李漢卿,王瑾,史江穎,張曉莉,單樹花 ,李卓玉,*
(1.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山西 太原 030006;2.山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所,化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 太原 030006)
原發(fā)性肝癌的主要組織學(xué)形式是肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC),是世界上第五大常見的惡性腫瘤,其具有病情進(jìn)展快、惡性程度高、治療難度大及生存率低的特點(diǎn),也是腫瘤致死率第二位的癌癥[1]。目前普遍認(rèn)為原發(fā)性肝癌是多基因、多因素、多步驟的疾病,其中導(dǎo)致肝癌發(fā)生的因素很多,包括慢性乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、吸煙等[2-4],但是飲食因素如過度飲酒、食用黃曲霉毒素污染的食物等被認(rèn)為是誘發(fā)肝癌的重要危險(xiǎn)因素[5]。目前,對(duì)于肝癌的治療方法主要包括手術(shù)治療、放射療法和化學(xué)療法。手術(shù)治療對(duì)患者的創(chuàng)傷較大,易產(chǎn)生一系列手術(shù)并發(fā)癥,降低患者的免疫力。放射療法腫瘤特異靶向性差,會(huì)破壞正常細(xì)胞組織,產(chǎn)生血液改變、惡心嘔吐等副作用。而化學(xué)療法對(duì)正常細(xì)胞缺乏選擇性,具有嚴(yán)重的毒副作用[6],且易產(chǎn)生腫瘤耐藥[7]。因此,尋找一種安全、無(wú)毒、高效營(yíng)養(yǎng)干預(yù)肝癌細(xì)胞增殖的功能分子,對(duì)于肝癌的防治具有重要意義。
谷子(Setaria italica)廣泛種植于全世界,是我國(guó)北方地區(qū)種植的主要農(nóng)作物之一,為山西名優(yōu)產(chǎn)品。自古有“五谷為養(yǎng)”的說法,谷物是膳食纖維、維生素、礦物質(zhì)、植物營(yíng)養(yǎng)素等多種營(yíng)養(yǎng)素的良好來(lái)源[8],具有抗癌、抗炎、抗菌及抗氧化等藥理學(xué)特性。谷子在經(jīng)過碾磨脫糠得到小米的精細(xì)化加工過程中,雖然谷糠易被忽視,但其中同樣含有多種具有生物活性的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。已有研究發(fā)現(xiàn)谷糠中結(jié)合態(tài)多酚對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116、人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人肝癌細(xì)胞HepG2、人乳腺癌細(xì)胞MCF-7等腫瘤細(xì)胞的增殖均具有顯著的抑制作用[9];谷糠中的一種過氧化物酶在體外和體內(nèi)均已證實(shí)能夠通過抑制CD36和STAT3的表達(dá)來(lái)減輕動(dòng)脈粥樣硬化病癥[10]。因此,谷糠具有許多潛在的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有待更多研究。越來(lái)越多的研究表明,全谷物的攝入與肥胖[11-12]、2型糖尿病[12-15]和非酒精性脂肪肝[16-17]等已知肝癌的誘發(fā)因素的降低相關(guān)。而全谷物中的膳食纖維含量非常豐富,這種谷物纖維除了改善胰島素敏感性、調(diào)節(jié)代謝、減少系統(tǒng)性炎癥,還能夠改變腸道微生物的組成,促使腸道微生物相關(guān)代謝產(chǎn)物丁酸鹽的增加[18-19],提高腸道完整性[20],可有效減緩肝癌的發(fā)生與發(fā)展。流行病學(xué)研究表明,膳食纖維的攝入可有效降低和預(yù)防結(jié)腸癌、乳腺癌等多種疾病的發(fā)病幾率[21-22]。但是,谷子源膳食纖維抗肝癌活性鮮見報(bào)道,因此,探究谷子源膳食纖維對(duì)肝癌細(xì)胞的干預(yù)能夠?yàn)楦伟┑姆乐翁峁┬碌乃悸贰?/p>
本研究分別從全谷物、小米和谷糠中運(yùn)用酶法結(jié)合化學(xué)法獲得三種谷子源可溶性膳食纖維,并對(duì)三種膳食纖維的含量和得率進(jìn)行了分析,進(jìn)一步評(píng)價(jià)三種膳食纖維的毒性作用和對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的抑制效應(yīng),為將其進(jìn)一步研發(fā)成預(yù)防肝癌保健品和藥物中間體提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
谷糠、全谷物、小米(均為晉谷21號(hào))購(gòu)于山西農(nóng)科院。
人肝癌細(xì)胞HepG2、人正常肝細(xì)胞HL-7702均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。
