基于酰腙鍵的去氫樅酸基聚乙二醇的合成及膠束的藥物緩釋性能

陳柯穎，莫相全，于文華，鄺李涵，李光華，朱園勤

（廣西大學化學化工學院廣西石化資源加工及過程強化技術重點實驗室，廣西南寧 530004）

人體正常生理環(huán)境的pH 值為7.4，而腫瘤組織的細胞外pH 值約為6.5～7.0[1]，核內體和溶酶體的pH 值分別為5.5～6.0 和4.5～5.0[2]，因此，pH-響應聚合物作為抗腫瘤藥物的載體廣泛被研究[3～5]。在弱酸性條件下，釋放抗癌藥物（如DOX，CPT，PTX 等）的pH-響應聚合物主要分為3 類。第1 類是兩親性嵌段共聚物的疏水嵌段鍵合叔胺、咪唑基團等[6,7]。第2類是聚合物-藥物綴合物，藥物一般通過酰腙鍵[5,8,9]、縮醛[10]、原酸酯[11]、硼酸酯[12]等酸性可水解的化學鍵連接到聚合物上，其中利用酰腙鍵將藥物鍵接到聚合物的抗腫瘤藥物輸送體系的研究報道最多[5,13,14]。但這類藥物輸送體系要求藥物分子必須含有醛基或酮基。第3 類是由pH-響應化學鍵分別將親水端和疏水端連接的兩親性聚合物，藥物通過物理方式包載到聚合物膠束的核中，這類抗腫瘤藥物輸送體系對藥物的化學結構沒有特殊的要求，但是目前研究報道較少。He 等[15]通過含端醛基聚苯乙烯（PSCHO）和端基含酰肼基團的聚乙二醇單甲醚的縮合反應合成了基于酰腙鍵的兩親性動態(tài)共聚物（PS-r-PEG），并考察了包載甲基卟啉的PS-r-PEG 膠束在pH=4.0 的釋放性能；結果表明，甲基卟啉隨時間逐步釋放，9 h 的累積釋放率為80%。

酰腙鍵是動態(tài)共價鍵的一種，是由熱力學控制并能發(fā)生可逆的斷裂和形成[5,16,17]，它在中性和堿性條件下是穩(wěn)定的，但在酸性條件下逐步水解，斷裂形成原來的酰肼和醛或酮，并且酸性條件下，pH 值越小水解速率越快[18]，因此廣泛應用于藥物輸送載體的合成。對于物理包載抗癌藥物的聚合物膠束而言，膠束的大小要小于100 nm，以便能內吞到腫瘤細胞中[19]，同時膠束要有高的動力學穩(wěn)定性，以防止在體內循環(huán)過程中較少或不釋放藥物，減少對其他組織的損傷[20]。為此，筆者設計合成了基于酰腙鍵的去氫樅酸基聚乙二醇兩親性聚合物。一方面去氫樅酸結構龐大、具有很強的疏水性，可以提高膠束的動力學穩(wěn)定性，同時還具有抑菌、抗腫瘤、抗病毒等生物活性[21,22]；另一方面，在PEG 的端部引入苯甲醛基團，通過苯環(huán)的疏水性來保護C=N 鍵的C 原子，減緩酸性條件下酰腙鍵的水解。

本文首先將去氫樅酸依次與SOCl2、水合肼(NH2NH2·H2O)反應合成了去氫樅酸酰肼(DHACONHNH2)；再 用mPEG-OH 和HO-PEG-OH 分 別 與對醛基苯甲酸反應合成2 種含有端醛基的聚乙二醇。然后，用DHA-CONHNH2分別與2 種含有端醛基的聚乙二醇進行縮合反應制備了2 種基于酰腙鍵的去氫樅酸基聚乙二醇。在此基礎上制備了其聚合物膠束和載DOX 的膠束，并考察和研究了膠束的特性和藥物緩釋性能。

