施氮對甜菜不同發(fā)育階段根際氨基酸含量的影響

杜勝楠，潘桓艷，邢啟男，張愛玲，王秋紅

（黑龍江大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 前言

土壤氮素是作物氮素養(yǎng)分的主要來源，是衡量農(nóng)業(yè)土壤肥力的重要指標(biāo)。由于土壤氨基酸的分布特點(diǎn)，是由微生物、植物與自然環(huán)境因子共同作用決定的，因此剖析土壤中氨基酸的分布特點(diǎn)和變化，將有利于探究土壤中氮的來源和轉(zhuǎn)化，也有利于探究氨基酸對土壤的化學(xué)和物理性質(zhì)的影響，從而可以進(jìn)一步認(rèn)識其對作物生長、生理變化的影響。由于土壤中有機(jī)氮占土地全氮的95%以上，而氨基酸態(tài)氮則是土壤有機(jī)氮的最重要成分，所以，其含量與組成將直接影響到土壤氮素的供應(yīng)情況。土壤氨基酸氮大多存在在土壤有機(jī)質(zhì)中的蛋白質(zhì)和多肽中[1]，其含量和組成也與施肥直接相關(guān)。ALLEN等[2]用示蹤法調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，施氮后，土壤腐殖質(zhì)中氨基酸氮所占全氮比例明顯增加。王巖等[3]的研究結(jié)果表明，殘余化學(xué)氮肥有部分轉(zhuǎn)變?yōu)榘被岬?。張旭東等[4]的研究結(jié)果則指出，有機(jī)肥料也可明顯提高土壤中氨基酸氮的含量。眾多科學(xué)研究結(jié)果都證明，施肥使土壤中各種形態(tài)氮的含量均有了一定程度的提高，而氨基酸態(tài)氮的提高尤為突出[5-8]。這些研究結(jié)果都闡述了施肥對氨基酸總量的影響，但對氨基酸種類的影響鮮少涉及。為了適應(yīng)土壤微生物代謝和植株生長發(fā)育中對含氮物質(zhì)的需求，土壤氨基酸利用解聚、礦物質(zhì)化等作用，來提高土壤可利用氮源[9]。因此，研究氨基酸的動態(tài)尤其是耕田土壤中不同氮處理下各氨基酸隨甜菜生長變化的動態(tài)規(guī)律十分必要。本文通過研究氮肥使用后土壤氨基酸在兩個基因型甜菜不同生長期中的含量變化規(guī)律，探究土壤氨基酸的長期可利用性與短期供氮潛力，為評價土壤有機(jī)氮在生態(tài)系統(tǒng)中氮素循環(huán)的庫源作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2021年4月在黑龍江大學(xué)呼蘭校區(qū)田間進(jìn)行。選取黑龍江大學(xué)呼蘭校區(qū)試驗(yàn)田為試驗(yàn)用土，基礎(chǔ)土樣含有機(jī)質(zhì)(SOM)48.72 g/kg、堿解氮(Alkali-N)153.66 mg/kg、速效磷(Valid-P)117.76 mg/kg、速效鉀(Valid-K)136.97 mg/kg、全氮(TN)2.02 g/kg、全磷[TP(P2O5)]0.157 g/kg、全 鉀 [TK(K2O)]0.309 g/kg，pH 6.38[11]。試驗(yàn)材料選取有機(jī)氮吸收效率高、低的品種[12]各1個，分別為有機(jī)氮高效的品種‘KWS8138’和有機(jī)氮低效的品種‘Beta176’。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

1.2.1 不同氮處理 取黑土的表土10 cm，過3 mm篩。設(shè)置2個施氮處理：

（1）未施氮 N：0 mg/kg，P2O5：150 mg/kg，K2O：150 mg/kg；

（2）正常施氮N：150 mg/kg，P2O5：150 mg/kg，K2O：150 mg/kg。

表層土10 cm施肥：N用硫胺[N%=(28/132.14)×99%=20.98%]，P 用磷酸一鈣[P2O5%=(142/252.08)×92%=51.82%]，K用硫酸鉀[K2O%=(94/174.26)×99%=53.40%]，均用分析純試劑。按照150 kg/hm2施肥。

3次重復(fù)，每個小框區(qū)長2 m，寬1 m；大框區(qū)長10 m，寬1 m。

用尼龍布（300目）制成直徑為0.55 m的網(wǎng)袋，邊緣穿繩收口。每個網(wǎng)袋裝900 g的土，分別在每種處理的小框區(qū)內(nèi)種植2排甜菜，共需網(wǎng)袋10×2=20個。