RPMI-1640及DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)于Gibco公司;胎牛血清購(gòu)于生工生物技術(shù)有限公司;二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;噻唑藍(lán)(MTT)、胰蛋白酶、α-淀粉酶(高溫淀粉酶)(40 000 U/g)、堿性蛋白酶(200 000 U/g)均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司;纖維素酶(50 U/mg)購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司。
電熱鼓風(fēng)干燥箱(中國(guó),博迅);真空冷凍干燥儀(中國(guó),興芝);電熱恒溫水浴鍋(中國(guó),一恒);臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó),Eppendorf);電子天平(美國(guó),Ohaus);pH計(jì)(上海,三信);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó),Thermo);倒置顯微鏡(日本,Nikon);真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。
膳食纖維的提取主要包括物理法、化學(xué)法和酶法等3種方法。本實(shí)驗(yàn)參考黃冬云[23]的方法:分別稱取適量小米、全谷物和谷糠,粉碎后過60目篩,料液比1∶12加pH 4.5的水溶液,60℃水浴攪拌2 h以去除植酸→11 000 r/min,離心5 min,棄上清→沉淀按料液比1∶12加蒸餾水,95℃糊化30 min→加高溫淀粉酶(200 U/g),95℃、pH 6.0酶解30 min→加堿性蛋白酶(5 400 U/g),50℃、pH 10酶解 5 h→沸水浴10 min,滅酶活→4 000 r/min離心20 min→收集上清;沉淀烘干,過100目篩,按料液比1∶10加0.05 mol/L,pH 4.8的檸檬酸?檸檬酸鈉緩沖液,加纖維素酶(200 U/g),混勻后,于50℃水浴3 h→沸水浴10 min滅酶活→4 000 r/min離心20 min→收集上清;按 1∶4(V/V)向收集的上清液中加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇,靜置12 h→收集沉淀物,凍干。
HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(含100 U/mL青霉素和鏈霉素)的DMEM高糖培養(yǎng)基中,HL-7702培養(yǎng)于含10%胎牛血清(含100 U/mL青霉素和鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)基中,5% CO2(體積分?jǐn)?shù))、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
因人正常肝細(xì)胞HL-7702生長(zhǎng)速度慢,人肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)速度快,故收集對(duì)數(shù)期人正常肝細(xì)胞HL-7702,將細(xì)胞密度調(diào)整為10 000~15 000個(gè)/100 μL,收集對(duì)數(shù)期人肝癌細(xì)胞HepG2,將細(xì)胞密度調(diào)整為4 000~5 000個(gè)/100 μL,接種于96孔板,以確保細(xì)胞培養(yǎng)48 h后,二者細(xì)胞數(shù)量基本一致。5% CO2、37℃培養(yǎng)12 h貼壁后,加入終濃度分別為1,2,4 mg/mL的全谷物、小米和谷糠的可溶性膳食纖維,各設(shè)置5個(gè)復(fù)孔做重復(fù)對(duì)照,同時(shí)設(shè)置5個(gè)空白對(duì)照,培養(yǎng)48 h,所有孔 PBS 清洗 2次,換 100 μL新鮮培養(yǎng)基,加 20 μL MTT,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,小心吸棄培養(yǎng)基后,加入150 μL DMSO,于微孔板振蕩器振蕩10 min,酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度。
收集對(duì)數(shù)期人肝癌細(xì)胞HepG2調(diào)整細(xì)胞密度5 000個(gè)/孔,接種于24孔板培養(yǎng)24 h,加入終濃度為1、2、4 mg/mL的谷糠可溶性膳食纖維處理細(xì)胞1周,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。用免疫固定液覆蓋細(xì)胞,室溫固定20 min,0.1%結(jié)晶紫染液(m∶V)染色15 min,烘干后顯微鏡下觀察拍照。最后,每孔中加入1%SDS(m∶V)充分溶解細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶,570 nm波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度對(duì)細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)的結(jié)果并進(jìn)行量化分析。
