轉(zhuǎn)基因康乃馨Moonlite品系檢測(cè)用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)樣品研制

楊茹夢(mèng)，尹 璐，錢昌元，左翠花，于海燕，*，李 想，*

(1.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué) 香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418； 2.上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，上海 200135)

康乃馨()，又名香石竹，是重要的切花品種之一，也是我國(guó)目前產(chǎn)量最大的花卉。康乃馨素凈高雅，散發(fā)著淡淡芳香，是多種場(chǎng)合的首選花卉，在許多國(guó)家都具有象征意義，受人們的喜愛(ài)程度僅在玫瑰之下，并且是母親節(jié)的官方花卉?？的塑暗孽r切花在國(guó)內(nèi)外的需求量都很高，不僅用于盆栽觀賞，同時(shí)還可以從花朵中提取香精作為化妝品原料。根據(jù)海關(guān)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)花卉進(jìn)出口量一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，2016和2017年我國(guó)每年康乃馨種苗和鮮切花進(jìn)出口貿(mào)易總額均達(dá)100多萬(wàn)美元，2019年我國(guó)康乃馨出口到日本、韓國(guó)等地共計(jì)721.4萬(wàn)株，總價(jià)值已達(dá)112.1萬(wàn)美元。

在過(guò)去十幾年中，全球利用現(xiàn)代生物技術(shù)培育康乃馨新品種的研究開(kāi)展得較為廣泛，并在改良花色、延長(zhǎng)花期、耐除草劑等方面取得了成功。根據(jù)國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications，ISAAA)的數(shù)據(jù)顯示，截至2020年底，國(guó)際上已有19個(gè)轉(zhuǎn)基因康乃馨品系進(jìn)入商業(yè)化種植。轉(zhuǎn)基因康乃馨Moonlite品系由澳大利亞Florigene有限公司和日本的Suntory有限公司開(kāi)發(fā)，該品系轉(zhuǎn)入了類黃酮3′，5′-羥化酶基因(3′5′)和二氫黃酮醇4-還原酶基因()，可使花朵產(chǎn)生紫色、淡紫色或藍(lán)色。同時(shí)該品系也轉(zhuǎn)入了磺酰脲抗性基因B()，賦予了康乃馨對(duì)磺酰脲類除草劑和一系列其他乙酰乳酸合酶(ALS)抑制性除草劑的耐受性。轉(zhuǎn)基因康乃馨Moonlite品系于2004年起相繼在日本、歐盟和澳大利亞批準(zhǔn)種植。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)在培育康乃馨新品種方面已顯示出獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景，然而轉(zhuǎn)基因康乃馨同其他轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品一樣，在研發(fā)、種植和貿(mào)易中需要進(jìn)行檢測(cè)監(jiān)管，使其符合我國(guó)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法》等相關(guān)法律法規(guī)的規(guī)定。為了實(shí)現(xiàn)進(jìn)出口轉(zhuǎn)基因康乃馨的有效監(jiān)管，建立檢測(cè)方法、研制檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品十分必要。目前，課題組已完成了轉(zhuǎn)基因康乃馨檢測(cè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的制定，即將發(fā)布實(shí)施，但缺乏與該標(biāo)準(zhǔn)配套的轉(zhuǎn)基因康乃馨檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)樣品是具有一種或多種規(guī)定特性足夠均勻且穩(wěn)定的材料，已被確定其符合測(cè)量過(guò)程的預(yù)期用途。轉(zhuǎn)基因檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)品是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)中不可或缺的物質(zhì)，是獲得可靠、準(zhǔn)確檢測(cè)結(jié)果的保證。根據(jù)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的形態(tài)特征，可將其分為3類，基體標(biāo)準(zhǔn)品、基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品。其中，質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品是一種含有內(nèi)參基因和目的基因特異性片段的重組質(zhì)粒，有成本低、純度高、均勻性好、穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。與來(lái)源于植物組織的標(biāo)準(zhǔn)品相比，質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品制備更加容易、簡(jiǎn)便，并可通過(guò)工程菌擴(kuò)繁而獲得大量純度較高的樣品，不受來(lái)源限制，極大地降低了研發(fā)和使用成本。同時(shí)，由于一個(gè)質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品中可同時(shí)包含多個(gè)檢測(cè)目標(biāo)序列，因此方便了來(lái)源復(fù)雜產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)。為此，本研究以種植量較大、上市時(shí)間最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因康乃馨Moonlite品系為研究對(duì)象，研制了質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品。對(duì)其均勻性、穩(wěn)定性等進(jìn)行測(cè)試，同時(shí)進(jìn)行特性值的測(cè)定，以期作為標(biāo)準(zhǔn)樣品用于轉(zhuǎn)基因康乃馨Moonlite品系的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)基因康乃馨Moonlite品系質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品構(gòu)建

