農(nóng)藥在植物和微生物中的代謝轉(zhuǎn)化研究進展

劉婷婷 ，李如男 ，董豐收 ，鄭永權(quán) ，李遠播 *

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193；2.濟南大學(xué)，前沿交叉科學(xué)研究院，濟南 250002）

農(nóng)藥作為在當代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用的植物保護投入品，其在防治病蟲害、鏟除雜草和提高作物產(chǎn)量等方面發(fā)揮著不可替代的作用[1]。然而，大量和頻繁地使用農(nóng)藥引發(fā)了一系列環(huán)境安全和食品安全問題。過度使用農(nóng)藥可能會對農(nóng)產(chǎn)品、土壤和水體造成污染，進而經(jīng)過直接攝入或食物鏈富集效應(yīng)傳遞到人體，威脅人類健康[2-4]。同時，轉(zhuǎn)基因作物的大量種植間接導(dǎo)致了農(nóng)藥過量施用，引發(fā)的生態(tài)安全問題也引起相當關(guān)注[5]。在環(huán)境治理方面，一些植物可以吸收和代謝污染土壤/水體中的農(nóng)藥，微生物也可以對農(nóng)藥進行降解與代謝[6-7]。作為農(nóng)藥污染的修復(fù)策略，植物修復(fù)和微生物修復(fù)對減輕農(nóng)藥污染具有重要意義。因此，我們有必要研究農(nóng)藥在植物體內(nèi)的吸收、轉(zhuǎn)運、積累與代謝轉(zhuǎn)化行為和機制，以及微生物降解、代謝和轉(zhuǎn)化農(nóng)藥的行為機制，并制定有效的策略來緩解農(nóng)藥污染導(dǎo)致的生態(tài)環(huán)境問題。

農(nóng)藥被植物根和葉等部位吸收后，經(jīng)共質(zhì)體或質(zhì)外體途徑運輸?shù)狡渌课贿M而富集，然后在體內(nèi)多種代謝酶的參與下進行代謝與轉(zhuǎn)化。一般來說，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物毒性較小，但是某些農(nóng)藥經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化及活化后毒性增強，增加了環(huán)境風(fēng)險[8-10]。與植物不同，微生物一般只作為降解農(nóng)藥的工程菌，當農(nóng)藥滲入菌體后，其可直接對農(nóng)藥進行降解與代謝[7,11]。由于兩者生命結(jié)構(gòu)的不同，其代謝過程有相似之處，但也存在差異。研究農(nóng)藥在植物和微生物中的代謝轉(zhuǎn)化行為，一方面有利于對農(nóng)藥的環(huán)境暴露進行風(fēng)險評估，以明確其在靶標植物和非靶標植物中的殘留行為，從而指導(dǎo)農(nóng)藥的安全合理使用；另一方面作為基因工程植物和微生物對農(nóng)藥面源污染修復(fù)具有重要的應(yīng)用價值。此外，深入探索農(nóng)藥在植物和微生物體內(nèi)的代謝調(diào)控機制，為綠色農(nóng)藥的創(chuàng)制、植物抗性基因的挖掘、抗性轉(zhuǎn)基因作物的培育以及基因工程植物及微生物的構(gòu)建等提供一定的理論基礎(chǔ)。

本文聚焦農(nóng)藥在植物和微生物中的代謝轉(zhuǎn)化行為及其機制，綜述了農(nóng)藥在兩者中的代謝轉(zhuǎn)化行為，影響農(nóng)藥代謝轉(zhuǎn)化的因素，代謝轉(zhuǎn)化研究策略與方法，代謝機制及其應(yīng)用，以期為農(nóng)藥的安全合理使用、轉(zhuǎn)基因作物的培育及污染修復(fù)策略提供進一步參考。

1 農(nóng)藥在植物中的吸收、轉(zhuǎn)運、累積與代謝轉(zhuǎn)化

一般農(nóng)藥均可以被植物各部位吸收或滲透到植株內(nèi)部組織，經(jīng)共質(zhì)體途徑或質(zhì)外體途徑運輸。由于藥劑性質(zhì)和植株各部位構(gòu)成組分的差異，不同農(nóng)藥在植株各部位具有不同的累積行為[12-13]。農(nóng)藥一旦過量累積，會損害植株的生理結(jié)構(gòu)，引起植物毒性[10,14]。大多數(shù)累積在植物體內(nèi)的農(nóng)藥在體內(nèi)代謝酶的介導(dǎo)下可通過多種特異性代謝途徑或生化反應(yīng)來解毒[15]。