收集對(duì)數(shù)期人肝癌細(xì)胞HepG2,調(diào)整細(xì)胞密度,接種于鋪有滅菌槍頭圈的24孔板中,使得過夜培養(yǎng)后圈內(nèi)形成密度大于90%的單層細(xì)胞。細(xì)胞貼壁后,用無(wú)菌鑷子取出槍頭圈,用20 μL無(wú)菌槍頭均勻劃痕后,PBS小心清洗2次,換入500 μL新鮮培養(yǎng)基,加入終濃度為0.1和0.4 mg/mL的谷糠可溶性膳食纖維,同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照,每個(gè)樣品設(shè)3組重復(fù)對(duì)照,于5% CO2,37℃培養(yǎng)。每24 h用倒置顯微鏡觀察HepG2細(xì)胞的增殖情況。愈合率的計(jì)算方法為:
收集對(duì)數(shù)期人肝癌細(xì)胞HepG2,調(diào)整細(xì)胞密度,接種于60 mm小皿中,貼壁后加谷糠可溶性膳食纖維(1、2、3 mg/mL)處理,用胰酶消化,離心收集細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS洗滌2次,加入 100 μL Binding Buffer吹散細(xì)胞后,加入 5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI Staining Solution,輕輕混勻后,室溫避光孵育10 min,加入400 μL Binding Buffer,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
所有數(shù)據(jù)平均做3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn),以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示;采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行多重比較,不同字母表示差異顯著(P<0.05);運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,兩組獨(dú)立樣本間平均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異顯著。
利用酶法結(jié)合化學(xué)法,分別從10 g的全谷物、小米和谷糠中提取可溶性膳食纖維。結(jié)果如表1顯示,全谷物可溶性膳食纖維的含量為1.007 g/10 g,小米可溶性膳食纖維的含量為1.586 g/10 g,谷糠可溶性膳食纖維的含量為0.301 g/10 g。全谷物、小米和谷糠可溶性膳食纖維含量依次是:小米可溶性膳食纖維>全谷物可溶性膳食纖維>谷糠可溶性膳食纖維。以上結(jié)果表明,小米可溶性膳食纖維最多,谷糠可溶性膳食纖維最少。
表1 全谷物、小米和谷糠中可溶性膳食纖維的含量(,n=3)Table 1 Contents of soluble dietary fiber in whole grain,millet and foxtail millet bran(,n=3)
表1 全谷物、小米和谷糠中可溶性膳食纖維的含量(,n=3)Table 1 Contents of soluble dietary fiber in whole grain,millet and foxtail millet bran(,n=3)
Species of dietary fiber Contents/g Total volume/mL Millet Whole grain Foxtail millet bran 10 g原材料提取所得上述膳食纖維,兩組之間的顯著性差異用不同字母表示,P<0.05 Concentration/(mg/mL)243.926±0.737 201.371±0.352 66.559±0.812 6.5±0.425 5±0.296 4.5±0.701 1.586±0.085 1.007±0.037 0.300 5±0.044 Composition ratio/%15.86±0.85a 10.07±0.37b 3.005±0.44c
為了確定谷子不同部位的可溶性膳食纖維的安全性,將全谷物、小米和谷糠可溶性膳食纖維通過MTT法,檢測(cè)其在不同濃度(0,1,2,4 mg/mL)對(duì)人正常肝細(xì)胞HL-7702的活力影響。圖1顯示,全谷物、小米和谷糠的可溶性膳食纖維在濃度分別為1,2,4 mg/mL時(shí),對(duì)人正常肝細(xì)胞HL-7702的存活率均大于90%,表明全谷物、小米和谷糠可溶性膳食纖維對(duì)HL-7702細(xì)胞的正常增殖無(wú)明顯影響。這說明3種可溶性膳食纖維在此濃度下對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用。