1.2.2 根際內(nèi)外 選取表層0～25 cm土壤，不施氮(N：0 mg/kg，P：150 mg/kg，K：150 mg/kg)處理，混勻后，按照土壤容重1.34 g/cm3在桶中分層裝入8 kg底土及12 kg網(wǎng)袋外土，二者成分一致，然后將網(wǎng)袋裝入1.25 kg土后埋入桶中，于網(wǎng)袋上播種30粒甜菜種子，覆土150 g。每份材料12個重復(fù)。取根際和非根際土壤待測，其中根際土壤在網(wǎng)袋內(nèi)收集，是距離活體根系表面1～2 mm以內(nèi)的土壤和根表面及其黏附的土壤，非根際土是指網(wǎng)袋外的土壤，每份土壤3次重復(fù)。

1.2.3 取樣時期 在甜菜4個時期各取4個重復(fù)。4個時期分別為：苗期、葉叢快速生長期、塊根糖分積累期、收獲期。

1.3 測定指標(biāo) 對甜菜不同時期取到的根際和非根際土壤，采用高效液相色譜法測定氨基酸[13]：包括組氨酸(His)、絲氨酸(Ser)、精氨酸(Arg)、酪氨酸(Tyr)、甲硫氨酸(Met)、甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、賴氨酸(Lys)、半胱氨酸(Cys)、蘇氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、亮氨酸(Leu)、纈氨酸(Val)、異亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)等17種氨基酸各氨基酸含量，及總氨基酸(Total amino acids)含量。

2 結(jié)果與分析

在根際土壤的所有處理樣品中，均檢測到17種氨基酸。結(jié)果見表1、2。因此在不同處理土壤之間氨基酸的組成無變化。在所檢測的17種酸解氨基酸中，以Thr、Pro、Val所占比例較大，占比皆大于10%；而Asp、Cys、Tyr、His、所占比例較低，占比皆低于3%；其余10種酸解氨基酸，如 Ser、Glu、Met、Ile、Leu、Phe、Lys、Arg、Gly和Ala居中，占比在4%～9%之間。如圖1所示。

2.1 不同處理條件下根際土壤氨基酸的差異分析

2.1.1 施氮對土壤中氨基酸含量的影響 施用氮肥雖然對土壤氨基酸組成無影響，但對氨基酸含量影響較大。如表1、2所示。與未施氮處理相比，施用氮肥使氮基酸的總量明顯提高。但在各種氨基酸的變化上又存在著個體差異。按照CAMPBELL等[14]的方法，將氨基酸分為4類。酸性氨基酸：Asp和Glu。中性氨基酸：Thr、Ser、Gly、Ala、Val、Ile、Leu、Tyr、Phe和Pro。堿性氨基酸：Lys、His和Arg，含硫氨基酸：Cys、Met。在4類氨基酸氮中，中性氨基酸（總量平均946.72 mg/kg），堿性氨基酸（總量平均166.75 mg/kg），含硫氨基酸（總量平均96.61 mg/kg），酸性氨基酸（總量平均91.36 mg/kg），含量依次下降，這4類氨基酸氮分別占氨基酸氮總量的72.77%、12.81%、7.42%和7.01%（圖1）。

圖1 施氮與未施氮條件下兩個甜菜品種在不同時期各氨基酸的占比

表1 施氮對品種‘KWS8138’不同發(fā)育階段氨基酸含量的影響 mg/kg

施氮影響最顯著的是中性氨基酸（施肥平均增加91.56mg/kg），其次為堿性氨基酸（平均增加14.73mg/kg），最后是含硫氨基酸（平均增加5.83 mg/kg），酸性氨基酸（平均增加5.23 mg/kg）。

施氮處理后無論何品種何時期，17種氨基酸中總體呈現(xiàn)增長趨勢的是：His、Arg、Glu、Thr、Ala、Pro、Cys、Lys、Asp、Ser、Gly、Met、Val、Ile、Leu、Phe。呈現(xiàn)下降趨勢的是：Tyr。

將施氮處理土壤與不施氮土壤中的各氨基酸的含量測定結(jié)果平均后求差值，差值愈大，說明施肥影響愈明顯。以此比較，施肥對檢測到的17種酸解性氨基酸氯影響從大到小的順序依次為：Thr、Gly、Ala、Pro、Val、Leu、Lys、Ser、Arg、Glu、Met、Phe、Ile、His、Cys、Tyr、Asp。其中施肥對于Tyr是負(fù)影響，于其他氨基酸是正影響。