1.1 農(nóng)藥在植物中的吸收、轉(zhuǎn)運與累積

在實際田間應(yīng)用過程中，農(nóng)藥通過不同的途徑進入植物組織，如葉面噴霧、根部施用和種子處理等[16-17]。如圖1所示，農(nóng)藥噴灑到葉片后，首先穿透葉片的角質(zhì)層和表皮，到達質(zhì)外體，然后通過質(zhì)膜進一步傳導(dǎo)到共質(zhì)體中。有些農(nóng)藥在此過程中需要載體的參與，如氨基酸轉(zhuǎn)運體（AtLHT1）[18-19]。農(nóng)藥進入共質(zhì)體后，通過韌皮部傳導(dǎo)分布，但大多數(shù)農(nóng)藥難以經(jīng)韌皮向下運輸?shù)礁俊Ｒ恍?dǎo)向農(nóng)藥通過基于植物內(nèi)源分子的載體修飾，如氯蟲苯甲酰胺（CAP）偶聯(lián)丙氨酸（Ala）形成CAP-Ala后，在AtLHT1轉(zhuǎn)運體的介導(dǎo)作用下可實現(xiàn)由韌皮部向根部運輸（圖1）[19-21]。大多數(shù)殺蟲劑和殺菌劑可施用于根部或周圍土壤中，在蒸騰拉力的作用下傳導(dǎo)至地上部分[22]。Fan等[23]研究發(fā)現(xiàn)，氯蟲苯甲酰胺和四氯蟲酰胺均可被玉米根系吸收并輸送到植株上部分，證明了蒸騰拉力是其向上轉(zhuǎn)運的主要因素。用農(nóng)藥處理種子后，種皮和子葉對藥劑進行存儲。當種子發(fā)芽后，藥劑被吸收，進而轉(zhuǎn)運到幼苗體內(nèi)發(fā)揮作用。種子途徑與根系途徑對藥劑吸收轉(zhuǎn)運的協(xié)同作用應(yīng)值得關(guān)注[24]。

圖1 載體介導(dǎo)的導(dǎo)向農(nóng)藥在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運行為[21]

農(nóng)藥在植株體內(nèi)的傳導(dǎo)方式可分為局部傳導(dǎo)、向上傳導(dǎo)和雙向傳導(dǎo)[25]，其在植物體內(nèi)的累積行為受到多種因素的影響。有研究發(fā)現(xiàn)，噻蟲嗪較易累積在小松菜根部，向葉部遷移能力較弱，而啶蟲脒較易向葉部遷移，不易在根部累積。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，2種農(nóng)藥累積行為的不同與其分子量有關(guān)[12]。另一項研究則發(fā)現(xiàn)，農(nóng)藥在植株各部位的累積行為與辛醇-水分配系數(shù)（logKow）有關(guān)，藥劑的logKow值越大，藥劑越容易在根部累積；logKow值越小，藥劑越容易向上傳導(dǎo)，進而在葉部累積[13]。本團隊一項最新的研究以小麥為典型作物，明確了吡蟲啉和戊唑醇等11種農(nóng)藥在小麥植株不同部位的累積行為，通過根脂質(zhì)歸一化分析證實了作物根部的脂肪是影響農(nóng)藥富集的重要因子[26]。

1.2 農(nóng)藥在植物中的代謝轉(zhuǎn)化

植物體內(nèi)存在多種代謝酶，植物代謝酶參與農(nóng)藥代謝與解毒的過程[27]。農(nóng)藥在植物中的代謝轉(zhuǎn)化一般可分為3個階段：第1階段（I相）包括氧化、水解和還原等過程，具體參與的酶類主要包括氧化酶（如細胞色素P450、過氧化物酶）、還原酶（如硝基還原酶、醛酮還原酶）和水解酶（如酯酶、酰胺酶和腈酶），該過程可產(chǎn)生更多極性和活性化合物；第2階段（II相）包括激活的I相代謝產(chǎn)物與植物內(nèi)源生物分子（如葡萄糖、氨基酸和谷胱甘肽等）結(jié)合，參與該過程的酶主要有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、糖基轉(zhuǎn)移酶以及丙二?；D(zhuǎn)移酶等；第3階段（III相）是將第2階段形成的軛合產(chǎn)物在ATP轉(zhuǎn)運蛋白的作用下儲存于液泡或聚合成細胞壁組分，從而形成不可提取的殘留。研究表明，Ⅱ相軛合反應(yīng)是植物中農(nóng)藥進行解毒的主要代謝途徑[8,28-30]。

1.2.1 農(nóng)藥在植物中的Ⅰ相代謝

（1）氧化代謝。細胞色素P450酶系屬于酶活性蛋白家族中最大的一類，其活性成分主要由細胞色素P450蛋白和NADPH細胞色素P450還原酶（CPR）組成[31]。細胞色素P450酶通過羥基化、環(huán)氧化、脫烷基化、脫氨和異構(gòu)化等反應(yīng)參與農(nóng)藥在植物中的I相代謝[32-33]。有研究表明，細胞色素P450酶系參與了吡蟲啉等幾種新煙堿類殺蟲劑的氧化代謝，涉及的反應(yīng)主要有羥基化和去甲基化等[28]。（2）水解代謝。水解過程中的水解酶通過向每個產(chǎn)物中加入H＋或OH-來催化底物中某些化學(xué)鍵的裂解[27]。含有酰胺或氨基甲酸酯鍵的農(nóng)藥分子，或含有羰基、磷基和亞硫基鍵的酯類分子，都容易被水解酶水解[15]。（3）還原代謝。還原過程中的硝基還原酶（NTR）主要參與外源物質(zhì)的硝基還原和還原性脫鹵反應(yīng)[34]。含有亞硝基的化合物，如新煙堿類化合物吡蟲啉、噻蟲胺和呋蟲胺等在植物體內(nèi)進行的還原代謝反應(yīng)主要是由硝基還原酶介導(dǎo)[28]。醛酮還原酶（AKR）被報道參與介導(dǎo)水稻中的草甘膦代謝過程，導(dǎo)致水稻對草甘膦產(chǎn)生抗性[35]。此外，AKR超家族廣泛存在于原核生物和真核生物中。由于其廣泛的底物特異性，AKR也可代謝大量的外源物質(zhì)，其中最具特征的是AKR4C家族，其參與醛酮解毒、應(yīng)激防御和次生代謝等反應(yīng)[36]。

