藏紅花提取液對兔慢性高眼壓視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究

王雙梅，?；ɡ?，馮 燕，于敬妮

(西安市人民醫(yī)院 西安市第四醫(yī)院，陜西 西安710004)

青光眼是以視神經(jīng)萎縮和視野缺損為特征的致盲性眼病。雖然眼壓升高是青光眼的主要危險(xiǎn)因素，但也有部分眼壓正常、視神經(jīng)損傷仍在進(jìn)展的青光眼病例。這些病例的致病因素可能與眼部微循環(huán)改變、自由基損傷、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏及節(jié)細(xì)胞凋亡等有關(guān)[1]。文獻(xiàn)[2-3]報(bào)道藏紅花可以改善微循環(huán)和清除自由基，具有保護(hù)神經(jīng)、保護(hù)心肌、記憶增強(qiáng)等藥理作用，在臨床上已被用于心臟缺血損傷的研究；研究發(fā)現(xiàn)藏紅花可通過抗凋亡、抗水腫對大鼠損傷神經(jīng)起到保護(hù)作用[4-5]。我們曾觀察到藏紅花素對缺血再灌注視網(wǎng)膜神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用,為了進(jìn)一步了解藏紅花對高眼壓視神經(jīng)損傷的作用機(jī)制,本研究觀察了藏紅花對慢性高眼壓模型動物視神經(jīng)和視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的影響，為其臨床應(yīng)用提供進(jìn)一步的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 地塞米松注射液(天津藥業(yè)集團(tuán))，卡波姆2940(上海申興制藥廠),配成3 g/L復(fù)方卡波姆溶液，藏紅花(空軍軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院藥劑科)，速眠新注射液(農(nóng)牧大學(xué)軍事獸醫(yī)研究所)，其他試劑盒(德國羅氏公司)。

1.2 藏紅花提取液的配制 藏紅花150 g,加蒸餾水煮沸騰30 min后，過濾兩次,濾液減壓濃縮后,加3倍量950 ml/L乙醇，沉淀24 h,再過濾,減壓蒸餾回收乙醇后,稀釋為100 ml裝瓶,滅菌30 min，用時再稀釋成50 g/L溶液[6]。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 健康新西蘭成年白兔(空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心)，12～16月齡,體重2.5～3 kg。裂隙燈、眼底鏡檢查，排除眼部異常的動物,滴5 g/L丁卡因眼液表面麻醉，Schiotz眼壓計(jì)測眼壓，連續(xù)3 d,1次/d，測后滴左氧氟沙星滴眼液。選取眼壓低于17 mmHg[5]的動物20只用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 慢性高眼壓模型的建立及動物分組 模型制成后分成高眼壓組、治療Ⅰ組和治療Ⅱ組，每組5只(10只眼)，另5只兔作為對照組。白兔以速眠新0.1 ml/kg肌注麻醉，1 ml注射器吸入0.2 ml復(fù)方卡波姆溶液，從角膜緣刺入前房、留針，留針處對側(cè)角膜緣，助手用1 ml注射器刺入前房，助手緩慢抽出房水約0.2 ml，術(shù)者向前房注入約0.2 ml復(fù)方卡波姆溶液，拔針棉簽按壓，滴左氧氟沙星眼水，每天測眼壓，共28 d，眼壓22 mmHg以上，提示慢性高眼壓模型成功[7]。對照組動物僅作前房穿刺。

1.5 藥物注射 模型成功后第2天開始給藥。治療Ⅰ、Ⅱ組耳緣靜脈分別注射藏紅花提取液20、80 mg/kg(分別為濃度50 g/L的藏紅花提取液1、4 ml)，1次/d，連續(xù)28 d；高眼壓組和對照組注射0.9%氯化鈉溶液2 ml。

1.6 視神經(jīng)標(biāo)本的制備 治療4周后，各組動物在速眠新注射液深麻下，1000 ml 濃度為40 ml/L多聚甲醛液經(jīng)心臟灌流固定后，摘出球后3～5 mm段視神經(jīng)，以含25 ml/L戊二醛的磷酸鹽液固定1 h，以10 ml/L鋨酸后固定，電鏡梯度乙醇脫水后，Epon812做包埋，切1 μm厚半薄切片(視神經(jīng)的近端切橫切面)，甲苯胺藍(lán)染色，光鏡定位，再切成50 nm厚的超薄切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色后電鏡觀察。在透射電鏡6000倍下，記數(shù)各個標(biāo)本每個視野的視神經(jīng)軸突數(shù)量，以視神經(jīng)為基準(zhǔn)分別向兩側(cè)，每個標(biāo)本取10個方位，每個方位4個視野，最后求出平均值分析。

1.7 視網(wǎng)膜切片的制備 上述動物取出視神經(jīng)后，沿相同矢狀面剪開眼球，剪出帶視神經(jīng)的視網(wǎng)膜組織，剪去角膜，在40 ml/L多聚甲醛液中后固定20 min，200 ml/L蔗糖溶液浸泡至完全下沉。將標(biāo)本用Tissu-Tek包埋，用恒冷箱冰凍切片機(jī)切片，片厚12 μm，裱于多聚賴氨酸預(yù)處理的載片上，置于-20 ℃以備TUNEL、HE染色及免疫組化用。