1 實驗部分

1.1 原料及試劑

去氫樅酸（DHA）：純度98.8%，從歧化松香中提??；聚乙二醇單甲醚（mPEG1900-OH，Mn=1900）、聚乙二醇（HO-PEG2000-OH，Mn=2000）、二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）、水合肼、三乙胺和鹽酸阿霉素（98%）：分析純，均購自上海阿拉丁生化科技有限公司；4-甲?；郊姿幔?-CBA）：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；二甲基亞砜（DMSO）、苯、二氯甲烷、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、冰醋酸：分析純，均購自廣東光華科技股份有限公司；四氫呋喃（THF）、二氯亞砜（SOCl2）、濃鹽酸（36%～38%）：分析純，購自麥克林化學試劑有限公司；異丙醇、甲醇、無水乙醚、無水乙醇：分析純，成都市科隆化學有限公司；N, N-二甲基甲酰胺（DMF）：分析純，上海申博化工有限公司。

1.2 單-和雙-苯甲醛基聚乙二醇（mPEG1900-CHO 和OHC-PEG2000-CHO）的合成

根據參考文獻[23,24]進行合成，反應式如Fig.1 所示。mPEG1900-OH 的合成步驟：先將5.00 g (2.6 mmol) mPEG1900-OH 放入真空烘箱（其中放有適量無水P2O5）在50 ℃干燥24 h。然后將mPEG1900-OH，0.2500 g(2.0 mmol)DMAP 和30 mL 二氯甲烷依次加入到150 mL 三口燒瓶中，攪拌溶解，再加入溶有4-CBA（2.6250 g, 17.5 mmol）的40 mL THF 溶液。在氮氣保護下，把溶有DCC（2.1000 g, 10 mmol）的30 mL THF 溶液慢慢滴入燒瓶，滴畢，升溫至40 ℃反應24 h。抽濾除去不溶物，再使用旋轉蒸發(fā)儀移出溶劑，析出的固體再溶于適量異丙醇/甲醇的混合溶劑（體積比4:1）中，冷凍2～3 h，抽濾，沉淀物用冷無水乙醚沖洗，收集沉淀物并干燥。產物為白色固體，產 率 為80.3% 。 mPEG1900-CHO 的1H—NMR(CDCl3, 600 MHz)：δ10.15(s,—CHO),δ8.23(d,2H),δ7.96(d,2H),δ3.6(m, CH2of PEG),δ3.4(s, CH3),δ3.8(m, O—CH2—C—COO—Ph),δ4.5(m, O—C—CH2—COO—Ph)；FT-IR (v,cm-1)：2886(C—H), 1720，1698(C=O), 1276，1110(C—O)。OHC-PEG2000-CHO 的1HNMR (CDCl3, 600 MHz)：δ10.15(s,—CHO),δ8.23(d,2H),δ7.98(d,2H),δ3.6(m, CH2of PEG),δ3.8(m, O—CH2—C—COO—Ph),δ4.5(m, O—C—CH2—COO—Ph )；FT-IR(v,cm-1)：2878(C—H), 1720，1698(C=O),1273，1109(C—O)。