1.2.2 農(nóng)藥在植物中的Ⅱ相代謝

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）介導(dǎo)的反應(yīng)。GSTs是一種二聚體多功能酶，具有多種同工型或同工酶。其催化谷胱甘肽硫基的親核攻擊，可與各種親電底物結(jié)合，形成具有較高的水溶性和較低毒性的軛合物。軛合物隨后被轉(zhuǎn)運至液泡并在液泡中進一步被降解[37]。植物中的GSTs主要分為3類，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型[27]。其中，Ⅰ型GSTs包含3個外顯子和2個內(nèi)含子，具有防御基因的功能；其產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以解毒除草劑，或者在抵御病原體攻擊、延緩衰老以及在伴隨這些過程產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)中發(fā)揮積極作用[38]。谷胱甘肽在植物中主要以還原型形式存在，其結(jié)構(gòu)中含有游離硫醇基[39]。作為GSTs的必需底物，谷胱甘肽在許多除草劑和其他外源性或內(nèi)源性物質(zhì)的解毒中起著關(guān)鍵作用[40-41]。例如，谷胱甘肽可以與農(nóng)藥或其他外源物質(zhì)的Ⅰ相代謝產(chǎn)物結(jié)合形成軛合物，形成的軛合物被分解為半胱氨酸和硫代乳酸衍生物，再與丙二酸?；纬蒒-乙酰基半胱氨酸軛合物[41]。這些末端代謝物可能以可溶性代謝物的形式儲存在植物細胞液泡中，或以殘留物的形式儲存在植物細胞壁的生物聚合物中[39]。

糖基轉(zhuǎn)移酶（GTs）介導(dǎo)的反應(yīng)。GTs催化糖與植物內(nèi)源代謝物或外源化學(xué)物質(zhì)的結(jié)合，糖基化的作用是提高底物的水溶性，使底物更容易被甲基化[42]。GTs可將供體分子轉(zhuǎn)移到受體分子上，如尿苷二磷酸（UDP）葡萄糖為植物體內(nèi)最常見的核苷酸糖供體，另外還有UDP-木糖、UDP-鼠李糖和UDP-半乳糖等[15]。含有-OH、-SH、或-NH2基團的外源化合物易與糖基結(jié)合[43]，從而形成含有糖苷鍵的化合物[30]。已有研究證實了GTs在除草劑解毒代謝及選擇性方面具有重要作用，其中O-糖苷共軛是植物對農(nóng)藥解毒的重要結(jié)合方式[44-45]。蘇湘寧[44]研究了水稻糖基轉(zhuǎn)移酶OsIRGT1基因?qū)Ξ惐『鸵也莅返慕到夂徒舛咀饔茫Y(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達水稻株系內(nèi)異丙隆和乙草胺的積累量均顯著低于野生型，這表明糖基轉(zhuǎn)移酶OsIRGT1基因?qū)τ谵r(nóng)藥在植物中的解毒與代謝具有促進作用。張靜靜[45]研究發(fā)現(xiàn)，糖基轉(zhuǎn)移酶OsARGT1基因促進了過表達水稻株系中阿拉特津的降解與代謝。

丙二?；D(zhuǎn)移酶（MTs）介導(dǎo)的反應(yīng)。糖基化軛合物通?？稍贛Ts的作用下，以丙二酰基輔酶A為供體，與丙二酸偶聯(lián)成丙二酸半酯[45]。例如，毒氟磷在大豆豆子和豆葉中的Ⅰ相代謝產(chǎn)物（DFL-M2）在UDP-O-糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下與葡萄糖軛合形成產(chǎn)物DFL-M3，進而在MTs的作用下與丙二酸軛合形成產(chǎn)物DFL-M4[46]。

農(nóng)藥在植物體內(nèi)的Ⅱ相代謝發(fā)生的軛合反應(yīng)主要有葡萄糖共軛、氨基酸共軛、谷胱甘肽共軛和丙二酸共軛等[15]，如溴氰蟲酰胺在番茄中的Ⅱ相代謝中發(fā)生了葡萄糖共軛[47]；苯醚菌酯在黃瓜中的Ⅱ相代謝中與葡萄糖發(fā)生共軛反應(yīng)[48]；Fujisawa等[49]研究了擬除蟲菊酯類和有機磷類等農(nóng)藥的降解產(chǎn)物（酚類、苯胺類和羧基化合物）在浮萍中的代謝轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)幾種降解產(chǎn)物在Ⅱ相代謝中主要發(fā)生了葡萄糖共軛、氨基酸共軛和丙二酸共軛等反應(yīng)。

