張守一 綜述；曾宇 審閱（中國醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 泌尿外科，遼寧 沈陽 110042）

1998 年BRINKMANN 等[1]通過表達序列標簽（Expressed Sequence Tag，EST）數(shù)據(jù)庫分析篩選出一類在前列腺和胎盤中高表達黑色素瘤抗原/G 抗原（melanoma antigen/G antigen，MAGE/GAGE）蛋白的家族成員，并將其命名為前列腺相關(guān)基因（prostate?associated gene，PAGE），其成員PAGE4 是一種具有前列腺組織特異性的癌/睪丸抗原（cancer?testis antigen，CTA），也是一種內(nèi)在無序蛋白（intrinsically disorder protein，IDP）[2]。CTA 是在腫瘤中表達的一大類與腫瘤相關(guān)的免疫原性抗原，其表達高度局限于成熟睪丸組織和胎盤滋養(yǎng)細胞。從廣義上說，CTA根據(jù)其染色體位置不同，主要可分為位于X染色體上的CT?X抗原和位于常染色體上的非CT?X抗原兩類。其中，CT?X 抗原占所有CTA 的一半以上，且其在多種癌癥組織中異常表達[3]。IDP是一類缺乏固定空間結(jié)構(gòu)的內(nèi)在無序蛋白，在人體中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用，如通過蛋白質(zhì)?蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和信號傳遞，且常與癌癥等疾病的發(fā)展有關(guān)。IDP在許多生物學(xué)過程中經(jīng)歷從無序到有序的轉(zhuǎn)變，這種現(xiàn)象被稱為耦合折疊和結(jié)合，以此來履行其功能[4]。

作為一種IDP，PAGE4在人體發(fā)育過程中的表達是動態(tài)變化的，其在正常成人前列腺組織中的表達水平較低，但在良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）、前列腺癌和前列腺增殖性炎性萎縮（proliferative inflammatory atrophy，PIA）等發(fā)生損傷的上皮細胞中均為高表達，提示PAGE4 具有潛在的應(yīng)激反應(yīng)特性，參與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。前列腺癌組織中PAGE4的轉(zhuǎn)錄水平與腫瘤根治術(shù)后的生物學(xué)復(fù)發(fā)呈負相關(guān)，但在不同Gleason評分的前列腺癌組織標本中，PAGE4 的表達水平存在差異[5]。因此，作為一種與前列腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的抗原，PAGE4 在前列腺癌的預(yù)后、診療方面具有潛在的臨床應(yīng)用價值。本文將結(jié)合本課題組多年來有關(guān)PAGE4 的研究工作，針對PAGE4 在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其在前列腺癌診療中的潛在應(yīng)用價值加以歸納總結(jié)。

1 PAGE4對前列腺癌細胞的應(yīng)激保護和抗凋亡作用

PAGE4 具有保護細胞免受應(yīng)激損害的功能[6]。本實驗室的前期研究[7]表明，過表達PAGE4通過獨立增加p21 蛋白水平的方式來保護癌細胞免受各種應(yīng)激損害（如葡萄糖剝奪、TNF?α 或化學(xué)藥物作用等）。眾所周知，p21是一種細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，可結(jié)合并抑制CDK2 或CDK4 的活性。p21 作為p53 的下游因子，與p53 共同構(gòu)成G1 細胞周期檢查站，當有DNA 損傷時可抑制DNA 復(fù)制并增強修復(fù)，從而阻止細胞周期進程。因此，在前列腺癌組織中PAGE4的高表達有助于提高前列腺癌細胞抗應(yīng)激與抗凋亡的能力。

氧化應(yīng)激被認為是與前列腺癌進展相關(guān)的病理驅(qū)動信號[8]。ROS可誘導(dǎo)細胞DNA損傷，增加DNA突變的風(fēng)險，從而導(dǎo)致癌基因激活并促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9?10]；同時，輕度的氧化應(yīng)激也可通過誘導(dǎo)過早的細胞衰老從而促進腫瘤的發(fā)生[11]。本課題組前期研究[12]發(fā)現(xiàn)，一旦細胞內(nèi)產(chǎn)生ROS，過表達的PAGE4將不足以抑制ROS誘導(dǎo)的細胞氧化應(yīng)激，促使PAGE4向線粒體轉(zhuǎn)運增加以抑制ROS的產(chǎn)生，而p21在細胞損傷之前就阻滯了細胞周期，從而使細胞耐受氧化應(yīng)激。PAGE4在氧化應(yīng)激下對細胞的保護機制通過減弱JNK的磷酸化來減少細胞凋亡，并增強ERK的磷酸化促進細胞存活。實驗結(jié)果表明，高表達PAGE4的前列腺癌細胞可耐受氧化應(yīng)激，其機制可能通過調(diào)節(jié)MAPK的通路，使PAGE4在ROS刺激下表達升高。