根據(jù)康乃馨內(nèi)源基因序列(GenBank號(hào)AX023246.1)和轉(zhuǎn)基因康乃馨Moonlite品系特異性序列信息，人工合成康乃馨內(nèi)源基因1 279 bp片段和轉(zhuǎn)基因康乃馨Moonlite品系特異性序列406 bp片段。將基因片段插入pcDNA3.0質(zhì)粒Ⅰ酶切位點(diǎn)，Moonlite品系特異性片段插入質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)的dⅢ與HⅠ酶切位點(diǎn)之間，以上2個(gè)片段插入位點(diǎn)間距1 kb以上，構(gòu)建后質(zhì)粒全長(zhǎng)7 113 bp。質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品由寶生物工程(大連)有限公司合成，并且由寶生物工程(大連)有限公司和上海華大基因科技有限公司進(jìn)行全序列測(cè)定。

1.2 質(zhì)粒DNA提取和質(zhì)量控制

采用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(美國(guó)，Axygen scientific公司)提取和純化構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因康乃馨Moonlite品系質(zhì)粒DNA。采用微量分光光度計(jì)(美國(guó)，Thermo Scientific公司)測(cè)定DNA溶液的純度，/應(yīng)在1.8～2.0，/應(yīng)大于2.0。采用DNA分子熒光定量法在酶標(biāo)儀(瑞士，TECAN公司)上測(cè)定DNA濃度。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性，取1 μL DNA溶液進(jìn)行電泳檢測(cè)，使用凝膠成像儀(美國(guó)，Bio-Rad公司)進(jìn)行影像分析，評(píng)估DNA的完整性。

采用0.01×TE(1.0 mmol·LTris-HCl，0.01 mmol·LNa-EDTA·2HO，pH值8.0)將大腸埃希菌tRNA(美國(guó)，Sigma-Aldrich公司)稀釋至2 ng·μL，以2 ng·μL大腸埃希菌tRNA作為保護(hù)劑將質(zhì)粒稀釋至約6.75×10μL。稀釋后的質(zhì)粒溶液在搖床上以150 r·min10 ℃條件下混勻8 h。將混勻后的DNA溶液分裝入500個(gè)旋蓋離心管中，每管100 μL。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)反應(yīng)

采用qRT-PCR測(cè)試質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品的穩(wěn)定性和均勻性。反應(yīng)體系包括2×qPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol·L)各1 μL，探針(10 μmol·L)0.5 μL，模板2 μL，用雙蒸水將反應(yīng)體系補(bǔ)至25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?0 ℃ 2 min；預(yù)變性95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。采用的qRT-PCR儀為德國(guó)羅氏診斷有限公司LightCycler 480 II型，qPCR Master Mix購(gòu)自上海輝瑞生物技術(shù)有限公司，引物和探針由上海華大基因科技有限公司合成，序列信息見(jiàn)表1所示。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

表1 引物和探針序列信息

在質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品的穩(wěn)定性和均勻性測(cè)試中，為了測(cè)定質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度，首先分別制備康乃馨內(nèi)源基因和Moonlite品系特異性序列的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

隨機(jī)抽取3管質(zhì)粒DNA溶液，分別采用0.01×TE稀釋至6.75×10、6.75×10、6.75×10、6.75×10、67.5 μL共5個(gè)濃度梯度。采用6個(gè)濃度的質(zhì)粒DNA溶液(6.75×10、6.75×10、6.75×10、6.75×10、6.75×10、67.5 μL)，構(gòu)建康乃馨內(nèi)源基因與Moonlite品系特異性序列的標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè)濃度重復(fù)3次。標(biāo)準(zhǔn)曲線以lg(質(zhì)?？截悢?shù)濃度)為橫坐標(biāo)，以CT值為縱坐標(biāo)，同時(shí)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程，再根據(jù)線性方程計(jì)算拷貝數(shù)。

1.5 均勻性檢驗(yàn)和最小取樣量測(cè)試

采用實(shí)時(shí)qRT-PCR對(duì)質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性進(jìn)行測(cè)試。隨機(jī)選取15管質(zhì)粒DNA，分別測(cè)定康乃馨內(nèi)源基因和Moonlite品系特異性序列，每管樣品每個(gè)目標(biāo)序列測(cè)定3次，檢測(cè)樣品拷貝濃度，并采用標(biāo)準(zhǔn)JJF 1343—2012的方法進(jìn)行方差分析，評(píng)估質(zhì)粒DNA管內(nèi)和管間的均勻性。

