瘦素在肥胖小鼠支氣管哮喘模型中的作用研究

夏元旦，徐英，杜曉梅，沈美珠，肖春海，周敏

1.上海市金山區(qū)眾仁老年護(hù)理醫(yī)院內(nèi)科，上海 201501；2.上海市第六人民醫(yī)院金山分院呼吸科，上海 201599

肥胖已成為全球公共衛(wèi)生危機(jī)，估計(jì)到2030年，全世界約38%的成年人口將超重，另有約20%的人肥胖［1］，且隨著人口老齡化愈發(fā)嚴(yán)重，老年人肥胖人數(shù)呈上升趨勢［2］。中國是全球受影響人數(shù)最多的國家，約46%的成年人和15%的兒童肥胖或超重［3］。肥胖可伴隨各系統(tǒng)疾病，在呼吸系統(tǒng)疾病中，肥胖被認(rèn)為是支氣管哮喘（簡稱哮喘）發(fā)生的高危因素，肥胖型哮喘被認(rèn)為是一種重要的特殊臨床類型［4］，肥胖可能導(dǎo)致嚴(yán)重的哮喘，降低哮喘控制率，降低類固醇反應(yīng)，導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素抵抗。越來越多的證據(jù)證明，肥胖型哮喘的發(fā)病環(huán)節(jié)不同于經(jīng)典的過敏性哮喘，推測可能與非過敏機(jī)制相關(guān)［5］，但其機(jī)制尚未明確。本研究通過建立肥胖型哮喘小鼠模型，研究瘦素在肥胖型哮喘中是否通過氧化應(yīng)激機(jī)制而發(fā)揮促炎作用，為肥胖型哮喘發(fā)病機(jī)制及干預(yù)治療提供新的思路，也可使老齡化下老年肥胖人群受益。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

6～8 周齡C57BL/6J 健康、雌性小鼠48 只，SPF級（購自上海西普爾—必凱實(shí)驗(yàn)動物公司）。所有小鼠飼養(yǎng)于恒溫（25 ℃）環(huán)境，標(biāo)準(zhǔn)無卵蛋白飼料，自由取水，12 h 晝夜。實(shí)驗(yàn)開始前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

1.2 主要設(shè)備與試劑

超聲霧化器（上海魚躍公司，型號402AI）；高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf 公司，型號508 型）；熒光定量PCR 儀（美國ABI，型號7500 型）；半干轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad 公司，型號Trans-Blot SD）；全自動酶標(biāo)儀（美國賽默飛，型號Multiskan MS）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司，型號BX43）。卵清蛋白（ovalbumin，OVA）（美國Sigma 公司）；TRIzol 試劑（美國Invitrogen 公司）；TAKARA RR047A 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒（大連寶生物TaKaRa 公司）；小鼠瘦素、SOD、MDA、IL-6 和TNF-α ELISA 試劑盒（上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司）。

1.3 動物分組及肥胖小鼠哮喘模型的建立

將小鼠隨機(jī)分成4 組，每組小鼠12 只：A 組為肥胖哮喘組：高脂飼料＋OVA 致敏激發(fā)組；B 組為肥胖組：高脂飼料＋生理鹽水（NS）替代致敏激發(fā)；C 組為哮喘組：普通飼料＋OVA 致敏激發(fā)組；D 組為正常對照組：普通飼料＋NS 替代致敏激發(fā)。分別用不含致敏原的普通飼料（碳水化合物60%、蛋白質(zhì)22%、脂肪10%、纖維素和其他成分8%）和不含致敏原的60%高脂肥胖模型飼料［酪蛋白（casein） 267 g/kg，糊精（maltodextrin） 157 g/kg，蔗糖（sucrose） 89 g/kg，豆油（soybean oil） 33 g/kg，豬油（lard） 301 g/kg，纖維素（cellulose） 67 g/kg，礦物質(zhì)（mineral mix，m1020） 66 g/kg，維生素（vitamin mix，V1010） 13 g/kg，L—胱氨酸（L-Cystine） 4 g/kg，酒石酸膽堿（choline bitartrate）3 g/kg，TBHQ 0.067 g/kg，合計(jì)1 000 g/kg，其中蛋白質(zhì)19.4%、糖水化合物20.6%、脂肪60.0%。飼料熱量5.0 kcal/g，其中糖熱量7%。膽固醇水平：217 mg/kg］進(jìn)行喂養(yǎng)。各組小鼠分籠飼養(yǎng)，自由攝食和取水。至第12 周時淘汰A 組和B 組中不滿足肥胖標(biāo)準(zhǔn)的小鼠，肥胖標(biāo)準(zhǔn)為體質(zhì)量較普通飼料喂養(yǎng)平均體質(zhì)量高出20%以上，A 組有2 只、B 組有3 只小鼠不符合肥胖標(biāo)準(zhǔn)被淘汰。然后對A 組和C 組采用卵清蛋白（OVA）致敏并激發(fā)C57BL/6J 小鼠，對B 組和D 組采用NS代替OVA 致敏激發(fā)，致敏和激發(fā)過程中無小鼠死亡。