1.2.3 農(nóng)藥在植物中的Ⅲ相代謝

農(nóng)藥在植物中經(jīng)過氧化水解和共軛結(jié)合等一系列轉(zhuǎn)化過程后進入Ⅲ相代謝，該階段主要是軛合物的隔離和與細胞壁組分的結(jié)合[27]。在三磷酸腺苷（ATP）轉(zhuǎn)運蛋白的作用下，農(nóng)藥在植物中產(chǎn)生的Ⅰ相和Ⅱ相代謝產(chǎn)物從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運至液泡中進行隔離解毒或被進一步分解[50]。Zhang等[51]研究發(fā)現(xiàn)，在紫花苜蓿中，6個ABC轉(zhuǎn)運基因?qū)Π⑻乩虍a(chǎn)生響應(yīng)，這些ABC轉(zhuǎn)運蛋白被認為可在植物細胞中轉(zhuǎn)運氨基酸等內(nèi)源物質(zhì)與外源物質(zhì)形成的軛合物。部分軛合物與細胞壁組分結(jié)合形成不可提取的殘留物。液泡隔離和形成細胞壁組分均是植物體對外源農(nóng)藥的解毒途徑[50]。一般來說，所形成的結(jié)合物將被儲存，不會被進一步代謝，但有些結(jié)合物通過現(xiàn)有的代謝途徑被進一步礦化為它們的無機成分，從而解毒[52-53]。

1.3 影響農(nóng)藥在植物體內(nèi)代謝與解毒的因素

農(nóng)藥在植物體內(nèi)的吸收、轉(zhuǎn)運與代謝行為受到諸多因素的影響，如植物種類、環(huán)境條件和外源物質(zhì)等[8,54-56]。同一農(nóng)藥在不同植物中的代謝行為也不盡相同。丁硫克百威在小白菜中代謝為克百威、3-羥基-克百威和3-酮-克百威，而在黃瓜中僅代謝為克百威和3-羥基-克百威[54]。吡蟲啉在芹菜葉中被發(fā)現(xiàn)有5種代謝物，在萵苣葉中被發(fā)現(xiàn)有3種代謝物，而在蘿卜葉中則被發(fā)現(xiàn)有2種代謝物[8]。不同生長階段和不同組織部位也影響農(nóng)藥在植株體內(nèi)的代謝，如在生長成熟期，溴氰蟲酰胺在番茄植株中的代謝快于幼苗期，且代謝主要發(fā)生在葉片中[55]。環(huán)境和地域條件也影響農(nóng)藥的降解與代謝，如在好氧條件下，氟蟲腈很容易氧化形成氟蟲腈砜，而在高水分或厭氧條件下則通過還原形成氟蟲腈硫化物[56]；丁硫克百威在小白菜中的降解速率隨地域不同存在差異，其在杭州種植的小白菜中降解最快，其次是上海和北京[54]。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多外源化合物可以通過增強代謝酶的活性來保護植物免受其他有毒化合物的傷害，安全劑可通過提高除草劑的代謝水平，或通過促進除草劑在受保護植物中的降解來發(fā)揮作用[14,57]，如安全劑解草唑可分別緩解麥草畏和乙草胺對水稻及油菜產(chǎn)生的藥害[58-59]。一些與植物生長有關(guān)的激素類物質(zhì)可通過調(diào)控代謝酶基因的表達進而激活代謝酶活性來影響農(nóng)藥的代謝與降解。例如，Lu等[60]研究表明，添加5 mg/L的水楊酸（SA）上調(diào)了與降解代謝酶相關(guān)基因的表達，并促進了異丙隆在小麥植株根和莖中的代謝與降解。也有研究表明，添加0.1 μmol/L的茉莉酸甲酯（MeJA）增強了代謝酶活性，可明顯增強異丙隆在小麥植株中的代謝與降解[61]。

2 農(nóng)藥在微生物中的降解與代謝轉(zhuǎn)化

研究農(nóng)藥在微生物中的降解與代謝，對于農(nóng)藥環(huán)境污染治理具有重要的應(yīng)用價值。降解農(nóng)藥的微生物包括真菌、細菌、放線菌和藻類等，可被降解的農(nóng)藥包括有機磷類、有機氯類、氨基甲酸酯類、磺酰脲類和新煙堿類等[62-65]。其中，已發(fā)現(xiàn)的對農(nóng)藥具有降解作用的微生物大多來自于土壤微生物[66]。有研究表明，降解新煙堿類殺蟲劑的菌群主要來自受該類藥劑污染的土壤，且主要以細菌為主[67]。趙百萍[68]從長期受污染的土壤中分離出能夠降解炔苯酰草胺的菌株W1，并將其鑒定為睪丸酮叢毛單胞菌（Comamonas testosteroni）。