1.8 TUNEL染色 視網(wǎng)膜切片，在室溫下晾干后，按以下步驟染色：0.01 mol/L PBS洗5 min； 10 μg/ml蛋白酶K液孵育5 min；0.01 mol/L PBS洗5 min；玻片加TDT反應(yīng)復(fù)合物，37 ℃孵育2 h；SSC浸洗玻片15 min，PBS洗兩次，3 ml/L H2O2洗3 min，HRP孵育30 min，PBS洗兩次，DAB呈色、水洗、脫水、封片，鏡下觀察。凋亡細(xì)胞以Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.9 Caspase 3免疫組織化學(xué)染色 Caspase 3免疫組化試劑盒進(jìn)行標(biāo)記染色，具體步驟如下：PBS(pH7.2)緩沖液沖洗，浸入 0.01 mmol/L 檸檬酸中高壓熱修復(fù)，正常血清PBS，室溫下孵育20 min，除去血清；滴加稀釋的一抗，滴加生物素標(biāo)記二抗(1%BSA-PBS 稀釋)，滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(PBS 稀釋)，脫水、顯色劑顯色。

2 結(jié) 果

2.1 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層形態(tài) HE染色顯示：對照組視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞呈單層排列整齊(圖中最上面一層，箭頭處)，數(shù)量豐富 (圖1A) 。高眼壓組視網(wǎng)膜變薄，節(jié)細(xì)胞層數(shù)目極少，殘存的節(jié)細(xì)胞出現(xiàn)空泡化改變(圖1B) 。治療Ⅰ組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)層次可見，節(jié)細(xì)胞層排列相對整齊，數(shù)目較高眼壓組明顯增多 (圖1C) 。治療Ⅱ組視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層結(jié)構(gòu)及數(shù)量接近對照組 (圖1D) 。

A：對照組；B：高眼壓組；C：治療Ⅰ組；D：治療Ⅱ組

2.2 電鏡下節(jié)細(xì)胞軸突數(shù)量及超微結(jié)構(gòu) 6000倍下高眼壓組視神經(jīng)內(nèi)節(jié)細(xì)胞軸突數(shù)量較其他三組明顯減少，兩治療組神經(jīng)軸突數(shù)量顯著增加，而治療Ⅱ組接近于對照組，經(jīng)單因素方差分析,顯示各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，SNK法進(jìn)行兩兩比較，高眼壓組與治療Ⅰ組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.05)，對照組、治療Ⅱ組與高眼壓組、治療Ⅰ組之間比較均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表1。對神經(jīng)軸突的超微結(jié)構(gòu)觀察，對照組：視神經(jīng)軸突結(jié)構(gòu)完整，板層清晰；高眼壓組：視神經(jīng)軸突髓鞘結(jié)構(gòu)破壞、紊亂，可見節(jié)段性脫髓鞘、軸索變性、軸膜脫離等；治療Ⅰ組：視神經(jīng)軸突髓鞘較薄，軸膜仍有脫離。治療Ⅱ組：視神經(jīng)軸突髓鞘稍薄，軸膜完整，結(jié)構(gòu)形態(tài)接近正常。

表1 電鏡下視神經(jīng)軸突計(jì)數(shù)比較(個)

2.3 各組神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡比較 TUNEL染色顯示：對照組節(jié)細(xì)胞層染色淺淡，鮮有深染的TUNEL陽性細(xì)胞(箭頭所指處)，凋亡細(xì)胞數(shù)為(1.8±0.23)個(圖2A)。高眼壓組節(jié)細(xì)胞層有大量濃染的TUNEL陽性細(xì)胞，凋亡細(xì)胞數(shù)為(26.7±4.51)個(圖2B)。治療Ⅰ組節(jié)細(xì)胞層深染的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量較高眼壓組明顯為少，凋亡細(xì)胞數(shù)為(15.3±2.52)個(圖2C)。治療Ⅱ組節(jié)細(xì)胞層染色淡，僅見個別深染的陽性細(xì)胞，凋亡細(xì)胞數(shù)為(3.9±1.68)個(圖2D)。各組間經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,顯示各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

A：對照組；B：高眼壓組；C：治療Ⅰ組；D：治療Ⅱ組

2.4 各組免疫組化 Caspase 3表達(dá)情況比較 對照組中Caspase 3表達(dá)最弱，節(jié)細(xì)胞層僅見散在棕黃色的陽性細(xì)胞(圖3A箭頭所指處)。高眼壓組表達(dá)最強(qiáng)，節(jié)細(xì)胞層可見大量棕黃色陽性細(xì)胞，視網(wǎng)膜全層都有表達(dá)，內(nèi)核層也見濃染的棕黃色陽性細(xì)胞(圖3B)。治療Ⅰ組視網(wǎng)膜各層可見棕黃色陽性細(xì)胞，節(jié)細(xì)胞層棕黃色陽性細(xì)胞數(shù)量較高眼壓組明顯減少(圖3C)。治療Ⅱ組視網(wǎng)膜各層有少量棕黃色陽性細(xì)胞，節(jié)細(xì)胞層散在棕黃色陽性細(xì)胞，數(shù)量接近對照組(圖3D)。