2 PAGE4 對雄激素受體（androgen receptor，AR）活性和前列腺癌表型的影響

在應(yīng)激反應(yīng)過程中，c?Jun蛋白也是這一過程的重要組成部分，它與Fos蛋白家族形成異二聚體，產(chǎn)生激活蛋白?1（activating protein?1，AP?1）。應(yīng)激反應(yīng)激酶同源結(jié)構(gòu)域相互作用蛋白激酶1（homeodomian?ineractingproteinkinases，HIPK1）作為細胞應(yīng)激反應(yīng)中的另一個重要角色，磷酸化PAGE4第9位絲氨酸和第51 位蘇氨酸的兩個殘基，形成雙重磷酸化的PAGE4（HIPK1?PAGE4），激活c?Jun[13]，進而促進PAGE4與AP?1轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的相互作用，增強AP?1活性[14]。此外，PAGE4還可被CDC樣激酶2（CDC?like kinase 2，CLK2）磷酸化[15]。與HIPK1相反，CLK2也是一種雙重特異性激酶，它對PAGE4的過度磷酸化減弱了c?Jun的反式激活[16]，進而降低AP?1活性[14]。AR的異常激活在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中至關(guān)重要，并且前列腺癌上皮細胞PAGE4表達水平與未用激素的去勢抵抗型前列腺癌（castration?resistant prostate cancer，CRPC）中AR激活狀態(tài)呈負相關(guān)[17]。研究[17]表明，PAGE4可能通過減弱AR磷酸化和隨后的轉(zhuǎn)錄活性。HIPK1?PAGE4激活c?Jun可抑制AR活性，導(dǎo)致AR對CLK2的抑制作用減弱；CLK2的水平增高反而會促進PAGE4過度磷酸化為CLK2?PAGE4，從而減弱c?Jun的激活。他們間的這些作用關(guān)系相互形成了如圖1所示的負反饋回路[15]。

PAGE4的磷酸化構(gòu)象在前列腺癌表型方面有著明顯的差異，而這種構(gòu)象差異是由于磷酸化后PAGE4的N端和中央酸性區(qū)域之間的N端環(huán)狀結(jié)構(gòu)缺失所造成的。野生型PAGE4（wild type?PAGE4,WT?PAGE4）和HIPK1?PAGE4 的N 端都有過量的堿性殘基，使得N端很容易與周圍的中央酸性區(qū)域相互作用，形成N端環(huán)狀結(jié)構(gòu)，因而HIPK1?PAGE4呈現(xiàn)出一種相對緊湊的構(gòu)象。相反，若是PAGE4 的N 端在高磷酸化時被中和，則導(dǎo)致N端環(huán)狀結(jié)構(gòu)不能形成，最終成為一種松散的構(gòu)象，即CLK2?PAGE4（CLK2過度磷酸化的PAGE4）。因此，PAGE4的N端有無環(huán)狀結(jié)構(gòu)是造成兩種構(gòu)象差異的主要原因，并且導(dǎo)致其復(fù)合物與AP?1親和力不同[14]。CLK2?PAGE4在雄激素依賴型前列腺癌細胞中表達，而HIPK1?PAGE4在雄激素依賴型和非雄激素依賴型前列腺癌細胞中均有表達[15]。PAGE4 的這種構(gòu)象變化可能有助于前列腺癌細胞對雄激素依賴表型的動態(tài)改變，從而影響靶向治療的效果[14]。

3 PAGE4抑制前列腺癌的侵襲性

關(guān)于PAGE4 與前列腺癌侵襲性的問題，本課題組前期研究[18]發(fā)現(xiàn)，PAGE4在間質(zhì)細胞中高表達明顯抑制了前列腺癌細胞的侵襲能力，其機制為PAGE4干擾了癌細胞和間質(zhì)細胞之間的信號傳遞，其中包括間質(zhì)細胞的遷移減少以及減弱間質(zhì)細胞對TNF?α及TGF?β的反應(yīng)，可能的原因是前列腺內(nèi)不同癌灶的腫瘤相關(guān)成纖維細胞（cancer associated fibroblast，CAF）之間存在時空異質(zhì)性，而高表達PAGE4的CAF可能會抑制前列腺癌的侵襲性。同時，高表達PAGE4的前列腺癌細胞其上皮鈣黏素的表達上調(diào)[18]。而下調(diào)上皮鈣黏素的表達將促進腫瘤細胞侵襲和擴散[19?21]。有研究[22]也證實，在前列腺癌EMT 進程中，其上皮鈣黏素的表達水平降低，標志著前列腺癌細胞侵襲和擴散的能力提高。