表2 施氮對品種‘Beta176’不同發(fā)育階段氨基酸含量的影響 mg/kg

2.1.2 甜菜品種間土壤中氨基酸含量的差異 作物的氮素吸收能力在不同氮效率基因型之間存在顯著差異[11]。氮高效品種‘KWS8138’的土壤中各時期氨基酸總體含量比氮低效品種‘Beta176’高的有：Asp、Glu、Ala、Met、Arg、Lys。比其低的有：His、Thr、Pro、Cys、Ser、Gly、Val、Ile、Leu、Phe、Tyr。甜菜苗期‘KWS8138’品種根際土壤氨基酸總量高于‘Beta176’品種，平均高出22.16mg/kg，塊根糖分積累期，平均高出36.58 mg/kg，收獲期，平均高出18.46 mg/kg，而葉叢快速增長期‘KWS8138’品種根際土壤氨基酸總量低于‘Beta176’品種，平均低出109.08 mg/kg。

甜菜品種影響最顯著的是中性氨基酸（兩品種相差199.16mg/kg），其次為酸性氨基酸（相差112.36mg/kg），最后是堿性氨基酸（相差29.92 mg/kg），含硫氨基酸（相差11.92 mg/kg）。

將2個品種所有土樣中的氨基酸的測定結(jié)果平均，比較2品種土壤樣品中氨基酸的差值。差值愈大，說明品種的影響愈突出。以此比較，品種對檢測到的17種酸解性氨基酸氯影響從大到小的順序依次為：Glu、Thr、Pro、Ser、Val、Gly、Tyr、Lys、Arg、Leu、Ile、His、Met、Asp、Cys、Ala、Phe。

2.1.3 不同發(fā)育階段對土壤中氨基酸含量的影響 甜菜4個時期中總氨基酸含量隨甜菜生長呈上升趨勢。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，不同種類的氨基酸在甜菜苗期、葉叢快速生長期、塊根糖分積累期、收獲期的含量變化動態(tài)有所不同。

在甜菜生長過程中，中性氨基酸含量隨甜菜生長一直呈上升趨勢，與苗期相比，葉叢快速生長期增加48.88 mg/kg，塊根糖分積累期較葉叢快速生長期增加91.00mg/kg，收獲期較塊根糖分積累期增加15.63mg/kg。與中性氨基酸相同，堿性氨基酸含量隨甜菜生長一直呈上升趨勢，與苗期相比，葉叢快速生長期增加21.91 mg/kg，塊根糖分積累期較葉叢快速生長期增加3.01 mg/kg，收獲期較塊根糖分積累期增加5.95 mg/kg，其含量在收獲期顯著高于其他取樣時期。

酸性氨基酸的含量隨甜菜生長呈先上升后下降趨勢，與苗期相比，其含量在葉叢快速生長期增加了約5.77 mg/kg，于塊根糖分積累期開始下降，與葉叢快速生長期相比下降7.41 mg/kg，收獲期又較塊根糖分積累期下降6.74 mg/kg，含硫氨基酸的比例隨甜菜生長呈先下降后上升又下降趨勢，與苗期相比，葉叢快速生長期下降了約4.34 mg/kg，在塊根糖分積累期卻上升了約14.33 mg/kg，收獲期又較塊根糖分積累期下降7.26 mg/kg。

2.2 根際內(nèi)外土壤中氨基酸含量的差異

選取差異較大的Ser、Tyr、Ala、Gly、Arg為例進(jìn)行論述，2個甜菜品種在不同時期根際內(nèi)外土壤各氨基酸的占比差異如圖2所示。

圖2 2個甜菜品種在不同時期根際內(nèi)外土壤各氨基酸的占比

2.2.1 不同發(fā)育階段根際內(nèi)外部分氨基酸含量的差異根際內(nèi)外土壤中不同的氨基酸在甜菜苗期、葉叢快速生長期、塊根糖分積累期、收獲期的含量變化動態(tài)是不同的。各時期根際內(nèi)外各氨基酸對比如表3所示。

表3 各時期根際內(nèi)外各氨基酸占比 %

隨著甜菜生長，根際內(nèi)土壤中，Ser與Ala占比逐漸減少，Tyr占比逐漸增加，Gly占比于塊根糖分積累期減少，其他時期占比無明顯差異，Arg于葉叢快速生長期有所減少，塊根糖分積累期占比增加，收獲期又有所減少。

根際外土壤中，Ser、Ala、Arg呈下降趨勢，Tyr和Gly無明顯變化。

2.2.2 不同甜菜品種根際內(nèi)外氨基酸含量的差異‘KWS8138’在根際內(nèi)外土壤氨基酸的總含量均高于‘Beta176’，氨基酸是甜菜根系分泌物的重要成分，‘KWS8138’根系比較發(fā)達(dá)，其根系分泌物的產(chǎn)生量大于‘Beta176’。2個品種對于根際內(nèi)外各氨基酸比例影響有所差異，如表4所示。

