解娜

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院心內科，河南 新鄉(xiāng) 453003)

冠狀動脈硬化性心臟病是臨床常見的疾病類型之一，由于血脂血糖代謝紊亂導致灌注血管內皮慢性損傷而形成脂質斑塊從而導致缺血缺氧性心臟疾病的發(fā)生，目前臨床主要采用介入或支架手術恢復血流再灌注，但易造成再灌注損傷〔1～4〕。但關于缺血再灌注損傷的病理生理機制尚未完全闡明。木蝴蝶具有清肺利咽、抗炎、抗氧化等作用〔5〕。程序性細胞死亡因子(PDCD)5屬于促細胞凋亡基因，其在心肌細胞損傷等過程中發(fā)揮重要調控作用〔6〕。因此，本研究采用過氧化氫(H2O2)處理心肌細胞建立細胞損傷模型，探討木蝴蝶總黃酮對H2O2誘導的心肌細胞增殖、凋亡及氧化應激的影響，探究其對PDCD5的調控作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 木蝴蝶(成都曼思特生物科技有限公司)；大鼠心肌細胞H9C2(美國ATCC公司)；H2O2(國藥集團化學試劑有限公司)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所)；Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司)；pcDNA3.1(北京科展生物科技有限公司)；甲基噻唑基四唑(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)凋亡試劑盒(美國Sigma公司)；兔抗鼠含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(PDCD)5抗體(美國Abam公司)；兔抗鼠谷半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)3、caspase9抗體(美國Santa Cruz公司)；辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗(武漢艾美捷科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1實驗分組 木蝴蝶總黃酮提取〔7〕：精確稱量木蝴蝶粉末100 g，置于70%乙醇內浸潤30 min，應用超聲提取5 min(溫度6℃，200 W)，轉移至回流裝置內30 min，反復提取3次，收集提取液，應用旋轉式蒸發(fā)器回收乙醇，減壓濃縮(15 ml)，轉移至蒸發(fā)皿內，經過冷凍及干燥后得到黃酮類化合物，黃酮類化合物重量為5.65 g，提取率為6.65%，含量為18.35%。將總黃酮溶解于DMSO(0.1%)溶液內，制備木蝴蝶總黃酮母液，調整溶液濃度為10 mg/ml。取對數生長期心肌細胞接種于96孔板，設置control組(加入空白DMEM培養(yǎng)基)、model組(加入含有濃度為200 μmol/L H2O2的DMEM培養(yǎng)基處理24 h)〔8〕、experiment1組(加入含有濃度為2 μg/ml的木蝴蝶總黃酮與濃度為200 μmol/L H2O2的DMEM培養(yǎng)基處理24 h)、experiment2組(加入含有濃度為4 μg/ml的木蝴蝶總黃酮與濃度為200 μmol/L H2O2的DMEM培養(yǎng)基處理24 h)、experiment3組(加入含有濃度為8 μg/ml的木蝴蝶總黃酮與濃度為200 μmol/L H2O2的DMEM培養(yǎng)基處理24 h)〔9〕。后續(xù)實驗設置pcDNA3.1組(pcDNA3.1轉染至心肌細胞，加入含有濃度為200 μmol/L H2O2的DMEM培養(yǎng)基處理24 h)、pcDNA3.1-PDCD5組(pcDNA3.1-PDCD5轉染至心肌細胞，加入含有濃度為200 μmol/L H2O2的DMEM培養(yǎng)基處理24 h)、experiment3+pcDNA3.1組(pcDNA3.1轉染至心肌細胞，加入含有濃度為8 μg/ml的木蝴蝶總黃酮與濃度為200 μmol/L H2O2的DMEM培養(yǎng)基處理24 h)、experiment3+pcDNA3.1-PDCD5組(pcDNA3.1-PDCD5轉染至心肌細胞，加入含有濃度為8 μg/ml的木蝴蝶總黃酮與濃度為200 μmol/L H2O2的DMEM培養(yǎng)基處理24 h)。

1.2.2MTT檢測細胞增殖 1×103個心肌細胞接種于96孔板，分別加入MTT溶液20 μl(5 mg/ml)，室溫孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μl DMSO，室溫振蕩孵育10 min，應用酶標儀檢測波長為490 nm處的吸光度值(OD)。

