紫薯花青素大孔吸附樹脂的篩選

王世鵬，王 巖，范龍一

（1.黑龍江省標(biāo)檢產(chǎn)品檢測有限公司，黑龍江 哈爾濱 150000；2.黑龍江省市場監(jiān)督管理審核查驗中心，黑龍江 哈爾濱 150000）

花青素（Anthocyanidin） 又稱花色素，是自然界一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，是花色苷水解而得有顏色的苷元[1]。花青素屬于生物類黃酮物質(zhì)，而黃酮物質(zhì)最主要的生理活性功能是自由基清除能力和抗氧化能力。紫薯（Ipomoea batatas（L.） Lam） 又稱紫甘薯，紫薯的活性成分主要包括花青素、糖蛋白、綠原酸、黃酮類、脫氫表雄酮和膳食纖維等[2]，其所含花青素與葡萄皮等原料相當(dāng)，其穩(wěn)定性又高于黑莓色素和葡萄皮等，是一種重要的天然色素，在食品行業(yè)有著廣闊的應(yīng)用前景[3]。研究表明，紫薯花青素對·OH、H2O2等活性氧均具有清除和抑制作用，尤其對·OH 的清除能力強于抗壞血酸，且清除作用與濃度呈劑量關(guān)系[4]，具有抗氧化、清除自由基、抗突變、抗癌癥、抗心血管疾病、抗高血糖、改善肝功能等功效。

分離純化花青素的方法主要包括液相萃取法、柱層析法、固相萃取法、凝膠色譜法凝膠色譜、微生物發(fā)酵法、高速逆流色譜法、分子烙印技術(shù)等。其中，大孔吸附樹脂柱層析法具有吸附量大、效率高、成本低、可再生等優(yōu)點[5]，目前已發(fā)展為從不同類型植物中提純花青素最為常用的分離純化方法之一，用于玫瑰茄、樹莓、紫甘藍和藍莓[6-7]等花青素的提取。孫倩怡[8]采用D3520 型大孔樹脂對藍莓花青素進行分離純化，顯著提高了花青素純度。薛宏坤等人[9]利用大孔樹脂-Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠聯(lián)用技術(shù)從巨峰葡萄皮中獲得3種花色苷組分，并且純度都達到了90%以上。篩選出適于紫薯中花青素的分離純化的樹脂類型，并對其吸附和解析性能進行研究，以期為紫薯在食品、藥品等領(lǐng)域的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持，為工業(yè)化生產(chǎn)紫薯花青素提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料和試劑

紫薯，購于當(dāng)?shù)爻校粺o水乙醇（試劑純）、鹽酸（試劑純）、氫氧化鈉（試劑純），西隴科學(xué)股份有限公司提供；AB-8 型大孔樹脂（非極性）、D101型大孔樹脂（非極性）、NKA-9 型大孔樹脂（非極性）、NKA-II 型大孔樹脂（非極性）、RAS80 型大孔樹脂（非極性）、RAS07 型大孔樹脂（非極性）、RAW16 型大孔樹脂（極性）、RAW01 型大孔樹脂（極性）、RAW19(H)型大孔樹脂（極性）、RAW92 型大孔樹脂（極性），天津南開和成科技有限公司提供。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SPECORDR 210 PLUS 型紫外可見分光光度計，德國analytikjena 儀器有限公司產(chǎn)品；SD20 型pH計，梅特多- 托樂多（上海） 儀器有限公司產(chǎn)品；BSA224S 型電子天平，德國Sartorius 公司產(chǎn)品；膠體磨，韜越（上海） 機械科技有限公司產(chǎn)品；HH-4型恒溫水浴鍋，上海力辰儀器科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 紫薯花青素浸提液制備

選取新鮮、無腐爛的紫薯→洗凈→切塊→磨漿（5%檸檬酸水溶液，料液比1∶15） →浸提（溫度55 ℃，時間2 h） →冷卻備用。

1.2.2 大孔樹脂預(yù)處理

先用無水乙醇浸泡24 h，使其充分溶脹，蒸餾水洗至無醇味兒為止；再用5%鹽酸浸泡12 h，蒸餾水洗至中性；5%氫氧化鈉浸泡12 h，蒸餾水洗至中性，室溫下晾干，備用。

1.2.3 靜態(tài)吸附能力的篩選

用電子天平分別稱取每種樹脂5 g，然后分別進行裝柱編號，吸取10 mL 備用的紫薯果浸提液勻速上樣，經(jīng)1 h 充分吸附后，分別收集樹脂流出液，于波長542 nm 處分別測定各流出液的吸光度A1，并計算其吸附率α，篩選出高吸附率的樹脂。樹脂吸附率的計算公式如下：