Fig.1 Syntheses of mPEG1900-CHO and OHC-PEG2000-CHO

1.3 去氫樅酸酰肼（DHA-CONHNH2）的合成

DHA-CONHNH2的合成按參考文獻[25]進行，合成路線如Fig. 2 所示。稱取4.00 g 去氫樅酸（0.013 mol）溶于30 mL 的苯中，滴入2～3 滴DMF，在N2保護下，將SOCl2（2.9 mL, 0.04 mol）和5 mL 苯的混合液緩慢滴入其中，滴畢，升溫至75 ℃回流3 h。旋轉蒸發(fā)儀移除溶劑，得到紅棕色的去氫樅酸酰氯液體，將此液體溶于20 mL 的二氯甲烷，并置于冰水浴中冷卻待用。將7 mL 水合肼（0.14 mol）和2 mL三乙胺加入盛有30 mL 二氯甲烷的燒瓶中，在N2保護下，將新制的去氫樅酸酰氯-二氯甲烷溶液按每秒3～4 滴的速度滴入其中，滴畢，在室溫下反應1.5～2 h，TLC 監(jiān)測反應進程。反應完畢，向其中加入20 mL 蒸餾水，充分混合，用二氯甲烷萃?。?×40 mL）水層，合并有機相。再使用飽和食鹽水（3×50 mL）洗滌有機相，旋干二氯甲烷。析出的固體用90%乙醇（無水乙醇和水的體積比9:1）重結晶，得到白色去氫樅酸酰肼，產率為72.7%。1H-NMR (DMSO-d6,600 MHz)：δ1.0～1.2 (d, 12H,C15-H, C16-H, C18-H,C19-H),δ1.28～2.32 (m, 9H, C2-H, C3-H, C4-H, C6-H,C10-H),δ2.60～2.85 (m, 3H, C9-H, C17-H),δ4.13～4.25(brs, 2H, NH2),δ6.8～7.20 (m, 3H, C14-H, C12-H, C11-H),δ8.86 (s, 1H, CONH)。FT-IR(v,cm-1)：3307(N—H),2935(C—H), 1632(C=O), 1494(苯環(huán)C—H)。

Fig.2 Synthetic route of DHA-CONHNH2

1.4 基于酰腙鍵的去氫樅酸基聚乙二醇的合成

將DHA-CONHNH2與mPEG1900-CHO（或OHCPEG2000-CHO）加入圓底燒瓶中（n(DHA-CONHNH2):n(mPEG1900-CHO) = 1.1:1，n(DHA-CONHNH2):n(OHCPEG2000-CHO) = 2.1:1），再加入8 mL 無水乙醇，滴入1～2 滴冰醋酸，然后升溫至75 ℃，回流24 h。反應完畢，用旋轉蒸發(fā)儀移除一部分溶劑，剩余溶液分散于冷無水乙醚中，靜置沉淀、抽濾，并真空干燥24 h。 mPEG1900-hyd-DHA 為白色固體，收率為82.1%；PEG2000-(-hyd-DHA)2為白色固體，收率為81.7%。化學反應式如Fig.3。

1.5 聚合物膠束和載藥膠束的制備

1.5.1 聚合物膠束的制備：準確稱取mPEG1900-hyd-DHA（或PEG2000-(-hyd-DHA)2）20.0 mg，溶解于20 mL的DMF中，然后將溶液倒入透析袋（MD34-1.0，截留分子量為1000）中，并將透析袋放入去離子水中進行透析，每6 h換1次水，透析3 d，即可得到聚合物膠束。

1.5.2 載藥膠束的制備：準確稱取mPEG1900-hyd-DHA（或PEG2000-(-hyd-DHA)2）20.0 mg 和鹽酸阿霉素5.0 mg，溶于10 mL DMSO 中，再加入20 mL 的三乙胺，攪拌4 h。然后將此溶液裝入透析袋中，并使用大量去離子水透析，每2 h 換1 次水，透析24 h，再使用尼龍-6微孔濾膜（0.45m）進行過濾，即可得到載藥膠束。

1.6 測試與表征

1.6.1 結構和形貌表征：聚合物的結構采用Nicolet iS50 FT-IR 光譜儀（賽默飛世爾科技公司）進行測定。將待測樣品溶于適量二氯甲烷，然后取1～2 滴溶液滴到空白KBr 壓片上，烘干溶劑，測定波數范圍400～4000 cm-1。樣 品 的1H-NMR 采 用ADVACE AV 600 MHz 核磁共振波譜儀（瑞士Bruker 公司）測定，溶劑為CDCl3或DMSO-d6。膠束溶液的紫外-可見光吸收光譜采用上海精密科學有限公司L6S 型紫外-可見分光光度計（UV-Vis）測定，燈切換波長為320 nm，掃描波長范圍200～600 nm。膠束的形貌采用Tecnal G2 F320 S-TWIN/X-MAX80 透射電鏡（TEM）觀察，工作電壓為200 kV。