為了測(cè)定質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品的最小取樣量，設(shè)置3個(gè)加樣量0.5 μL、1.0 μL和2.0 μL。隨機(jī)抽取3管質(zhì)粒DNA，在qRT-PCR擴(kuò)增時(shí)，每管DNA每個(gè)取樣量測(cè)定9次，共27次重復(fù)，對(duì)測(cè)定值進(jìn)行方差分析，計(jì)算得出質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品的最小取樣量。

1.6 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

為了保證質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品在運(yùn)輸過(guò)程中仍保持活性，隨機(jī)抽取12管DNA進(jìn)行短期穩(wěn)定性測(cè)試。在-20 ℃、4 ℃和26 ℃分別放3管DNA，放置1、2、3、4個(gè)星期。另外3管DNA在45 ℃高溫條件下放置1、3、7、10、14 d。采用qRT-PCR分別測(cè)定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)/溫度點(diǎn)康乃馨內(nèi)源基因和Moonlite品系特異性序列，每管樣品每個(gè)目標(biāo)序列測(cè)定3次。

為了測(cè)定質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，將質(zhì)粒DNA分別在-20 ℃和4 ℃放置1、2、3、4、6個(gè)月，每個(gè)溫度條件放置3管質(zhì)粒DNA，采用qRT-PCR在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)/溫度點(diǎn)分別測(cè)定2個(gè)目標(biāo)序列，每管樣品每個(gè)序列測(cè)定3次。

考慮到質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品在使用過(guò)程中會(huì)從保存溫度(-20 ℃)融化，使用后再次冷凍，而反復(fù)凍融可能造成質(zhì)粒DNA的降解。為此，從500管質(zhì)粒DNA中隨機(jī)抽取15管進(jìn)行反復(fù)凍融實(shí)驗(yàn)。15管DNA在-20 ℃冷凍24 h后同時(shí)取出，在冰上融化后，隨機(jī)抽取3管擴(kuò)增康乃馨內(nèi)源基因和Moonlite品系特異性序列，每管樣品每個(gè)目標(biāo)測(cè)定3次，共9次重復(fù)。然后全部放回-20 ℃冷凍24 h，重復(fù)上面的實(shí)驗(yàn)。質(zhì)粒DNA從-20 ℃拿出1次融化算凍融1次，實(shí)驗(yàn)共凍融25次。

1.7 定值

采用數(shù)字PCR方法測(cè)定質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性值。隨機(jī)抽取5管質(zhì)粒DNA，使用RⅠ限制性內(nèi)切酶(北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行酶切線性化，采用數(shù)字PCR方法分別對(duì)酶切后質(zhì)粒DNA中的基因和Moonlite品系特異性序列的拷貝數(shù)進(jìn)行測(cè)定，每管樣品每個(gè)目標(biāo)序列重復(fù)測(cè)定4次。

酶切反應(yīng)體系：10×Quickcut Buffer 5 μL，質(zhì)粒DNA 1 μL，QuickcutRⅠ 1 μL，用無(wú)菌水補(bǔ)至50 μL。37 ℃放置15 min后，4 ℃放置10 min中止反應(yīng)。

采用美國(guó)伯樂(lè)公司QX200型數(shù)字PCR系統(tǒng)進(jìn)行質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品定值。數(shù)字PCR反應(yīng)體系包括ddPCR supermix for probes(美國(guó)Bio-Rad公司)12.5 μL，上、下游引物(10 μmol·L)各1 μL，探針(10 μmol·L)0.5 μL，模板1 μL，用雙蒸水將反應(yīng)體系補(bǔ)至20 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；98 ℃ 10 min；12 ℃保存。

1.8 不確定度評(píng)估

質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品特征值的不確定度分別由標(biāo)準(zhǔn)樣品的均勻性、穩(wěn)定性和特征量值測(cè)定過(guò)程引入。通過(guò)對(duì)上述3類數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)JJF 1343—2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計(jì)學(xué)原理》的方法對(duì)質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品的特征值進(jìn)行不確定度評(píng)估。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品構(gòu)建