1.2.3流式細胞術檢測細胞凋亡率 收集各組心肌細胞1×105個經3 000 r/min離心6 min后棄上清，預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌兩次，棄上清，加入500 μl結合緩沖液重懸細胞，收集細胞沉淀，向細胞沉淀中依次加入5 μl膜聯蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)與5 μl碘化丙啶(PI)，室溫振蕩孵育10 min，應用FACS Calibur流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.2.4檢測MDA含量及SOD、GSH-Px活性 收集各組細胞培養(yǎng)上清液，參照試劑盒說明書檢測各組MDA含量及SOD、GSH-Px活性，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.5Western印跡檢測caspase3、caspase9、PDCD5蛋白表達 收集各組心肌細胞后加入500 μl RIPA裂解液提取細胞總蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉膜，封閉，加入caspase3(1∶1 000)、caspase9(1∶1 000)、PDCD5(1∶800)與內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗稀釋液(1∶1 000)，4℃孵育過夜，TBST洗滌，加入二抗稀釋液(1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌，應用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1木蝴蝶總黃酮對H2O2處理的H9C2的細胞活性的影響 與control組比較，model組心肌細胞活力顯著降低(P<0.05)；與model組比較，experiment2組、experiment3組心肌細胞活力顯著升高(P<0.05)，且experiment2組、experiment3組心肌細胞活力比較差異有統計學意義(P<0.05)，而experiment1組心肌細胞活力與model組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 木蝴蝶總黃酮對H2O2處理的H9C2細胞活性、凋亡及MDA含量、SOD、GSH-Px活性的影響

2.2木蝴蝶總黃酮對H2O2處理的H9C2凋亡及PDCD5表達的影響 與control組比較，model組心肌細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，caspase3、caspase9、PDCD5蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與model組比較，experiment2組、experiment3組心肌細胞凋亡率及caspase3、caspase9、PDCD5蛋白水平顯著降低(P<0.05)，且experiment2組、experiment3組心肌細胞凋亡率與caspase3、caspase9、PDCD5蛋白水平比較差異均有統計學意義(P<0.05)，而experiment1組心肌細胞凋亡率、caspase3、caspase9、PDCD5蛋白水平與model組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1、圖1、圖2。

2.3木蝴蝶總黃酮對H2O2處理的H9C2中MDA、SOD、GSH-Px的影響 與control組比較，model組MDA的活性顯著升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px的活性顯著降低(P<0.05)；與model組比較，experiment2組、experiment3組MDA的含量顯著降低(P<0.05)，SOD、GSH-Px的含量顯著升高(P<0.05)，且experiment2組、experiment3組MDA含量及SOD、GSH-Px活性比較差異均具有統計學意義(P<0.05)，而experiment1組MDA含量及SOD、GSH-Px活性與model組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

圖1 木蝴蝶總黃酮對H2O2處理的H9C2凋亡的影響

1～5：control組，model組，experiment1組，experiment2組，experiment3組圖2 木蝴蝶總黃酮對H2O2處理的H9C2 凋亡PDCD5、caspase3、caspase9蛋白表達的影響

2.4PDCD5對H2O2處理的H9C2的細胞活性及凋亡的影響 與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-PDC-D5組細胞活力顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率及caspase3、caspase9蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見圖3、表2。

2.5PDCD5對H2O2處理的H9C2中MDA、SOD、GSH-Px的影響 與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-PDCD5組MDA的含量顯著升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px的活性顯著降低(P<0.05)，見表2。

2.6PDCD5能逆轉木蝴蝶總黃酮對H2O2處理的H9C2的細胞活性及凋亡的影響 與experiment3+pcDNA3.1組比較，experiment3+pcDNA3.1-PDCD5組細胞活力顯著降低(P<0.05)，細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，caspase3、caspase9蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見圖4、表3。