1.6.2 膠束尺寸大小測定：使用瑞士LS Instruments公司的LSI-3DLS 進行測定，測試條件為激光波長

632.8 nm、散射角90o、測試溫度297.5 K。

1.6.3 臨界膠束濃度（CMC）的測定：取一定量聚合物膠束溶液，然后稀釋成2.5×10-2g/L，1.25×10-2g/L，6.25×10-3g/L，3.15×10-3g/L，1.58×10-3g/L，7.88×10-4g/L，3.94×10-4g/L，1.97×10-4g/L，9.84×10-5g/L 系列濃度的溶液，然后以空白去離子水作為背景，使用UVVis 測定不同濃度樣品的紫外-可見光吸收光譜。以最大吸收波長303 nm 處的吸光度（A）對樣品濃度的對數（lgC）作圖，由拐點處切線的交點計算CMC。

1.6.4 藥物DOX 的包封率和載藥量的測定：（1）標準濃度曲線的繪制：先配置20 mg/L，15 mg/L，10 mg/L，8 mg/L，6 mg/L，4 mg/L，2 mg/L，1 mg/L 的系列鹽酸阿霉素水溶液，以空白去離子水作背景，使用UV-Vis 測各溶液的吸收光譜，并以最大吸收波長480 nm 處的吸光度（A）對鹽酸阿霉素濃度作圖，得到標準濃度曲線。

本文采用UV-Vis 測定藥物的包封率（DLE）與載藥量（DLC）。取一定量已制備好的載藥膠束溶液，稀釋，并向其中滴入2 滴濃鹽酸，超聲20 min 用以破壞膠束，然后測480 nm 處的吸光度，根據鹽酸阿霉素的標準濃度曲線，可計算出藥物的包封率與載藥量。計算公式如式（1）、式（2）

式中：m0——投入的藥物總質量；m1——包載的藥物質量；m2——投入的聚合物質量

1.6.5 藥物DOX 的緩釋性能：先配制0.1 mol/L 的磷酸二氫鈉溶液和0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液，使用pH計分別配制pH = 5.0 和pH = 7.4 的磷酸鹽緩沖溶液。取15 mL 載藥膠束溶液裝入透析袋中，并分別浸泡于50 mL 的pH = 5.0 和pH = 7.4 的磷酸鹽緩沖溶液中，振蕩攪拌，每隔一段時間取4 mL 溶液，用UV-Vis 測定480 nm 處的吸光度。每次取完溶液再補充4 mL 新鮮的磷酸鹽緩沖溶液。根據標準濃度曲線，使用式（3）計算pH = 5.0 和pH = 7.4 時的藥物DOX 的累積釋放率（CR%）[26]

式中：Cn和Cn-1——第n次和第n－1 次取出緩沖溶液中DOX 的濃度；m0——裝入透析袋的載藥膠束中藥物的總質量。

2 結果與討論

2.1 去氫樅酸基聚乙二醇的合成

在75℃下，DHA-CONHNH2分別與mPEG1900-CHO，OHC-PEG2000-CHO 反應得到2 種基于酰腙鍵的去氫樅酸基聚乙二醇mPEG1900-hyd-DHA 和PEG2000-(-hyd-DHA)2，如Fig.3。

Fig.3 Synthesis of mPEG1900-hyd-DHA and PEG2000-(-hyd-DHA)2

Fig.4 給出了mPEG1900-hyd-DHA 和PEG2000-(-hyd-DHA)2的紅外光譜圖。從圖中可以看出，2 條譜線除了峰的相對強度略有不同之外，峰的位置都一樣：1698 cm-1處醛基的羰基峰和1632 cm-1處酰肼基團的羰基峰消失，而在1678 cm-1處出現了酰腙基團的羰基吸收峰，1541 cm-1處出現了酰腙鍵上C=N 雙鍵的吸收峰；3307 cm-1處酰肼基團的N—H 鍵尖的吸收峰消失，而在3430 cm-1處出現了酰腙鍵上N—H 鍵的寬吸收峰。