人工合成1 279 bp康乃馨內(nèi)源基因片段和406 bp轉(zhuǎn)基因康乃馨Moonlite品系5′端鄰接區(qū)序列片段，分別插入pcDNA3.0載體的2個(gè)酶切位點(diǎn)，2個(gè)位點(diǎn)在質(zhì)粒上距離1 kb以上，可實(shí)現(xiàn)多重PCR擴(kuò)增中片段間互不干擾。構(gòu)建后的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite示意圖如圖1-A所示，人工合成的康乃馨內(nèi)源基因片段和轉(zhuǎn)基因康乃馨Moonlite品系5′端鄰接區(qū)序列信息見(jiàn)圖1-B和圖1-C所示。將質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite DNA進(jìn)行全序列測(cè)定，與公開(kāi)發(fā)布的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果完全一致，并且質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite分別含有1拷貝的基因序列和Moonlite品系特異性序列。通過(guò)電泳檢測(cè)，質(zhì)粒DNA條帶明亮清晰，說(shuō)明提取的質(zhì)粒DNA質(zhì)量好，條帶大小與預(yù)期相符合(圖2)。pLite質(zhì)粒DNA的/為1.85±0.03，其濃度為(604.42±0.45)ng·μL，濃度和純度均符合要求。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

為了進(jìn)一步對(duì)質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品的特性和特征值進(jìn)行定量測(cè)定，首先構(gòu)建了康乃馨內(nèi)源ANS基因和Moonlite品系特異性序列2個(gè)目標(biāo)片段的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、和反應(yīng)效率E。當(dāng)以基因?yàn)閿U(kuò)增目標(biāo)時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：=-347+4083，=0.999，E為94.17%；當(dāng)以Moonlite品系特異性序列為擴(kuò)增目標(biāo)時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：=-358+4301，=0.999，E為90.25%。2條標(biāo)準(zhǔn)曲線均滿足定量PCR方法的E在90%到110%之間和應(yīng)大于0.99的要求。因此，構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較高的PCR擴(kuò)增效率和良好的線性相關(guān)性，可進(jìn)一步進(jìn)行定量測(cè)定。

A，轉(zhuǎn)基因康乃馨Moonlite品系質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite示意圖；B，插入的康乃馨內(nèi)源ANS基因序列信息；C，插入的轉(zhuǎn)基因康乃馨Moonlite品系特異性序列信息。核酸片段方向均為5′→3′。A， Schematic diagram of pLite， a plasmid DNA standard sample for GM carnation Moonlite； B， Sequence of the inserted carnation endogenous gene ANS fragment； C， Sequence of the inserted GM carnation Moonlite event-specific sequence. The direction of nucleic acid was 5′to 3′.圖1 構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因康乃馨Moonlite品系質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品示意圖和序列信息Fig.1 Schematic diagram and sequences of the constructed plasmid DNA standard sample pLite for GM carnation line Moonlite

1，未線性化質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite；2，線性化質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite。1， Unlinearized plasmid DNA standard sample pLite； 2， Linearized plasmid DNA standard sample pLite.圖2 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of plasmid DNA standard sample pLite

2.3 均勻性檢驗(yàn)

2.3.1 均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

從500管分裝后的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite中隨機(jī)抽取15管，對(duì)每個(gè)包裝單元進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定。結(jié)果表明，內(nèi)源ANS基因平均拷貝數(shù)為6.30×10μL，Moonlite品系特異性序列平均拷貝數(shù)為6.29×10μL。管內(nèi)與管間的均勻性分析結(jié)果如表2所示。ANS與Moonlite兩個(gè)目標(biāo)序列的值分別為1.61和1.14，均小于值2.04，表明變異度較小。即在95%置信水平下，標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻性良好。

2.3.2 最小取樣量測(cè)定

分別取樣0.5、1.0、2.0 μL進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如表3所示。當(dāng)取樣量為0.5 μL和1.0 μL時(shí)，基因與Moonlite品系特異性序列2個(gè)目標(biāo)片段的27次重復(fù)結(jié)果變異度較大，經(jīng)檢驗(yàn)分析結(jié)果為不均勻。當(dāng)取樣量為2.0 μL時(shí)，2個(gè)目標(biāo)序列的值均小于臨界值，表明在此取樣量下質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite呈現(xiàn)均勻狀態(tài)，此時(shí)基因與Moonlite品系特異性序列平均拷貝數(shù)均為6.30×10μL。因此，質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite的最小取樣量為2.0 μL。

2.4 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

2.4.1 短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)