農(nóng)藥在微生物中的代謝過程包括氧化、還原、水解、縮合、偶聯(lián)等過程[11]。降解代謝過程主要分為3個階段：微生物首先通過細胞膜將農(nóng)藥吸附在其表面，然后將農(nóng)藥滲透進入體內(nèi)，最后在酶促反應(yīng)下對農(nóng)藥進行降解與代謝[69]。參與農(nóng)藥在微生物中代謝的酶類有酯酶、酰胺酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、細胞色素P450酶系和硝基還原酶等[52]。農(nóng)藥在微生物中代謝途徑的多樣性取決于外源化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)、微生物種類、環(huán)境條件以及調(diào)控這些生化途徑表達的代謝因子[69-72]。在土壤微生物作用下，新煙堿類殺蟲劑哌蟲啶在土壤中主要發(fā)生去丙基化、亞硝基化、脫硝化和去甲基化等進行代謝反應(yīng)[73]。在降解酶參與下，真菌或細菌可以通過礦化作用將農(nóng)藥轉(zhuǎn)化為CO2、H2O和無機氮等[74]，如芳香族農(nóng)藥在礦化過程中會發(fā)生環(huán)裂解過程[62]。微生物也可通過共軛反應(yīng)對農(nóng)藥進行降解，共軛反應(yīng)包括木基化、烷基化、酰化和亞硝化，其產(chǎn)生的天然代謝產(chǎn)物也可與農(nóng)藥進行共價結(jié)合[75]。植物和微生物對農(nóng)藥代謝過程中產(chǎn)生的軛合物有著不同的歸趨，植物沒有排泄系統(tǒng)，因此其有毒產(chǎn)物通常被分隔在液泡中或嵌入結(jié)構(gòu)聚合物中，以減少農(nóng)藥毒性，而微生物則主要通過礦化作用將軛合物礦化為無機成分[52,74]。

微生物通?？杉铀俎r(nóng)藥的降解。一些土壤在施用農(nóng)藥后，由于微生物種群的代謝適應(yīng)而導(dǎo)致藥效降低，隨后在土壤中這些微生物對農(nóng)藥的生物降解潛力逐漸增強。例如，在重復(fù)使用丙炔草酮和二氯喹啉酸的土壤中，鞘氨醇單胞菌富集增加，進而促進了丙炔草酮和二氯喹啉酸的降解[76]。蔣晨等[77]在農(nóng)田土壤中發(fā)現(xiàn)了降解撲滅津的微生物群落，暴露11 d后，約95%的撲滅津被降解。幾種微生物相互作用也可加速農(nóng)藥的降解。有研究表明，微生物組合中光合自養(yǎng)生物和異養(yǎng)生物相互作用可促進水環(huán)境中農(nóng)藥的降解[78]。此外，存在于植物體各部位的微生物對農(nóng)藥也有一定的降解作用，如封國君[79]在茅草、飛機草和番石榴等植物中篩選出了可降解二甲四氯的植物內(nèi)生菌。值得注意的是，根際微生物與植物相互作用有利于抵御生物和非生物脅迫，這一發(fā)現(xiàn)已引起眾多研究者的關(guān)注[80-81]。小麥根際內(nèi)生菌SR80可通過調(diào)控小麥體內(nèi)防御基因表達和代謝通路，來抵御病原菌的入侵，并促進植株生長[81]。已有研究發(fā)現(xiàn)黃瓜根際分離得到的菌株P(guān)620對對羥基苯甲酸具有較強的降解能力，并緩解了對羥基苯甲酸累積對黃瓜植株產(chǎn)生的脅迫反應(yīng)[80]。在根際內(nèi)生菌與植物互作抵御農(nóng)藥脅迫方面，通過代謝降解植物吸收的某些除草劑或誘導(dǎo)植物進行更高水平的代謝降解，能使某些植物具有一定程度的除草劑耐受性[82-83]，如最近的一項研究通過接種內(nèi)生菌CIMAP-A7降低了阿特拉津在藥用植物穿心蓮中的含量，并改善了阿特拉津誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)[84]，推測內(nèi)生菌可能通過2個方面參與植株對農(nóng)藥的耐受性：一是通過其降解代謝外源物質(zhì)的能力直接促進農(nóng)藥解毒；二是通過誘導(dǎo)增強宿主的應(yīng)激反應(yīng)來抵抗農(nóng)藥引起的毒性[82]。當然，這些假設(shè)需要大量的研究來驗證，且需要進一步探究根際內(nèi)生菌與植物互作抵御農(nóng)藥脅迫的分子機制。

