乙酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，按下表進(jìn)行梯度洗脫；流速為每分鐘1 mL；檢測(cè)波長(zhǎng)為266 nm；柱溫為30 ℃。進(jìn)樣量為50 μL。

表1 色譜柱梯度洗脫表

2.2.2 樣品分析前預(yù)處理 將冷凍存放的血漿，放在常溫下自然解凍，然后搖勻取血漿0.5 mL放入10 mL具塞離心管中，加入1.2 mL提取液，渦旋1 min混勻，放入50 ℃恒溫?fù)u床，20 min。取出靜置，待冷卻到室溫，加入0.5 mL 10%碘乙酰胺溶液，渦旋10 s，用錫紙包好放入30 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中，200 r/min衍生30 min。衍生后的混合液體加20%的磷酸100 μL酸化，加水1.25 mL混勻。4 ℃,12000 r/min離心20 min，取上清液備用。

MCX小柱依次加入3 mL甲醇、3 mL水活化，然后加入上一步衍生化所得的上清液，再依次加入3 mL水、3 mL色譜甲醇來(lái)淋洗；加入2 mL乙酸銨：乙腈(85+15，v/v)混合液洗脫；用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)所得的洗脫液，精確量取40 μL溶液注入液相色譜儀。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取9支離心管，依次加入空白血漿0.45 mL，再依次加入50 μL系列濃度的頭孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)液(0.5-200 μg·mL-1)，渦旋混勻，制備的樣品中含頭孢噻呋的系列濃度為0.05-20 μg·mL-1，第一支管作空白對(duì)照。按2.2.2 樣品分析前預(yù)處理方法進(jìn)行處理后，測(cè)定。將藥物峰面積與相應(yīng)藥物濃度作線性回歸，求標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)和回歸方程。

2.2.4 靈敏度(最低檢測(cè)限、最低定量限)、回收率、精密度的考察 分別將0.1、2和40 μg·mL-1三種藥物濃度的樣品當(dāng)作考察對(duì)象，每個(gè)濃度制作三份樣品，按照血漿樣品分析前預(yù)處理方法處理，進(jìn)行高效液相測(cè)定，測(cè)出日間變異系數(shù)、日內(nèi)變異系數(shù)，連續(xù)測(cè)3 d。

回收率：加樣提取液的藥物峰面積/標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積×100%

日內(nèi)、日間變異系數(shù)(精密度)：標(biāo)準(zhǔn)差/平均數(shù)×100%

最低檢測(cè)限：三倍信噪比時(shí)，儀器測(cè)定的進(jìn)樣藥物量與樣品溶液濃度的比值。

最低定量限：十倍信噪比時(shí)，進(jìn)樣藥物量被定量測(cè)定的最低量。

3 結(jié)果與分析

3.1 方法專(zhuān)屬性 在試驗(yàn)建立的色譜條件下，血漿中的DCA與其他干擾雜質(zhì)可以有效分離，色譜見(jiàn)圖3-圖6。DCA的出峰時(shí)間在9.2 min。

圖1 空白血漿色譜圖

圖2 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖3 空白血漿添加鹽酸頭孢噻呋色譜圖

圖4 實(shí)測(cè)色譜圖

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 經(jīng)過(guò)不斷摸索試驗(yàn)條件,血漿標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的藥物濃度線形范圍、回歸方程均符合試驗(yàn)的要求。線性范圍在0.05至40之間，相關(guān)系數(shù)是0.999?；貧w方程(x：標(biāo)準(zhǔn)品在空白血漿的濃度，y：藥物峰面積)和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見(jiàn)圖6。

圖6 雞肌注射美國(guó)鹽酸頭孢噻呋、大中農(nóng)鹽酸頭孢噻呋和新研制鹽酸頭孢噻呋后血藥濃度-時(shí)間曲線

表2 鹽酸頭孢噻呋在血漿中的標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)

圖5 DCA在血漿中的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3 方法學(xué)驗(yàn)證數(shù)據(jù)

3.3.1 靈敏度考察 最低檢測(cè)限：0.05 μg/mL；最低定量限：0.1 μg/mL。

3.3.2 回收率和精密度考察 血藥濃度在0.1、5、40 μg/mL時(shí)，回收都在90%左右，精密度在2.97至4.63之間，均符合試驗(yàn)要求。按照樣品預(yù)處理方法，在血漿中添加藥物，測(cè)得精密度和回收率數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