圖1 谷子源可溶性膳食纖維對(duì)HL-7702細(xì)胞增殖的影響(±s,n=3)Fig.1 Effects of soluble dietary fiber from foxtail millet on HL-7702 cells proliferation(±s,n=3)
由圖2可知,小米可溶性膳食纖維在濃度為2,4 mg/mL時(shí)對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖有顯著抑制作用(P<0.05),全谷物和谷糠可溶性膳食纖維在濃度為1,2,4 mg/mL時(shí)對(duì)HepG2均有顯著抑制作用(P<0.05),且具有濃度依賴性。其中,谷糠可溶性膳食纖維在濃度為4 mg/mL時(shí),存活率為51.83%,與其他谷子源膳食纖維相比,谷糠可溶性膳食纖維對(duì)HepG2增殖的抑制作用最為顯著(P<0.05)。因此,選擇谷糠可溶性膳食纖維進(jìn)一步研究其抗肝癌活性。
圖2 谷子源可溶性膳食纖維對(duì)HepG2增殖的影響(,n=3)兩欄間用不同字母表示有顯著性差異,P<0.05Fig.2 Effect of soluble dietary fiber of foxtai millet on the proliferation of HepG2(,n=3)Significant differences between the two columns were indicates by different letters,P<0.05
為了進(jìn)一步證明谷糠可溶性膳食纖維的抗肝癌活性,采用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)谷糠可溶性膳食纖維對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響。圖3(a)顯示,谷糠可溶性膳食纖維對(duì)HepG2細(xì)胞的克隆形成能力具有明顯的抑制作用,且具有劑量依賴性,其抗增殖的效果與MTT結(jié)果一致。圖3(b)是對(duì)圖3(a)細(xì)胞克隆形成的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,結(jié)果證明谷糠可溶性膳食纖維能夠顯著抑制HepG2細(xì)胞的克隆形成。
圖3 谷糠可溶性膳食纖維對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響(,n=3),組間字母不同的欄目差異有顯著性,P<0.05Fig.3 Effects of soluble dietary fiber from foxtail millet bran on HepG2 cell viability(,n=3)The columns with different letters between groups represented significant differences,P<0.05
為了進(jìn)一步確定谷糠可溶性膳食纖維的抗肝癌效應(yīng)。選擇在對(duì)HepG2細(xì)胞無(wú)抑制作用的濃度(圖4(b))下,采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)谷糠可溶性膳食纖維對(duì)HepG2單層細(xì)胞的遷移作用。結(jié)果顯示,與空白對(duì)照相比,谷糠可溶性膳食纖維濃度為0.4 mg/mL時(shí),在24 h和48 h對(duì)細(xì)胞劃痕愈合率的抑制分別達(dá)到7.72%和9.34%(圖4(a),4(c))。谷糠可溶性膳食纖維不僅顯著抑制了HepG2單層細(xì)胞的增殖,并且能夠有效抑制HepG2細(xì)胞的遷移,且具有濃度依賴性。
圖4 谷糠可溶性膳食纖維對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用(,n=3)組間字母不同的欄目差異有顯著性,P<0.05Fig.4 Antiproliferative effect of soluble dietary fiber from foxtail millet bran on HepG2 cells(,n=3)The columns with different letters between groups represented significant differences,P<0.05
為了探討谷糠可溶性膳食纖維對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度谷糠可溶性膳食纖維(0,1,2,3 mg/mL)對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果見圖5。由圖5可以看出,1 mg/mL谷糠可溶性膳食纖維處理后與對(duì)照相比,細(xì)胞凋亡率增加了2.45倍;2 mg/mL處理時(shí),細(xì)胞凋亡率增加了3.83倍;3 mg/mL處理時(shí),細(xì)胞凋亡率增加了4.95倍,表明膳食纖維能夠通過誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制其增殖,且具有劑量依賴性。