3 農(nóng)藥在植物和微生物中代謝轉(zhuǎn)化的研究方法

3.1 農(nóng)藥在植物和微生物中代謝產(chǎn)物的分析方法

放射性同位素示蹤技術(shù)是一種利用含有放射性同位素標記的化學(xué)物質(zhì)來研究生物體內(nèi)各種物質(zhì)分解和合成過程的手段，其具有靈敏度高、干擾少、結(jié)果準確、操作簡單等優(yōu)點[85]。在農(nóng)用化學(xué)品研究方面，放射性同位素示蹤技術(shù)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥的吸收、傳導(dǎo)、代謝行為與代謝產(chǎn)物的鑒定研究中[9]。14C、32P、35S、35Cl和3H是農(nóng)藥放射性配體中常用的標記物[86]。劉西莉等[87]研究了14C標記的腈菌唑在小麥幼苗中的吸收與傳導(dǎo)行為。李薇[48]采用14C同位素示蹤技術(shù)研究了苯醚菌酯在黃瓜中的代謝產(chǎn)物與途徑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)苯醚菌酯在黃瓜中產(chǎn)生6種代謝產(chǎn)物，存在3條代謝途徑。也有研究將放射性同位素示蹤技術(shù)與其他技術(shù)相結(jié)合，用于農(nóng)藥化合物在植物體內(nèi)的代謝研究，如聞樊婷[46]采用放射性同位素示蹤法結(jié)合液體閃爍測量儀與高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，鑒定了毒氟磷在大豆豆子和豆葉中的代謝產(chǎn)物。由于放射性同位素具有電離輻射效應(yīng)，其造成的環(huán)境污染及對人體健康的影響也不容忽視[85]。

高分辨質(zhì)譜技術(shù)借助其超高分辨率可對化合物的精確分子量進行測定，并可依據(jù)同位素離子的豐度來推斷化合物的元素組成，也可根據(jù)一級和二級譜庫對未知代謝物進行篩選與確證[88]。近年來，高分辨質(zhì)譜技術(shù)（QTOF-MS）由于具有高靈敏度、高分辨率、質(zhì)量精度等優(yōu)勢在農(nóng)藥代謝研究中得到廣泛的應(yīng)用。葛國芹等[89]利用LC-QTOF-MS技術(shù)鑒定了啶蟲脒等4種新煙堿類農(nóng)藥在茶樹中的代謝產(chǎn)物。Chen等[30,90]運用HRLC-Q-TOF-MS/MS分析方法分別鑒定了氟磺胺草醚和硝磺草酮在水稻中的代謝產(chǎn)物。Tao等[8]利用UPLC-TQD-MS/MS技術(shù)研究了新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉在萵苣等3種植物中的代謝與轉(zhuǎn)化行為。高分辨質(zhì)譜技術(shù)也被應(yīng)用于鑒定農(nóng)藥在微生物中的降解產(chǎn)物研究。Zhang等[91]利用HRLCQ-TOF-MS/MS技術(shù)表征了土壤微生物對乙草胺的降解產(chǎn)物，其中主要包括10種I相代謝物和8種II相軛合物。目前，高分辨質(zhì)譜儀相較于低分辨的三重四極桿質(zhì)譜儀在化合物定性方面具有一定的優(yōu)勢，但其定量功能還需要進一步的改善。此外，核磁共振技術(shù)也可用于代謝產(chǎn)物的輔助鑒定，該技術(shù)可提供有關(guān)現(xiàn)有官能團的類型和數(shù)量的信息，從而輔助代謝產(chǎn)物的鑒定[92]；質(zhì)譜成像技術(shù)有利于對農(nóng)藥母本化合物和代謝產(chǎn)物進行實時追蹤，利于明確化合物在植株各部位的分布與累積[93]。

3.2 農(nóng)藥在植物和微生物中代謝的分子機制研究方法

高通量測序技術(shù)、分子克隆技術(shù)等分子生物學(xué)方法通常被用于研究農(nóng)藥在植物中代謝的分子機制[27]。

基于高通量測序技術(shù)獲得差異表達基因。該技術(shù)是將試驗組和對照組2組樣本進行RNA-seq測序，通過生物信息學(xué)分析獲得差異表達基因，進一步明確各差異表達基因的代謝通路及其生物學(xué)功能，并采用qRT-PCR技術(shù)對RNA-seq測序結(jié)果進行驗證，如張靜靜[45]利用RNA-seq測序技術(shù)分析差異表達基因，并采用qRT-PCR技術(shù)進行驗證，獲得了紫花苜蓿對阿拉特津解毒代謝相關(guān)的響應(yīng)基因；Huang等[94]通過RNA-seq測序獲得了參與莠去津和異丙隆在水稻中解毒代謝的漆酶基因，并利用畢赤酵母細胞異源表達進行功能驗證。

基于分子克隆技術(shù)獲得目標基因的過表達株系。研究植株中基因的生物學(xué)功能，并利用基因工程技術(shù)將該基因進行異源表達，進一步驗證其功能，如蘇湘寧[44]利用分子克隆技術(shù)獲得了糖基轉(zhuǎn)移酶基因OsIRGT1過表達的水稻株系，研究了該基因在調(diào)控水稻體內(nèi)異丙隆和乙草胺代謝與解毒過程中的作用，并將該基因在畢赤酵母中進行異源表達，進一步驗證了其在異丙隆和乙草胺降解代謝中的生物學(xué)功能；Pan等[35]結(jié)合RNA-seq測序和分子克隆技術(shù)獲得了醛酮還原酶基因（EcAKR4-1）過表達的水稻幼苗株系，驗證了EcAKR4-1在草甘膦代謝中的作用，并將該基因?qū)氪竽c桿菌中，發(fā)現(xiàn)其能夠促進草甘膦代謝為氨甲基磷酸和乙醛酸。