表3 雞空白血漿添加鹽酸頭孢噻呋的方法學(xué)考察結(jié)果

3.4 血漿中的藥物濃度 白羽雞肌肉注射鹽酸頭孢噻呋后，體內(nèi)血藥濃度在4時(shí)達(dá)到最大值，30時(shí)已檢測(cè)不到藥物，表明藥物在30時(shí)藥物已基本代謝完。各時(shí)間點(diǎn)血漿藥物濃度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4和圖7。

表4 雞單次肌注鹽酸頭孢噻呋(2.5 mg.kg-1)血藥濃度

3.5 頭孢噻呋藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù) 三種鹽酸頭孢噻呋(2.5 mg.kg-1 b.w.)的平均藥動(dòng)學(xué)參數(shù)采用SPSS比較差異性，見(jiàn)表5。

通過(guò)表5中的各項(xiàng)平均藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)可以看出，白羽雞肌肉注射美國(guó)鹽酸頭孢噻呋4個(gè)小時(shí)后，血藥濃度達(dá)到峰值，最高血藥濃度為2.47 μg.mL-1，血漿中平均消除半衰期為4.22 h，AUC為19.1 μg.h.mL-1，平均滯留時(shí)間MRT為7小時(shí)；注射大中農(nóng)鹽酸頭孢噻呋4 h后，血藥濃度達(dá)到峰值，最高血藥濃度為2.49 μg.h.mL-1，血漿中平均消除半衰期為4.02小時(shí)，AUC為21.1 μg.h.mL-1，平均滯留時(shí)間MRT為7 h；注射新研制鹽酸頭孢噻呋4 h后，血藥濃度達(dá)到峰值，最高血藥濃度為2.61 μg.h.mL-1，血漿中平均消除半衰期為4.22 h，AUC為24.1 μg.h.mL-1，平均滯留時(shí)間MRT為7 h。結(jié)果表明三種劑型的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)差異不顯著。

表5 三種鹽酸頭孢噻呋(2.5 mg.kg-1 b.w.)的平均藥動(dòng)學(xué)參數(shù)差異性分析結(jié)果

4 討論與結(jié)論

白羽雞肌肉注射頭孢噻呋注射液后，三種藥物達(dá)峰時(shí)間一樣，都是注射藥物后4 h血藥濃度達(dá)峰值。通過(guò)注射液峰濃度來(lái)看，本新研制鹽酸頭孢噻呋的最高血藥濃度稍微偏高，這是優(yōu)勢(shì)。

4.1 血漿樣品的分離和提取 藥物進(jìn)入體內(nèi)后快速的失去β-呋喃甲?；捎谢钚缘拇x產(chǎn)物，在血漿中很少以游離狀態(tài)存在，主要與半胱氨酸形成二硫化合物，與血漿蛋白或組織蛋白結(jié)合形成去呋喃甲酰蛋白復(fù)合物，還可形成二聚物。本試驗(yàn)選用碘乙酰胺作為衍生試劑，采用二硫赤鮮醇作為提取劑，該方法每天處理四十多個(gè)樣品，簡(jiǎn)單方便，比1990年Jalan[11]的每天處理十幾個(gè)樣品先進(jìn)許多。新研制鹽酸頭孢噻呋的預(yù)處理方法可用于生物等效性的研究和藥動(dòng)學(xué)的研究。

4.2 提取液濃度的選擇 在血漿樣品中加入不同濃度的提取液，觀察對(duì)回收率的影響。取含有0.02%、0.2%、2%三個(gè)濃度的二硫赤鮮醇提取液，每個(gè)濃度取5個(gè)重復(fù),回收率分別為65.61%、90.5%和67.46%，所以試驗(yàn)中提取液濃度選為0.2%。加入不同濃度衍生試劑到樣品中，觀察對(duì)回收率的影響，取含有0.14%、1.4%、14%三個(gè)濃度的碘乙酞胺溶液提取液，每個(gè)濃度取5個(gè)重復(fù)，回收率分別是67.61%、90.53%和65.76%，所以試驗(yàn)中衍生試劑的濃度選用1.4%。