A：對照組；B：高眼壓組；C：治療Ⅰ組；D：治療Ⅱ組

3 討 論

青光眼為全球第一位不可逆性致盲性眼病，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷是青光眼損傷核心問題，而視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(Retinal ganglion cells，RGCs)凋亡是其病理基礎(chǔ)[8]。表現(xiàn)為隨著視網(wǎng)膜組織缺血缺氧時間的延長及機(jī)械壓力的持續(xù)存在，RGCs缺血缺氧而受損，其軸突構(gòu)成的視神經(jīng)也損傷、變性；或者處于膠原纖維中的血管受壓變形，造成缺血缺氧，神經(jīng)通路受阻，導(dǎo)致視神經(jīng)軸突結(jié)構(gòu)改變，節(jié)細(xì)胞壞死，并產(chǎn)生大量的氧自由基，進(jìn)一步加重RGCs凋亡程度[9]。有研究表明，氧自由基造成視網(wǎng)膜組織核酸斷裂，脂質(zhì)過氧化，激活Caspase，致使神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡[10-11]?，F(xiàn)代研究表明，Caspase家族是細(xì)胞凋亡的必經(jīng)之路，Caspase 3是多條凋亡通路的匯聚點(diǎn)，通過活化Caspase 3，最終啟動細(xì)胞凋亡程序[12]。因此，阻斷Caspase 3的活化是中斷細(xì)胞凋亡發(fā)生的重要途徑。

傳統(tǒng)中藥藏紅花具有活血化瘀功效。已有研究表明，藏紅花有改善視網(wǎng)膜缺血狀態(tài)、抗氧化和抑制凋亡等作用[13-14]，其抗凋亡特性已被許多研究證實(shí)[15-16]；有研究發(fā)現(xiàn)藏紅花素可通過抗凋亡、抗氧化作用在高眼壓狀態(tài)下保護(hù)視網(wǎng)膜視神經(jīng)[17-18]；同時研究[19-20]表明，藏紅花素具有抑制氧自由基、改善線粒體功能，從而抑制RGCs凋亡。本研究從視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層形態(tài)學(xué)入手，觀察到高眼壓組RGCs數(shù)量顯著減少，殘存節(jié)細(xì)胞空泡化，藏紅花治療Ⅰ組節(jié)細(xì)胞層排列相對整齊，治療Ⅱ組節(jié)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及節(jié)細(xì)胞數(shù)量接近對照組；對神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突電鏡觀察，見高眼壓組神經(jīng)軸突形態(tài)損傷嚴(yán)重，數(shù)量顯著性減少；藏紅花治療Ⅰ組神經(jīng)軸突髓鞘薄，數(shù)量增加；治療Ⅱ組視神經(jīng)軸突形態(tài)、數(shù)量基本接近對照組，說明藏紅花對RGCs及其神經(jīng)軸突有保護(hù)作用，且高劑量組效果更佳，這與Yang等[16]研究觀點(diǎn)不謀而合；進(jìn)一步TUNEL染色，檢測到高眼壓組節(jié)細(xì)胞凋亡嚴(yán)重，凋亡細(xì)胞數(shù)為(26.7±4.51)個，與正常對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，藏紅花治療Ⅰ組節(jié)細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)為(15.3±2.52)個，治療Ⅱ組僅見個別深染的陽性細(xì)胞，凋亡細(xì)胞數(shù)為(3.9±1.68)個，與高眼壓組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明藏紅花可減緩RGCs凋亡，且高劑量組作用更強(qiáng)；最后從凋亡發(fā)生重要環(huán)節(jié)、Caspase 3做檢測，結(jié)果見高眼壓組節(jié)細(xì)胞層大量陽性細(xì)胞，證實(shí)大量Caspase 3蛋白表達(dá)，藏紅花治療Ⅰ組節(jié)細(xì)胞層棕黃色陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，治療Ⅱ組少量棕黃色陽性細(xì)胞，節(jié)細(xì)胞層散在棕黃色陽性細(xì)胞，數(shù)量接近對照組，說明藏紅花可減少Caspase 3蛋白表達(dá)，且高劑量組阻斷效果更明顯。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從RGCs形態(tài)學(xué)、RGCs軸突超微結(jié)構(gòu)及數(shù)量、TUNEL染色節(jié)細(xì)胞凋亡及Caspase 3蛋白表達(dá)等方面，說明藏紅花對RGCs及其軸突損傷有改善作用，藏紅花可阻斷Caspase 3蛋白表達(dá)，抑制RGCs凋亡，減輕神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突損傷，最終起到保護(hù)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷的作用。然而，慢性高眼壓視神經(jīng)RGCs損傷可能還存在其他因素作用的結(jié)果，而藏紅花對其保護(hù)的更深層面作用有待進(jìn)一步研究。