利用分子對接技術(shù)進行結(jié)構(gòu)模型預(yù)測。該技術(shù)也被用于農(nóng)藥分子與植株代謝酶作用模式的分子機制研究中，如Vemanna等[36]對水稻的醛酮還原酶基因OsAKR1進行了表征，并通過分子對接研究表明，OsAKR1能有效地與草甘膦分子結(jié)合；Lu等[95]通過同源建模對LOC_Os04g09604酶與阿拉特津之間的拓撲相互作用進行分析，并通過分子對接進行驗證。也有研究利用結(jié)構(gòu)模型預(yù)測稗草醛酮還原酶基因EcAKR4-1與草甘膦進行氧化結(jié)合[36]。

研究農(nóng)藥在微生物中降解與代謝的分子機制與農(nóng)藥在植物中代謝分子機制研究的手段類似[96-97]。例如，Agrawal等[97]從魚腥藻（Anabaena sp.）PCC7120中鑒定到一個能夠促進丁草胺降解的醛酮還原酶基因AKR17A1；Gao等[98]從芽孢桿菌（Bacillus sp.）hys-1中克隆得到能夠降解乙草胺和丁草胺的C-脫烷基酶基因dbo。已有研究表明，克雷伯氏菌（Klesiella jilinsis）2N3可以降解氯嘧磺隆。通過對該菌株進行基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，并采用基因敲除和基因異源表達等技術(shù)驗證了水解酶基因Kj-mhpC-2096、細胞色素P450基因Kj-CysJ和糖基轉(zhuǎn)移酶基因Kj-gst是菌株2N3降解氯嘧磺隆的響應(yīng)基因[99-101]。陳雪婷等[102]通過比較基因組學(xué)方法預(yù)測了樊慶生氏紅球菌（Rhodococus qingshengii）YL-1是降解噻酮嗪的相關(guān)基因。另外一項研究通過基因突變證明了nahQ基因與鞘脂菌（Sphingobium sp.）QC-18降解代謝敵草胺有關(guān)[103]。

4 農(nóng)藥在植物和微生物中代謝相關(guān)基因及其應(yīng)用

4.1 抗性作物品種培育

在植物中過表達與農(nóng)藥解毒代謝相關(guān)的抗性基因可以提高植株對該農(nóng)藥的抗性水平，從而降低農(nóng)藥對植物的毒性。例如，在抗草甘膦稗草中，醛酮還原酶基因EcAKR4-1的表達量明顯高于敏感性植株。研究人員在水稻幼苗中過表達此基因，發(fā)現(xiàn)其可促進水稻幼苗對草甘膦的代謝，水稻幼苗表現(xiàn)出抗草甘膦特性[36]。Pan等[104]研究發(fā)現(xiàn)了稗草對五氟磺草胺的抗性基因，即細胞色素P450基因CYP81A68，在水稻中過表達該基因可增強植株對五氟磺草胺、氰氟草酯和甲磺草胺的抗性。基于植物代謝酶基因的轉(zhuǎn)基因作物的研究目前仍處于實驗室研究階段，未來需要開發(fā)商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因作物，并不斷挖掘與代謝解毒功能相關(guān)的基因，這將有助于明確分子調(diào)控機制和抗除草劑作物的培育。

草甘膦在土壤中有2種主要的微生物降解途徑（圖2），其中一種類型的降解由草甘膦氧化還原酶（GOX）介導(dǎo)，分解草甘膦C-N鍵產(chǎn)生氨甲基膦酸（AMPA）；另一種類型的降解則通過C-P裂解酶形成肌氨酸和無機磷酸[105]。將微生物中參與該降解途徑的酶基因轉(zhuǎn)入作物中可培育抗草甘膦作物，如大腸桿菌（Escherichia coli）中草甘膦氧化酶基因編碼草甘膦氧化還原酶（GOX），可將其導(dǎo)入水稻體內(nèi)，從而產(chǎn)生對草甘膦抗性的水稻植株[106]；將根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium sp.）中的CP4-EPSPS基因?qū)霟煵蒹w內(nèi)，可編碼不敏感的5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS），從而使煙草對草甘膦產(chǎn)生抗性[107]。另有研究將細菌中的有機磷水解酶（OPH）基因轉(zhuǎn)入煙草植株中，從而增強了其對甲基對硫磷的降解[108]。目前，將微生物基因轉(zhuǎn)入非靶標作物，如水稻、油菜中來培育抗草甘膦作物已發(fā)展較為成熟，未來研究需要挖掘更多的微生物降解基因，并評價其在不同非靶標作物中表達后對多種農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的能力。

圖2 草甘膦在微生物中的降解途徑

4.2 環(huán)境修復(fù)