Fig.4 FT-IR spectra of mPEG1900-hyd-DHA and PEG2000-(-hyd-DHA)2

mPEG1900-hyd-DHA 和PEG2000-(-hyd-DHA)2的1HNMR 譜圖如Fig.5 所示。從譜圖中可以看出，2 條譜線除了峰的相對強度略有不同之外，峰的位置都一樣。去氫樅酸酰肼基團的N—H（δ8.86）峰、NH2（δ4.13～4.25）峰和苯甲醛基聚乙二醇的—CHO 的氫峰（δ10.15）均消失，而在δ8.4（c）和11.2（d）處分別出現了酰腙鍵N—H 鍵上質子的吸收峰和—CH=N—上質子的吸收峰。從FT-IR 和1H-NMR 結果說明，mPEG1900-hyd-DHA和PEG2000-(-hyd-DHA)2被成功合成。

Fig.51H-NMR spectra of (a)mPEG1900-hyd-DHA and(b)PEG2000-(-hyd-DHA)2

2.2 膠束的制備及臨界膠束濃度

本研究采用透析法制備了兩親性聚合物膠束，并用DLS 和TEM 測定和觀測了膠束的大小和形貌，如Fig.6 和Fig.7 所示。

Fig.6 Size distribution of mPEG1900-hyd-DHA, PEG2000-(-hyd-DHA)2 and their DOX-loaded micelles

Fig.7 TEM images of (a)mPEG1900-hyd-DHA and (b) PEG2000-(-hyd-DHA)2 micelles

從Fig.6 和Fig.7 中可以看出，所制備的膠束粒徑大小比較均勻，且呈球狀；mPEG1900-hyd-DHA 和PEG2000-(-hyd-DHA)2膠束粒徑分別為46 nm 和78 nm，與TEM 所觀測的膠束大小基本吻合，有差異主要是因為TEM 是干態(tài)下測定，而DLS 是溶液狀態(tài)下測定。在PEG 的相對分子質量相近的情況下，雙去氫樅酸基聚乙二醇的膠束粒徑大于單去氫樅酸基聚合物，這可能是雙去氫樅酸基聚乙二醇兩親性聚合物在形成膠束過程中，更多的疏水且體積龐大的DHA 分子被包裹在膠束內部之緣故。

膠束的CMC 值的測定方法有多種，如紫外-可見分光光度計法、熒光探針法、表面張力法等[27]。當兩親性聚合物水溶液的濃度很低時，聚合物鏈可自由伸展，此時未形成膠束，紫外吸收光譜的吸光度很低；而當濃度升高到CMC 以上時，疏水性DHA逐步聚集而形成膠束。比起膠束形成前的兩親性聚合物水溶液，膠束的存在使紫外光譜的吸光度將會顯著增強，且在mPEG1900-hyd-DHA 和PEG2000-(-hyd-DHA)2結構中的酰腙鍵與苯環(huán)共軛，紫外吸收明顯，因此本文用紫外-可見分光光度計法測定了CMC值。從Fig.8 可以看出，mPEG1900-hyd-DHA 和PEG2000-(-hyd-DHA)2的CMC 值 分 別 為0.0055 g/L 和0.0034 g/L，即在PEG 的相對分子質量相近的情況下，雙去氫樅酸基聚乙二醇的CMC 明顯小于單去氫樅酸基聚乙二醇。這說明疏水的DHA 比例的增加，CMC 值變小，也說明雙去氫樅酸基聚乙二醇形成膠束需要較少的分子數。另一方面，2 種去氫樅酸基聚乙二醇的CMC 值都很小，在正常生理環(huán)境中，膠束不容易被破壞。

Fig.8 Plots of the absorbance (A) vs. lgC for(a) mPEG1900-hyd-DHA and(b) PEG2000-(-hyd-DHA)2

2.3 載藥膠束的制備

載藥膠束的制備方法可分為化學方法和物理方法?；瘜W方法是將預載藥物鍵合到聚合物上，然后再制備成膠束；而物理方法則是利用π-π堆積作用、氫鍵以及疏水作用等將藥物包封于膠束內。與化學方法相比，物理方法則相對容易，不需特定的聚合物或藥物結構，也不涉及化學反應及后處理等繁瑣步驟。