1.4 小鼠標(biāo)本采集及切片HE 染色

4 組小鼠成模后24 h 在10%戊巴比妥鈉麻醉情況下進(jìn)行解剖，留取外周血，并進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，留取支氣管肺泡灌洗液（BALF），以3 000 r/min 離心15 min，取上清液置于－80 ℃冰箱保存；小鼠肺組織置RNA 保存液中；切取小鼠1/2 左肺，用4%甲醛固定24 h 后制備石蠟切片，再予HE 染色。

1.5 qPCR 方法檢測小鼠肺組織中瘦素基因的表達(dá)

取RNA 保存液中肺組織，液氮研磨成粉末后加入1 mL TRIzol 試劑裂解，按標(biāo)準(zhǔn)步驟提取標(biāo)本總RNA并檢測濃度，之后逆轉(zhuǎn)錄，標(biāo)準(zhǔn)逆轉(zhuǎn)錄體系20 μL，反應(yīng)條件：37 ℃30 min，85 ℃5 s。引物調(diào)試后進(jìn)行qPCR。瘦素引物序列：正向引物5′-CCCCGCACCGCTGGAAGTA-3′，反向引物5′-GTGCCCTGAAATGCGGTATGTAAA-3′；GAPDH 為內(nèi)參基因，引物序列為：正向引物5′-ACGGCAAATTCAACGGCACAGTCA-3′、反向引物5′-TGGGGGCATCGGCAGAAGG-3′；95 ℃變性3 min，之后進(jìn)行40 個循環(huán)的擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95 ℃，30 s；65 ℃，30 s；72 ℃，30 s，之后以qPCR 分析程序分析擴(kuò)增相對定量結(jié)果。

1.6 小鼠外周血清及BALF 上清中脂肪因子及氧化應(yīng)激、炎癥因子的檢測

使用ELISA 方法檢測小鼠外周血清及BALF 上清中脂肪因子及氧化應(yīng)激、炎癥因子，按照ELISA 試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行，用酶標(biāo)儀測定后計(jì)算各組外周血清及BALF 上清中瘦素、SOD、MDA、IL-6 和TNF-α 水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)與方差齊性檢驗(yàn)后，正態(tài)分布且方差齊性的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4 組小鼠肺組織HE 染色結(jié)果

相較對照組B 組和D 組，可見觀A 組及C 組存在氣道壁增厚、氣道平滑肌增生，細(xì)支氣管管壁黏膜下及周圍炎性細(xì)胞浸潤。見圖1。

圖1 4 組小鼠肺組織形態(tài)學(xué)觀察（HE×200）

2.2 4 組肺組織瘦素基因的表達(dá)

與正常對照組對比，肥胖哮喘組、肥胖組、哮喘組3 組小鼠瘦素mRNA 的表達(dá)量均增加，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01），且肥胖哮喘組的表達(dá)量高于哮喘組及肥胖組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其他各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 4 組小鼠肺組織瘦素mRNA 表達(dá)比較

2.3 4 組小鼠BALF 上清及外周血清中脂肪因子及氧化應(yīng)激、炎癥因子水平

與正常對照組對比，肥胖哮喘組、肥胖組、哮喘組3 組小鼠BALF 上清及外周血清中瘦素、MDA、IL-6和TNF-α 水平均增加，而SOD 水平降低，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）；肥胖哮喘組BALF 上清及外周血清中瘦素、MDA、IL-6 和TNF-α水平高于哮喘組及肥胖組，SOD 水平低于哮喘組及肥胖組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）；其他各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 4 組BALF 上清及外周血清中脂肪因子及氧化應(yīng)激、炎癥因子的含量比較（±s）

表2 4 組BALF 上清及外周血清中脂肪因子及氧化應(yīng)激、炎癥因子的含量比較（±s）

注：A、B、C 與D 比較，△P＜0.05、▲P＜0.01；A 與B、C 比較，*P＜0.05、＃P＜0.01。

瘦素（ng/mL） SOD （U/L） MDA （mmol/mL） IL-6 （pg/mL） TNF-α（pg/mL）組別BALF 外周血 BALF 外周血 BALF 外周血 BALF 外周血 BALF 外周血A （n＝10） 5.74±1.70▲* 4.60±1.32▲* 4.22±1.14▲* 3.05±0.71▲* 5.99±1.67▲* 5.56±1.58▲* 58.45±21.43▲*66.67±28.81▲*29.05±3.94▲* 30.85±10.06▲＃B （n＝9） 4.19±0.54▲ 3.14±0.82△ 7.10±2.04▲ 4.06±0.89▲ 4.01±0.72▲ 4.09±0.69▲ 31.32±4.96▲ 47.50±16.42▲ 24.10±6.38▲ 16.05±2.95▲C （n＝12） 4.09±1.10△ 3.16±0.75△ 6.88±3.69▲ 4.70±1.85▲ 4.01±1.41▲ 3.65±0.63▲ 39.74±6.70▲ 40.99±8.75▲ 19.74±3.36▲ 17.55±2.74▲D （n＝12） 3.35±0.56 2.52±0.61 16.40±5.02 7.92±2.34 2.51±0.70 2.41±0.63 22.71±3.06 26.80±3.96 15.82±2.63 12.71±2.57