微生物的解毒和降解能力常被用來進行土壤和水體中農(nóng)藥污染的修復(fù)。農(nóng)田土壤中撲滅津的施用可誘導(dǎo)微生物群落降解基因AtzB、AtzC和TrzN的表達，從而促進撲滅津的降解[77]。杜曉敏[109]篩選出能夠降解毒死蜱的芽孢桿菌（Bacillus sp.）H27，并將其應(yīng)用在毒死蜱污染的農(nóng)田土壤中。劉暢[110]篩選出一株能夠降解阿特拉津的腸桿菌（Enterobacter sp.）AT-b3，并以硅藻土為載體制備修復(fù)菌劑，發(fā)現(xiàn)施用該菌劑28 d后，其對土壤中阿特拉津的降解率可達80%。近年來，微生物表面活性劑被應(yīng)用于土壤和水體中的農(nóng)藥污染修復(fù)，這是一種具有環(huán)境可持續(xù)性的環(huán)保方法[111]?；蚬こ涛⑸镆脖挥糜谵r(nóng)藥的降解與監(jiān)測，如Li等[112]將能自發(fā)熒光的報告蛋白EGFP和能水解多種有機磷農(nóng)藥、底物特異性廣的有機磷水解酶編碼區(qū)克隆到表達載體pET-28b中構(gòu)建基因工程菌，該方法可用于環(huán)境中有機磷農(nóng)藥的降解與監(jiān)測。

植物修復(fù)是另一種修復(fù)受農(nóng)藥污染的水體和土壤的綠色策略。Lv等[113]研究了蘆葦對水培營養(yǎng)液中抑霉唑和戊唑醇的修復(fù)效果，發(fā)現(xiàn)其對2種農(nóng)藥的吸收、轉(zhuǎn)運與代謝行為同時發(fā)生，試驗結(jié)束時水中農(nóng)藥去除率分別為96.1%和99.8%。Lyu等[114]研究表明，5種濕地植物對戊唑醇的去除途徑主要是植物吸收后的內(nèi)部降解和植物代謝。Azab等[115]通過室內(nèi)和溫室試驗研究了細胞色素P450轉(zhuǎn)基因植物在農(nóng)藥污染土壤修復(fù)中的潛在應(yīng)用，轉(zhuǎn)細胞色素P450基因（CYP1A2）的擬南芥植株能夠代謝大量的除草劑和殺蟲劑。此外，植物的根系分泌物與根際微生物相互作用可促進污染土壤中農(nóng)藥的降解，如黑麥草根系分泌物促進了根際微生物群落的富集，進而增強了有機氯農(nóng)藥的降解[116]。

5 展 望

農(nóng)藥在植物和微生物中的代謝轉(zhuǎn)化是涉及多重生物酶參與的復(fù)雜的生物化學(xué)過程。同時，其降解與代謝行為也受到諸多因素的影響，如植物品種、環(huán)境條件、外源物質(zhì)與植物內(nèi)源物質(zhì)等。深入探究農(nóng)藥在植物和微生物中的代謝轉(zhuǎn)化行為及機制，對于農(nóng)藥殘留毒性評價、代謝抗性、抗性作物品種培育及環(huán)境污染修復(fù)等方面具有重要意義。未來該領(lǐng)域需進一步研究和開發(fā)的方向如下：

（1）目前大多數(shù)研究主要集中于除草劑在植物中代謝行為及機制研究，其他類型農(nóng)藥如殺蟲劑和殺菌劑等在植物中的代謝行為與機制需要進一步闡明；在復(fù)雜的環(huán)境條件下，農(nóng)藥或其他污染物共暴露對其中一種或幾種農(nóng)藥代謝行為的影響需要進一步研究，利用體外細胞篩查技術(shù)可以更快地獲得目標農(nóng)藥的代謝行為模式。此外，參與農(nóng)藥在植物和微生物中代謝的生物酶及其調(diào)控基因也需要進一步挖掘與驗證。

（2）在微生物降解農(nóng)藥應(yīng)用于環(huán)境修復(fù)方面，需要篩選更多的微生物降解菌群，明確其降解代謝農(nóng)藥的機制。再者，微生物與植物共代謝農(nóng)藥，尤其是根際內(nèi)生菌與植物互作對農(nóng)藥的共代謝機制及其防御機制也需要深入研究，同時研究結(jié)果也可為微生物與植物聯(lián)合修復(fù)農(nóng)藥污染提供理論依據(jù)。

（3）納米技術(shù)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥劑型研制中，成為農(nóng)藥劑型研究的前沿領(lǐng)域。納米農(nóng)藥在植物中的吸收代謝行為與機制和常規(guī)農(nóng)藥是否存在不同也值得關(guān)注；利用功能納米材料與植物酶相互作用調(diào)控農(nóng)藥在植物中的吸收與代謝，是否可同時實現(xiàn)農(nóng)藥的解毒與增效也值得進一步研究，這對促進農(nóng)藥的減施增效具有重要意義。

（4）需要開發(fā)與農(nóng)藥代謝研究相配套的研究技術(shù)和平臺，如高分辨質(zhì)譜、分子克隆、組學(xué)技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)、同位素示蹤、熒光定量可視化及質(zhì)譜成像技術(shù)等。