此外，PAGE4 在人體內(nèi)是一種組織特異性的Wnt 信號通路抑制劑。Wnt/β?catenin 信號通路是胚胎發(fā)育過程中有關(guān)細胞增殖、細胞極性、細胞遷移及細胞結(jié)局并維持組織動態(tài)平衡的重要通路之一[23]。Wnt 信號通路作為晚期前列腺癌的關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[24?26]，其通過調(diào)節(jié)AR來促進前列腺癌干細胞增殖、成骨細胞轉(zhuǎn)移以及對抗雄激素治療[27?29]，尤其在CRPC 中，β?catenin 的水平 顯著增 加[30]。而表達PAGE4 的前列腺癌細胞通過抑制端錨聚合酶（tankyrase）來實現(xiàn)對自分泌途徑Wnt 信號通路的抑制以提供一個特殊微環(huán)境優(yōu)勢去維持Wnt 信號旁分泌通路（圖2）[31]。在前列腺癌中，Wnt 信號自分泌通路受到PAGE4 的組織特異性抑制，這一過程可能進一步影響前列腺癌的發(fā)展。

4 PAGE4與前列腺癌治療

由于高免疫原性和在成熟組織中的限制性表達，CTA被認為是潛在的腫瘤特異性診斷標記物和免疫治療靶點[17,32]。PAGE4作為一種CTA，在前列腺癌診療方面也同樣被寄予期望。其中，PAGE4免疫原性肽可能成為一種前列腺癌免疫治療的新方法。這種方法利用PAGE4的免疫原性，先合成PAGE4免疫原性肽，用以致敏活化從患者血液分離出來的樹突狀細胞，待其培養(yǎng)成熟、擴增后再回輸患者體內(nèi)，以激發(fā)針對前列腺癌PAGE4抗原的腫瘤免疫應(yīng)答[33]。另一方面，針對BPH以及低風(fēng)險、對雄激素敏感的前列腺癌，應(yīng)用小分子抑制劑抑制PAGE4表達也是一種新的治療策略[15]。此外，調(diào)節(jié)PAGE4磷酸化構(gòu)象的激酶，對不同類型的前列腺癌也是一種獨特的治療方向[16]。

5 PAGE4與前列腺癌的預(yù)后相關(guān)

以往研究[34]發(fā)現(xiàn)，CTA可作為前列腺癌根治術(shù)后生化復(fù)發(fā)的潛在預(yù)測因子。該研究將72 例Gleason評分8～10分的臨床樣本進行中位數(shù)為2年的隨訪，其中有43 例在前列腺癌根治術(shù)后發(fā)生生化復(fù)發(fā)（PSA≥0.2 ng/mL），進一步分析顯示，在復(fù)發(fā)的病例中僅有PAGE4 下調(diào)，而其他CTA 均為上調(diào)，且PAGE4的升高與無生化復(fù)發(fā)時長呈正相關(guān)。結(jié)果表明，在前列腺癌根治術(shù)后的患者中PAGE4 表達下降預(yù)示著生化復(fù)發(fā)的風(fēng)險增加。另一項研究[17]也表明，局部晚期梗阻性前列腺癌經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)后總生存率與前列腺癌細胞PAGE4 的表達水平呈正相關(guān)。激素敏感型前列腺癌患者中位生存期為8.2年，而PAGE4 表達陰性/低水平腫瘤患者的中位生存期僅為3.1 年，且經(jīng)多變量分析顯示，高表達PAGE4 的前列腺癌患者術(shù)后生存率較高。綜上所述，PAGE4可能作為前列腺癌潛在的預(yù)后分子標記物，且有助于篩選出預(yù)后較差的前列腺癌患者。

6 展 望

PAGE4在前列腺病變前期通過應(yīng)激引起的磷酸化反應(yīng)可降低AR 活性，進而阻止前列腺癌的發(fā)生，而在前列腺癌發(fā)展進程中，PAGE4 的高表達又有助于前列腺癌細胞的生存，說明PAGE4 可能在腫瘤的不同階段發(fā)揮不同的作用，這種現(xiàn)象背后的機制值得進一步去探尋?？梢钥紤]將PAGE4用于輔助PSA對前列腺癌進行診斷，甚至可以預(yù)測疾病的變化情況。此外，考慮到PAGE4 與根治性前列腺癌切除術(shù)后的生存率之間的相關(guān)性，甚至可以設(shè)想開發(fā)一種微創(chuàng)檢測技術(shù)來識別“好”（非轉(zhuǎn)移/雄激素依賴型疾?。┖汀皦摹保ㄞD(zhuǎn)移/非雄激素依賴型疾病）的前列腺癌。針對PAGE4不同磷酸化形式的單克隆抗體可以作為一種新的工具來預(yù)測疾病預(yù)后[35]。總之，PAGE4在前列腺癌診療方面有良好的應(yīng)用前景。