表4 2個品種根際內(nèi)外各氨基酸占比 %

氮高效品種‘KWS8138’根際外土壤中的Ser、Tyr、Ala、Gly、Arg的占比都比氮低效品種‘Beta176’占比高。

氮高效品種‘KWS8138’根際內(nèi)土壤中的Tyr、Ala、Arg的占比都比氮低效品種‘Beta176’占比高。而Ser、Gly比氮低效品種‘Beta176’占比低。

3 結(jié)論與討論

作為土壤有機(jī)氮的重要組成部分，氨基酸在土壤氮素循環(huán)和作物營養(yǎng)供應(yīng)過程中都有著重要功能。但土壤的施肥措施、水熱條件、耕作作用等各種因素都會影響土壤中氨基酸濃度[15-19]。ALLEN等[2]用示蹤法調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，施氮后，土壤腐殖質(zhì)中氨基酸氮所占全氮比例明顯增加。李世清[6]研究發(fā)現(xiàn)，施肥對土壤氨基酸含量有極顯著影響。王巖等[3]的研究結(jié)果表明,殘余化學(xué)氮肥有部分轉(zhuǎn)變?yōu)榘被岬?。張旭東等[4]的研究結(jié)果則指出，有機(jī)肥料也可明顯提高土壤中氨基酸氮的含量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，施用氮肥可以提高土壤中氨基酸含量。原因是在作物（甜菜）-土壤體系中，作為底肥施入氮肥后，部分無機(jī)氮素被作物吸收，部分可能形成固定態(tài)銨也可能被微生物利用生成氨基酸以及其他代謝產(chǎn)物積累在土壤中[20-23]，因此施氮處理的土壤比未施氮處理氨基酸總量高。而高出最多的是中性氨基酸(91.56 mg/kg)，其次是堿性氨基酸(14.73 mg/kg)，再次是酸性氨基酸(5.83 mg/kg)，含硫氨基酸(5.23 mg/kg)。其中Thr、Gly、Ala、Pro、Val、Leu、Lys、Ser含量提高幅度較大，皆大于50 mg/kg。甜菜幼苗時期，任何處理的土壤氨基酸含量在都很低，隨著甜菜葉叢的快速生長，氨基酸含量大幅度增加，施氮和未施氮土壤的氨基酸含量持續(xù)增長，而后的塊根糖分積累時期，施氮處理土壤的氨基酸含量依然比未施氮處理高。這與胡曉航[24]，研究中氨基酸態(tài)氮在甜菜生長過程中的動態(tài)變化結(jié)論相似。此現(xiàn)象與甜菜根系分泌物的產(chǎn)生與根系對有機(jī)氮的礦化有關(guān)[27,38]。作物吸收氨基酸的種類不同，加之不同種類的氨基酸與土壤礦物陽離子交換能力不同致其可利用性不同，導(dǎo)致中性、堿性、酸性和含硫氨基酸在土壤中的變化規(guī)律有差異。由于蛋白質(zhì)須解聚成氨基酸才能被植物和微生物利用，所以氨基酸的吸附能力顯著影響其生物有效性，吸附作用越強(qiáng)烈，氨基酸的生物可利用性越低。VINOLAS等[25]研究發(fā)現(xiàn)，Lys可以與土壤陽離子復(fù)合體發(fā)生交換反應(yīng)，而Gly和Glu的這種能力較弱，即Lys與土壤基質(zhì)的吸附能力強(qiáng)于Gly和Glu，從而使Gly和Glu的生物利用性強(qiáng)于Lys。本試驗(yàn)在葉叢快速生長期和塊根糖分積累期甜菜需氮旺盛時期，Glu和Gly有明顯降低，而Lys并無明顯變化再次驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。

對于甜菜品種對氨基酸的影響，目前有研究表明：有機(jī)氮高效品種‘KWS8138’的氨基酸態(tài)氮的含量高于低效品種‘Beta176’，低于無苗對照[11]。原因是品種‘KWS8138’的根系比品種‘Beta176’更發(fā)達(dá)，能產(chǎn)生更多的根系分秘物，影響微生物群落的生長，促進(jìn)土壤中的有機(jī)氮礦化。從而品種‘KWS8138’比品種‘Beta176’根際土壤中能礦化出更多的氨基酸態(tài)氮[11]。其中表現(xiàn)最明顯的是Glu，在甜菜整個生長季，‘KWS8138’品種對Glu的礦化量平均比‘Beta176’品種多出107 mg/kg。甜菜在苗期、塊根糖分積累期、收獲期時，‘KWS8138’品種根際土壤氨基酸總量高于‘Beta176’品種，只有在葉叢快速生長期時，‘KWS8138’品種根際土壤氨基酸總量低于‘Beta176’品種。這或許是由于甜菜在葉叢快速生長期生長快速，需氮量大，而氨基酸態(tài)氮為甜菜作物的根系可以直接吸收利用的氮素營養(yǎng)，被直接吸收利用。