圖5 谷糠可溶性膳食纖維對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響(,n=3)組間字母不同的欄目差異有顯著性,P<0.05Fig.5 Effect of soluble dietary fiber from foxtail millet bran on the apoptosis of HepG2 cells(,n=3)The columns with different letters between groups represented significant differences,P<0.05
已有研究表明膳食纖維攝入量與肝癌風(fēng)險(xiǎn)呈現(xiàn)潛在的負(fù)相關(guān)性,但因食物來(lái)源不同而有所不同,如部分水果或蔬菜的膳食纖維則與肝癌無(wú)相關(guān)性[24]。這可能是因?yàn)樗褪卟耍貏e是果汁中,含有較高的果糖和蔗糖,這些能導(dǎo)致有肝損傷或非酒精性脂肪肝的基礎(chǔ)病患者病情加重,從而掩蓋水果和蔬菜纖維的潛在益處[25-26]。王菁等[27-28]分別通過高脂飲食誘導(dǎo),構(gòu)建胰島素抵抗動(dòng)物模型和人群流行病學(xué)研究表明,增加不同種類全谷物的攝入量能夠顯著降低血糖水平,改善胰島素抵抗;Xu等[29-30]通過對(duì)人群調(diào)查研究顯示,全谷物的攝入與炎癥標(biāo)志物濃度呈負(fù)相關(guān);增加谷物源膳食纖維的攝入量能夠減輕胰島素抵抗、改善代謝平衡、降低炎癥,從而對(duì)肝癌具有一定的預(yù)防和治療作用。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)海藻中提取的可溶性膳食纖維巖藻黃質(zhì)可以通過PI3K/Akt通路誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的凋亡[31];可溶性玉米纖維可以通過增加ROS表達(dá),誘導(dǎo)Apc缺陷的結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡,顯著減少小鼠小腸腺瘤的形成和結(jié)腸息肉的數(shù)量[32]。此外,谷物豆組合膳食纖維可對(duì)Caco-2細(xì)胞葡萄糖吸收作用產(chǎn)生影響,并且可以改善胰島素抵抗HepG2細(xì)胞[33]。目前尚未見谷子源膳食纖維抗肝癌活性的相關(guān)報(bào)道,本研究為谷子源可溶性膳食纖維發(fā)揮抗肝癌效應(yīng)提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ),同時(shí)有效提高了谷物及谷糠資源的生物利用率。
本研究從山西特色天然產(chǎn)物資源全谷物、小米和谷糠中制備了三種谷子源可溶性膳食纖維,系統(tǒng)分析其含量和得率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)小米的可溶性膳食纖維最多,其次是全谷物可溶性膳食纖維,最后是谷糠可溶性膳食纖維;我們推測(cè)其原因是源于相同質(zhì)量的原材料,全谷物中小米所占的比重比小米原材料少,所以全谷物中可溶性膳食纖維的含量比小米中的少。對(duì)三種谷子源可溶性膳食纖維進(jìn)行了安全性評(píng)價(jià),結(jié)果揭示三種谷子源可溶性膳食纖維對(duì)人正常肝細(xì)胞HL-7702增殖無(wú)任何抑制作用。進(jìn)一步本研究采用HepG2細(xì)胞,評(píng)價(jià)三種谷子源可溶性膳食纖維的抗肝癌活性。研究結(jié)果證明,三種谷子源可溶性膳食纖維對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞均具有顯著的抑制作用,且谷糠可溶性膳食纖維的抗肝癌活性更強(qiáng),并具有濃度依賴性。此外,采用克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)證明谷糠可溶性膳食纖維可顯著抑制HepG2細(xì)胞的克隆形成能力和遷移能力,并且能夠通過誘導(dǎo)凋亡而抑制其增殖。
本研究對(duì)山西特色產(chǎn)物全谷物、小米和谷糠中的可溶性膳食纖維進(jìn)行提取和抗肝癌活性測(cè)定。結(jié)果顯示:小米可溶性膳食纖維含量最多,其次是全谷物可溶性膳食纖維,最少的是谷糠可溶性膳食纖維;三種谷子源可溶性膳食纖維均可有效抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖,其中谷糠可溶性膳食纖維的抗肝癌活性最顯著,并可以有效抑制克隆形成和細(xì)胞遷移、顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡。綜上所述,本研究對(duì)谷子源可溶性膳食纖維對(duì)于實(shí)際生活中預(yù)防和治療肝癌具有很好的指導(dǎo)意義,為肝癌的治療提供了新的思路。未來(lái)可針對(duì)谷子源膳食纖維組成展開工作,深入探討其發(fā)揮功能活性的單一組分,并研究其對(duì)肝癌細(xì)胞作用的分子機(jī)制及作用靶點(diǎn),以期提供安全、高效的抗肝癌保健品和新型藥物。