載DOX 的載藥膠束的粒徑分布如Fig.6 所示。從圖中可以看出，載DOX 膠束的粒徑大于空白膠束，其中mPEG1900-hyd-DHA 的載藥膠束粒徑增加明顯，說明其包封的DOX 量比PEG2000-(-hyd-DHA)2膠束更多。

Tab.1 給出了聚合物膠束的DOX 包封率和載藥量。從表中可以看出，mPEG1900-hyd-DHA 的DOX 包封率和載藥量均高于PEG2000-(-hyd-DHA)2，這一結果與DLS 結果相符。一般兩親性聚合物的典型載藥量為百分之幾到20%左右[22]，但是本文中的去氫樅酸基聚乙二醇膠束的載藥量相對少，尤其是PEG2000-(-hyd-DHA)2。在PEG2000-(-hyd-DHA)2的載藥膠束的制備過程中，發(fā)現部分DOX 會聚集并沉積在透析袋底部。這可能是因為其聚合物分子的兩端具有疏水基團，所以膠束中的分子與溶液中的分子之間交換（要克服兩端DHA 的疏水相互作用）比mPEG1900-hyd-DHA 慢，使得疏水性藥物不能及時進入到膠束的核之緣故。

Tab. 1 DOX encapsulation rate and drug load of polymer micelles

2.4 藥物DOX 的緩釋性能

將已制備好的PEG2000-(-hyd-DHA)2載藥膠束裝入透析袋，然后分別浸入pH=5.0 和pH=7.4 緩沖液中，每隔一段時間取透析袋外的緩沖液，測定其紫外吸收光譜，并利用阿霉素的標準濃度曲線和累積釋放公式計算藥物的累積釋放率，并對時間作圖，如Fig.9 所示。從圖中可以看出，藥物的累計釋放率在12 h 前較快，后來趨于變慢，48 h 時的累積釋放率分別為49.5%（pH=5.0）和20.3%（pH=7.4），說明酰腙鍵處于酸性環(huán)境時，酰腙鍵逐步發(fā)生水解，導致藥物從膠束核內部釋放出來。pH=7.4 時，累積釋放率與通過酰腙鍵鍵接的PEO-g-DOX 膠束差不多[18]；pH=5.0 時，48 h 時的累積釋放率均低于PEO-g-DOX（PEO-g-DOX2.9為80%，PEO-g-DOX3.6為68%）[18]，這說明只要合理設計兩親性聚合物結構，物理包載藥物的膠束并不一定比化學鍵合藥物的膠束釋放速率快。本文合成的去氫樅酸基聚乙二醇具有生物相容性，去氫樅酸還具有抑菌、抗腫瘤、抗病毒等生物活性，且在弱酸性條件下緩慢釋放藥物，因此作為抗癌藥物的載體有潛在的應用前景。

Fig.9 pH-dependent release of DOX-loaded PEG2000-(-hyd-DHA)2 micelles

3 結論

從去氫樅酸(DHA)出發(fā)合成了去氫樅酸酰肼(DHA-CONHNH2)；用mPEG-OH 和HO-PEG-OH 分別與對醛基苯甲酸反應合成了含有端醛基的聚乙二醇；后者分別與DHA-CONHNH2進行縮合反應，合成了2 種基于酰腙鍵的去氫樅酸基聚乙二醇（mPEG1900- hyd- DHA 和 PEG2000- (- hyd- DHA)2）。mPEG1900-hyd-DHA 和PEG2000-(-hyd-DHA)2的膠束都呈球形，平均粒徑分別為46 nm 和78 nm，CMC 值分別為5.5 mg/L 和3.4 mg/L。 mPEG1900-hyd-DHA 膠束對DOX 的包封率和載藥量大于PEG2000-(-hyd-DHA)2膠束；PEG2000-(-hyd-DHA)2載藥膠束在pH=5.0 和pH=7.4時，經48 h 的DOX 的累積釋放率分別為49.5%和20.3%。因此，合成聚合物對抗癌藥物有緩釋作用，具有潛在的應用前景。