4.3 組織樣品色譜條件的選擇 Barker等[12]曾報(bào)道了美國(guó)鹽酸頭孢噻呋在動(dòng)物組織中的高效液相檢測(cè)方法，所用的色譜柱是AglentTC-C18柱。本試驗(yàn)所采用的流動(dòng)相也是AglentTC-C18柱。將衍生后的DCA進(jìn)行高效液相檢測(cè)，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定，結(jié)果顯示，DCA在266 nm處有最大吸收峰，并且干擾較小，因此檢測(cè)DCA的檢測(cè)波長(zhǎng)選用266 nm。

4.4 白羽雞肌肉注射鹽酸頭孢噻呋的藥動(dòng)學(xué)特征 頭孢噻呋抗菌活性?xún)?yōu)良，在臨床中前景廣闊。頭孢噻呋能治療犬的泌尿系統(tǒng)感染；馬、羊、豬的肺炎、呼吸道感染等疾病，還可用于仔豬的斷尾和斷齒等引起的傷口感染；牛的子宮炎、呼吸道感染、腐蹄炎；本藥對(duì)沙門(mén)氏菌和大腸桿菌等病原菌引起的雞苗死亡有顯著地防治效果[13-14]。

陳啟友等[15]隨機(jī)將12頭健康豬分為兩組，分別注射美國(guó)輝瑞美國(guó)鹽酸頭孢噻呋注射液、上海公誼獸藥廠的長(zhǎng)效鹽酸頭孢噻呋注射液,每頭5 mg/kg。比較了進(jìn)口頭孢噻呋注射液和國(guó)產(chǎn)頭孢噻呋注射液豬肌肉注后的藥物動(dòng)力學(xué)特征。結(jié)果表明：參數(shù)tmax、Cmax、MRT差異極顯著(P<0.01)，長(zhǎng)效鹽酸頭孢噻呋注射液肌注給藥比美國(guó)鹽酸頭孢噻呋注射液吸收慢,達(dá)峰時(shí)間推后,達(dá)峰濃度較低,駐留時(shí)間延長(zhǎng)；參數(shù)AUC、Kel、t1/2無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

張志成等[16]以制劑的穩(wěn)定性當(dāng)作評(píng)價(jià)指標(biāo), 以玉米油為溶媒,加入適量的輔料,采用正交設(shè)計(jì)的方法，據(jù)鹽酸頭孢噻呋藥物的特性設(shè)立了鹽酸頭孢噻呋混懸劑的制備方法。采用6個(gè)月加溫加濕，10天光加速試驗(yàn)的方法對(duì)制備的混懸劑進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià),研究了對(duì)鹽酸頭孢噻呋混懸劑的穩(wěn)定性，結(jié)果外觀性狀、粒度等指標(biāo)均無(wú)明顯變化,表明該制劑對(duì)光、熱穩(wěn)定,基本符合藥劑學(xué)中規(guī)定的混懸劑的要求,可順利進(jìn)行注射給藥。試驗(yàn)證明該制劑穩(wěn)定性好,工藝簡(jiǎn)單,刺激性小,具有較好的緩釋效果;制劑的主要制劑學(xué)參數(shù)與輝瑞公司生產(chǎn)的鹽酸頭孢噻呋注射用混懸劑的主要制劑學(xué)參數(shù)比較差異不顯著。藥物動(dòng)力學(xué)是藥物通過(guò)各種途徑進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，吸收、分布、代謝和排泄的過(guò)程的“血藥濃度-時(shí)間”變化規(guī)律的一門(mén)科學(xué)。試驗(yàn)結(jié)果表明，白羽雞肌肉注射進(jìn)口藥、國(guó)產(chǎn)藥和新研制的藥后，三種藥物吸收和消除速度差異不顯著?？偟膩?lái)說(shuō)，新研制鹽酸頭孢噻呋、大中農(nóng)鹽酸頭孢噻呋和美國(guó)鹽酸頭孢噻呋注射液的藥物動(dòng)力學(xué)相當(dāng)。

4.5 結(jié)論 試驗(yàn)進(jìn)行了三種劑型藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較，經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)比較顯示美國(guó)鹽酸頭孢噻呋、大中農(nóng)鹽酸頭孢噻呋和新研制的藥物各種參數(shù)差異不顯著(P>0.05)。新研制鹽酸頭孢噻呋的各項(xiàng)參數(shù)符合藥物標(biāo)準(zhǔn)。