所取樣本中根際土壤是距離活體根系表面1～2 mm以內(nèi)的土壤和根表面及其黏附的土壤，是在網(wǎng)袋內(nèi)收集，而非根際土是指網(wǎng)袋外的土壤。在無施肥土壤條件下，所測根際內(nèi)外土壤各氨基酸占比對比。甜菜生長對根際土壤氨基酸占比影響較顯著，對根際外土壤氨基酸影響并不顯著。這應(yīng)該與作物的根系養(yǎng)分輸送特征有關(guān)。作物通過細(xì)的根毛細(xì)胞吸收生長所需營養(yǎng)元素[26]。而甜菜根系幾乎都在網(wǎng)袋內(nèi)，只有極少量根系能穿過網(wǎng)袋伸入網(wǎng)袋外的非根際土中。所以網(wǎng)袋內(nèi)根際土中的氨基酸易被甜菜根際吸收，而網(wǎng)袋外的氨基酸只能通過滲透作用進(jìn)入網(wǎng)袋被甜菜吸收利用,或被微生物利用。根際內(nèi)土壤中Ser、Ala、Arg、Tyr和Gly的占比隨著甜菜生長不斷改變，這與甜菜根系分泌物的產(chǎn)生[27]、礦化作用和甜菜生長過程中會吸收氨基酸為氮源以供生長有關(guān)[28-31]。而根際外土壤中，Ser、Ala、Arg呈一直下降趨勢，而根際內(nèi)這3種氨基酸也是呈下降趨勢的，可能是由于甜菜生長對這3種氨基酸需求量大，或這3種通過礦化作用轉(zhuǎn)化成無機(jī)氮或其他形式的氮素供應(yīng)植物和微生物的需求[32-38]。根際內(nèi)土壤中的這3種氨基酸被利用后，根際外土壤由于滲透作用對這3種氨基酸進(jìn)行補(bǔ)充，從而造成根際外土壤這3種氨基酸含量下降。

有研究表明：有機(jī)氮吸收高效的品種‘KWS8138’根際土壤中的氨基酸含量均高于低效品種‘Beta176’，這是由于‘KWS8138’根系比較發(fā)達(dá)，其根際的根系分秘物會大量產(chǎn)生，通過化感作用，影響微生物群落的生長，這一交互作用可促進(jìn)土壤中的有機(jī)氮礦化[39]。所以根際外無根直接接觸的土壤里由于滲透作用，根際土中氨基酸滲透到根際外土壤。導(dǎo)致氮高效品種‘KWS8138’根際外土壤中的Ser、Tyr、Ala、Gly、Arg的占比都比氮低效品種‘Beta176’占比高。而Ser、Gly比氮低效品種‘Beta176’占比低，可能是由于這兩種氨基酸被甜菜吸收利用，或通過礦化作用轉(zhuǎn)化成無機(jī)氮或其他形式的氮素，而被消耗了。

綜上所述，土壤中的氨基酸氮具有生物可利用性，而氨基酸氮又是土壤有機(jī)氮礦化后的主要產(chǎn)物，甜菜根系可產(chǎn)生根系分泌物，氨基酸是根系分泌物的重要成分。從而在甜菜生長期間其含量不斷發(fā)生動態(tài)變化?？傮w來說，甜菜4個時期中總氨基酸含量隨甜菜生長呈上升趨勢，但各氨基酸的礦化量與生物可利用性不同，加之作物吸收氨基酸的種類不同，所以各種氨基酸的變化上又存在著差異。4個時期中施肥處理的土壤與未施肥土壤相比，施肥處理的土壤中氨基酸氮總量高于未施肥處理。其中高出增幅最大的是中性氨基酸。施氮肥增加了土壤氨基酸氮的含量，從而提高了土壤持續(xù)供氮能力。氮高效品種‘KWS8138’對氨基酸的礦化量高于氮低效品種‘Beta176’，根際土壤氨基酸占比受到甜菜生長的顯著影響，根際外土壤氨基酸變化并不顯著。根際土壤氨基酸含量變化大于根際外土壤。