式中：A0——提取液在波長542 nm 處的吸光度；

A1——大孔樹脂充分吸附紫薯花青素后流出溶液的吸光度。

1.2.4 解析率的篩選

根據(jù)樹脂的靜態(tài)吸附率，初步選出對紫薯花青素吸附效果較好的大孔吸附樹脂，進行解析力的篩選。分別使用30 mL 用70%乙醇溶液勻速洗脫已經(jīng)篩選出的樹脂，30 min 后分別收集流出液，于波長542 nm 處分別測定其吸光A2，并根據(jù)下列公式計算其解析率δ，篩選出解析率較大的大孔吸附樹脂。解析率的計算公式如下：

式中：A2——吸附飽和的樹脂經(jīng)乙醇解析后流出液的吸光度。

1.2.5 上樣載量對大孔吸附樹脂吸附效果的影響

分別取10 mL 已經(jīng)篩選出的大孔吸附樹脂，分別進行裝柱，用 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 BV（1 BV 為1 個樹脂床體積） 的紫薯花青素浸提液分別對不同的大孔樹脂進行上樣吸附，分別收集不同載量條件下的流出液并定容至100 mL，于波長542 nm 處測定其吸光度，并比較其最大的上樣載量大小。

1.2.6 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對解析效果的影響

分別取5 g 已經(jīng)吸附飽和的篩選出的大孔吸附樹脂裝柱，分別設(shè)定30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100% 8 個洗脫劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)，分別用30 mL 不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇在室溫條件下進行解析，30 min 后分別收集流出液，稀釋一定倍數(shù)，于波長542 nm 處測定其吸光度。

1.2.7 樣品pH 值對大孔吸附樹脂吸附效果的影響

用鹽酸或氫氧化鈉溶液將pH 值為3.03 的紫薯浸提液配置成不同pH 值溶液，分別設(shè)為2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.5，然后分別取 10 mL 對篩選出的樹脂上樣吸附，1 h 充分吸附后，分別收集流出液，于波長542 nm 處測定其吸光度。

1.2.8 使用次數(shù)對大孔吸附樹脂吸附效果的影響

分別用10 mL 紫薯浸提液對篩選出的3種大孔吸附樹脂進行上樣吸附，經(jīng)1 h 充分吸附后，分別收集流出液，10 mL 定容，靜置10 min 后，分別于波長542 nm 處測定其吸光試，再用70%乙醇溶液30 mL 洗脫大孔吸附樹脂，上述操作重復(fù)10 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔吸附樹脂靜態(tài)吸附結(jié)果

10種大孔吸附樹脂的吸光度及吸附率見表1。

測得紫薯浸提液的吸光度A0=1.075。由表1 可知，當(dāng)紫薯浸提液上樣量為10 mL 時，不同型號的大孔吸附樹脂對紫薯花青素吸附能力差異較大。根據(jù)大孔吸附樹脂吸附紫薯浸提液的吸光度越小，其吸附率越大，吸附效果越好。因此，篩選出吸附效果較好的 5種樹脂分別為 D101，AB-8，RAS07，NKA-II，RAS80，室溫下，5種大孔吸附樹脂吸附率均可達到90%以上。因為吸附率主要與樹脂極性、溶液極性和大孔樹脂表面積等有關(guān)[10]，篩選出的5種樹脂都為非極性樹脂，花青素類物質(zhì)屬于弱極性化合物，且有一定的極性和親水性，因此易被弱極性或非極性樹脂的吸附[11]。

表1 10種大孔吸附樹脂的吸光度及吸附率

2.2 大孔吸附樹脂解析率結(jié)果

5種大孔吸附樹脂的吸附率和解析率見表2。

表2 5種大孔吸附樹脂的吸附率和解析率

解析率也是衡量大孔吸附樹脂純化紫薯花青素性能的重要指標(biāo)[12]，由表2 可知，當(dāng)上樣量為10 mL 時，大孔吸附樹脂解析率大小為D101＞AB-8＞RAS80＞RAS07＞NKA-II。綜合吸附率和解析率2 個指標(biāo)，從而篩選出3種對紫薯花青素浸提液吸附效果較好的大孔吸附樹脂：D101 型，AB-8 型，RAS80 型大孔樹脂，其解析率可達80%以上，D101 型樹脂的解析率達到了90%以上。

2.3 樣品上樣載量對大孔吸附樹脂吸附效果的影響

樹脂性能的優(yōu)劣除與吸附率、解析率有關(guān)外，還與其對有效成分的吸附載量密切相關(guān)，也是制約其應(yīng)用于生產(chǎn)的重要因素。