3 討論

自2006年提出“哮喘控制”的概念及經(jīng)過近年來哮喘規(guī)范化治療在全國范圍內(nèi)的廣泛推廣，中國哮喘患者的控制率明顯提高，但由于哮喘發(fā)病率隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展不降反升［6］，加上中國較大的人口基數(shù)，死亡率位居全球第一，高達(dá)36.7/10 萬［7］，哮喘目前仍是嚴(yán)重危害人民健康的重要的慢性氣道疾病之一；哮喘也是新型冠狀病毒肺炎流行期間的重點(diǎn)管理疾病之一［8］，哮喘的良好控制可以最大程度地降低新冠重癥風(fēng)險。作為一種復(fù)雜的異質(zhì)性疾病有不同的臨床表型是哮喘難以控制的主要原因，2014年全球哮喘防治倡議（GINA）指南已將肥胖型哮喘作為一種新的哮喘表型［4］。研究表明，肥胖人群哮喘發(fā)病率高于正常體質(zhì)量人群，無性別差異；且肥胖型哮喘與非特異性哮喘相關(guān)［9-10］。肥胖型哮喘臨床上突出的表現(xiàn)是存在糖皮質(zhì)激素抵抗現(xiàn)象，故表現(xiàn)為難治性哮喘，且易發(fā)展為重癥哮喘［5］。在哮喘的發(fā)病機(jī)制中目前普遍認(rèn)為Th2 相對亢進(jìn)的Th1/Th2 細(xì)胞失衡學(xué)說［11］占主導(dǎo)地位，但研究發(fā)現(xiàn)肥胖型哮喘并沒有通過一貫的Th2 介導(dǎo)的炎癥途徑來影響哮喘，其機(jī)制還需要進(jìn)一步的探討。

本研究通過動物模型模擬肥胖型哮喘，以單純肥胖、非肥胖型哮喘、非肥胖小鼠3 組小鼠作為對照，探討肥胖發(fā)生中起重要作用的重要脂肪因子瘦素在肥胖型哮喘中是否起到關(guān)鍵作用。瘦素是肥胖基因的產(chǎn)物，是重要的脂肪因子，不僅對機(jī)體進(jìn)行脂肪代謝調(diào)節(jié)而且在體內(nèi)參與多種代謝調(diào)節(jié)。近年，瘦素在肥胖型哮喘的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮的作用也受到關(guān)注，認(rèn)為與哮喘存在著密切的聯(lián)系，除了調(diào)節(jié)攝食活動和能量代謝作用外，有研究認(rèn)為它還是一種促炎因子，可以增加炎性反應(yīng)作用［12-13］；瘦素水平與肺功能和臨床嚴(yán)重程度呈正比，是肥胖型哮喘患者的重要危險因素［14］。瘦素通過哪些途徑加重了肥胖型哮喘的氣道炎癥反應(yīng)是值得進(jìn)一步關(guān)注的問題。本研究結(jié)果顯示，瘦素不僅在肥胖組小鼠肺組織中的表達(dá)高于正常對照組，而且在哮喘組肺組織中有高表達(dá)，且以肥胖哮喘組中的高表達(dá)最為明顯，高于哮喘組及單純肥胖組；在小鼠外周血清及BALF 上清中，瘦素蛋白水平的變化呈現(xiàn)出和瘦素核酸在肺組織中表達(dá)的一致性變化；與瘦素相關(guān)的氧化應(yīng)激因子MDA 及促炎因子IL-6 和TNF-α 在小鼠外周血清及BALF 上清中也呈現(xiàn)出和瘦素一致的變化，而SOD 呈現(xiàn)相反的變化。SOD 和MDA 是重要的氧化應(yīng)激指標(biāo)，MDA 的升高和SOD 的降低可反映細(xì)胞受氧化損傷的程度，而IL-6 和TNF-α 是與氧化應(yīng)激相關(guān)的促炎細(xì)胞因子，研究初步證實(shí)瘦素在肥胖型哮喘中可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激而發(fā)揮促炎作用，為肥胖型哮喘發(fā)病機(jī)制及干預(yù)治療提供新的思路。但深層機(jī)制如瘦素是否通過某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路增加超氧陰離子自由基的生成，降低超氧化物歧化酶的活性而起到促炎作用有待于進(jìn)一步深化研究。