圖3 PDCD5對H2O2處理的H9C2凋亡(A)及PDCD5、caspase3、caspase9(B)蛋白表達的影響

表2 PDCD5對H2O2處理的H9C2的細胞活性、凋亡及MDA含量、SOD、GSH-Px活性的影響

2.7PDCD5能逆轉木蝴蝶總黃酮對H2O2處理的H9C2中MDA、SOD、GSH-Px的影響 與experiment3+pcDNA3.1組比較，experiment3+pcDNA3.1-PDCD5組MDA的含量顯著升高(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)，見表3。

1～2：experiment3+pcDNA3.1組，experiment3+pcDNA3.1-PDCD5組圖4 PDCD5能逆轉木蝴蝶總黃酮對H2O2處理的H9C2凋亡(A)及PDCD5、caspase3、caspase9(B)蛋白表達

表3 PDCD5能逆轉木蝴蝶總黃酮對H2O2處理的H9C2的細胞活性、凋亡及MDA含量、SOD、GSH-Px活性的影響

3 討 論

心血管疾病已成為威脅人類生命安全的重要疾病之一，其具有發(fā)病率高及死亡率高等特點，既往研究顯示葒草花中的黃酮等有效成分可減輕H2O2誘導的心肌細胞氧化損傷及抑制細胞凋亡；山楂有機酸中的黃酮類物質、有機酸等可抑制心肌細胞氧化應激反應；參芎葡萄糖注射液可抑制H2O2誘導的心肌細胞凋亡及氧化應激〔10～12〕。但木蝴蝶的黃酮類提取物對H2O2誘導H9C2損傷的分子機制尚未闡明。

木蝴蝶醇提取物可減輕心肌微血管內皮細胞氧化型低密度脂蛋白氧化損傷〔13〕。研究顯示從中藥中提取的黃酮類化合物具有抗氧化作用，其中木蝴蝶總黃酮具有極強的清除氧自由基能力，還可對抗氧化應激反應，其可能作為治療心血管等疾病的藥物〔14，15〕。本研究結果顯示H2O2處理條件下，木蝴蝶總黃酮可促使心肌細胞活力顯著升高，在一定程度上呈劑量依賴效應，提示木蝴蝶總黃酮可促進H2O2誘導的心肌細胞增殖。心血管疾病發(fā)生過程中心肌細胞凋亡率顯著增加，caspase3、caspase9被激活后可誘導細胞凋亡〔16〕。本研究結果顯示H2O2處理條件下，木蝴蝶總黃酮可減弱心肌細胞凋亡能力及抑制caspase3、caspase9表達。氧化自由基生成量增加時細胞膜中的飽和脂肪酸可發(fā)生脂質過氧化從而生成MDA，若MDA的含量升高可反映心肌細胞過氧化損傷程度，SOD屬于抗氧化酶類，還可還原生成H2O2進而被GSH-Px催化還原生成水及氧氣從而減輕過氧化損傷〔17〕。本研究結果顯示H2O2處理條件下，木蝴蝶總黃酮可降低MDA的含量而增高SOD、GSH-Px活性。

PDCD5在心肌梗死等心血管系統疾病中表達上調，沉默PDCD5表達可抑制缺氧/復氧誘導的心肌細胞凋亡及自噬從而保護心肌細胞〔18〕。沉默PDCD5表達可抑制腫瘤壞死因子(TNF)-α誘導的關節(jié)軟骨細胞凋亡從而減輕細胞損傷〔19〕。抑制PDCD5的表達可抑制心肌細胞凋亡〔20〕。本研究結果顯示H2O2處理后心肌細胞中PDCD5蛋白水平升高，而木蝴蝶總黃酮處理后心肌細胞中PDCD5蛋白水平降低，PDCD5過表達可抑制H2O2誘導的心肌細胞增殖及促進細胞凋亡，還可提高氧化應激水平進而降低木蝴蝶總黃酮對H2O2誘導的心肌細胞損傷的作用。提示木蝴蝶總黃酮可能通過下調PDCD5的表達從而減輕H2O2誘導的心肌細胞損傷。

綜上，木蝴蝶總黃酮可促進H2O2誘導的心肌細胞增殖及抑制細胞凋亡，并可抑制心肌細胞氧化應激反應從而對心肌細胞發(fā)揮保護作用，其作用機制可能與抑制PDCD5的表達有關，可為木蝴蝶總黃酮在心血管疾病中的治療提供實驗基礎。