樣品上樣載量對大孔吸附樹脂吸附效果影響見圖1。

圖1 樣品上樣載量對大孔吸附樹脂吸附效果影響

由圖1 可知，流出液的吸光值隨著上樣體積的增加逐漸增加，即篩選出的3種大孔樹脂對紫薯花青素吸附能力隨上樣體積增加而降低。當(dāng)流出液吸光度達到上樣紫薯花青素溶液吸光度1/10 時，認為已有花青素透出，即只要吸附后的流出液中出現(xiàn)紫薯花青素大孔樹脂就已達到最大吸附量。D101 型，AB-8 型，RAS80 型大孔樹脂的上樣液體積分別達7，9，8 BV 時樹脂已經(jīng)不能再吸附。由此可知，在大孔吸附樹脂柱體積相同的條件下，樹脂吸附紫薯花青素的能力是有限的且與上樣載量有關(guān)。一般最佳的上樣載量應(yīng)為2～4 BV。

2.4 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對解析效果的影響

乙醇體積分?jǐn)?shù)對大孔吸附樹脂紫薯花青素解析率影響見圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對大孔吸附樹脂紫薯花青素解析率影響

由圖2 可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，解析率呈上升趨勢。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時AB-8 大孔吸附樹脂解析率最大；乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時D101 型大孔吸附樹脂解析率最大；乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時RAS80 型大孔吸附樹脂解析率最大，故分別用70%左右的乙醇解析大孔樹脂上吸附的紫薯花青素效果最好，很好地說明大孔樹脂適合在水溶液中進行吸附。

2.5 上樣液pH 值對大孔吸附樹脂的吸附效果影響結(jié)果

浸提液pH 值對3種大孔吸附樹脂吸附能力的影響見圖3。

圖3 浸提液pH 值對3種大孔吸附樹脂吸附能力的影響

不同類型大孔吸附樹脂在吸附時所要求的紫薯花青素浸提液最適pH 值也有所區(qū)別。由圖3 可知，在 pH 值 2.0～4.0，隨著 pH 值的升高 RAS80 型大孔吸附樹脂吸附紫薯花青素的吸附率逐漸增大；pH 值4.0 時吸附率最大；在pH 值4.0～5.5，隨著 pH 值的升高其吸附率急劇下降，可能是紫薯花青素在不同pH 值溶液中穩(wěn)定性不同所造成的[13]。所以當(dāng)粗提液pH 值增大時，花青素的穩(wěn)定性下降，其吸附率發(fā)生變化。AB-8 型大孔吸附樹脂在pH 值2.5 和pH 值3.0 處吸附紫薯花青素的吸附率較高，且隨著pH 值的升高其吸附率幾乎不變化，因為紫薯花青素因離子化趨勢而不易被吸附[14]，但pH 值2.5 時花青素易水解，故選擇pH 值3.0。隨著pH 值的升高，D101型大孔吸附樹脂的吸附率逐漸減小，在pH 值2.5 和pH 值2.0 時吸附率較高，選擇pH 值2.0。

2.6 大孔吸附樹脂重復(fù)使用次數(shù)對其吸附效果影響的分析

3種大孔吸附樹脂重復(fù)使用次數(shù)對其吸附效果的影響見圖4。

圖4 3種大孔吸附樹脂重復(fù)使用次數(shù)對其吸附效果的影響

由圖4 可知，隨著使用次數(shù)的增加，紫薯浸提液經(jīng)3種大孔吸附樹脂吸附后流出液的吸光度逐漸增加，表明其吸附能力逐漸下降，樹脂性能變差。因為大孔吸附樹脂一般存在樹脂中毒的現(xiàn)象，在重復(fù)使用多次以后，其吸附能力會明顯減弱，引起中毒的原因有蛋白質(zhì)、多糖中毒等[15]。同時，在使用第10 次時流出液的吸光度幾乎不變化，可以推斷出這3種大孔吸附樹脂在使用后需要再生。RAS80 型大孔吸附樹脂重復(fù)使用多次后吸光值相對于D101 型，AB-8 型大孔吸附樹脂變化較明顯，流出液的吸光度較大，表明其多次使用后吸附性減弱甚至消失，從經(jīng)濟方面考慮，不選擇RAS80 型大孔吸附樹脂吸附紫薯花青素。

3 結(jié)論

利用大孔吸附樹脂法分離純化紫薯花青素方便可行，大孔吸附樹脂吸附紫薯浸提液中的花青素后，再通過70%乙醇溶液洗脫，可得到純度較高的花青素，而且樹脂可循環(huán)再生，反復(fù)使用，既節(jié)約資源又降低成本，是分離和提取紫薯花青素的良好方法。通過對10種大孔樹脂的靜態(tài)吸附、解析性、載量、使用次數(shù)等影響因素研究，篩選出適合純化紫薯中花青素吸附性和解析性較好的2種大孔吸附樹脂：AB-8 型和D101 型。利用AB-8 型和D101 型大孔吸附樹脂吸附時，紫薯花青素浸提液pH 值應(yīng)控制在2.0～3.5，洗脫劑體積在70%左右，載量8，9 BV。不適合吸附紫薯花青素的8種大孔吸附樹脂：NKA-9 型，NKA-II 型，RAW01 型，RAW16 型，RAW19(H)型，RAW(92)型，RAS07 型，RAS80 型。