質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite短期穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果如圖4-A所示。在-20、4、26 ℃，4個(gè)星期內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite濃度均在6.27×10～6.47×10μL之間變動(dòng)，標(biāo)準(zhǔn)樣品的拷貝數(shù)變化范圍很小，趨勢(shì)比較平穩(wěn)。檢驗(yàn)結(jié)果顯示，-20 ℃條件下，基因和Moonlite品系特異性序列的回歸系數(shù)絕對(duì)值|β|分別為0.001 9和0.011 0，小于對(duì)應(yīng)的s (β)臨界值0.033 0和0.042 0。4 ℃條件下2個(gè)目標(biāo)片段的|β|分別為0.018 0和0.003 5，小于對(duì)應(yīng)的臨界值0.043 0和0.064 0。26 ℃條件下2個(gè)目標(biāo)片段的|β|分別為0.019 0和0.005 3，小于對(duì)應(yīng)的臨界值0.043 0和0.056 0。上述結(jié)果說(shuō)明3個(gè)溫度條件下，4個(gè)星期以內(nèi)，質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品的拷貝數(shù)變化不顯著。因此，質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite在26 ℃及以下環(huán)境可穩(wěn)定放置4個(gè)星期，適于進(jìn)行冷鏈運(yùn)輸。

A，ANS基因；B，Moonlite品系特異性序列。A， ANS gene； B， Moonlite specific sequence.圖3 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curves of plasmid DNA standard sample pLite

表2 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite均勻性方差分析

表3 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite最小取樣量測(cè)定

2.4.2 極端溫度下穩(wěn)定性檢驗(yàn)

質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite在45 ℃高溫條件下的穩(wěn)定性結(jié)果如圖4-B所示。pLite DNA放置14 d后，基因的平均拷貝數(shù)為6.38×10μL，Moonlite品系特異性序列平均拷貝數(shù)為6.36×10μL。檢驗(yàn)結(jié)果顯示，基因和Moonlite品系特異性序列的|β|分別為0.005和0.004，小于對(duì)應(yīng)的臨界值0.012和0.015，變化不顯著。表明在45 ℃高溫條件下，14 d內(nèi)質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite拷貝數(shù)無(wú)明顯變化趨勢(shì)，因此，該標(biāo)準(zhǔn)樣品在45 ℃環(huán)境可穩(wěn)定儲(chǔ)存14 d，可以適應(yīng)運(yùn)輸過(guò)程中的短期極端高溫環(huán)境。

A，pLite在-20、4、26 ℃放置4個(gè)星期的穩(wěn)定性變化曲線；B，pLite在45 ℃放置14 d的穩(wěn)定性變化曲線。A， Stability curves of pLite under -20， 4， 26 ℃ within 4 weeks； B， Stability curves of pLite under 45 ℃ within 14 days.圖4 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite在不同溫度條件下的穩(wěn)定性變化曲線Fig.4 Stability curves of plasmid DNA standard sample pLite under different temperatures

2.4.3 長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn)

設(shè)置4 ℃和-20 ℃兩個(gè)溫度測(cè)定質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite長(zhǎng)期穩(wěn)定性。在4 ℃條件下，pLite中的基因和Moonlite品系特異性序列的拷貝數(shù)濃度分別為6.23×10～6.52×10、6.30×10～6.39×10μL；在-20 ℃條件下，2個(gè)目標(biāo)序列的拷貝數(shù)分別為6.24×10～6.45×10、6.33×10～6.46×10μL(表4)。拷貝數(shù)變化幅度很小，沒(méi)有隨著時(shí)間的變化而呈現(xiàn)顯著變化趨勢(shì)，穩(wěn)定性回歸系數(shù)絕對(duì)值|β|為0.001～0.026，小于對(duì)應(yīng)的閾值，表明質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite在4 ℃及以下溫度可穩(wěn)定儲(chǔ)存6個(gè)月。

2.4.4 反復(fù)凍融實(shí)驗(yàn)

質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite反復(fù)凍融25次后，基因和Moonlite品系特異性序列的拷貝數(shù)濃度分別為6.36×10和6.30×10μL，與未凍融前起始濃度6.40×10和6.35×10μL差異不顯著。檢驗(yàn)結(jié)果表明，在95%置信區(qū)間內(nèi)，基因和Moonlite品系特異性序列的|β|分別為0.001和0.003，小于對(duì)應(yīng)的t閾值0.004和0.005，表明標(biāo)準(zhǔn)樣品拷貝數(shù)濃度并沒(méi)有隨凍融次數(shù)增加而發(fā)生顯著性變化。因此，質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite可以反復(fù)凍融至少25次，可滿足實(shí)驗(yàn)室日常使用需要。

表4 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite長(zhǎng)期穩(wěn)定性

2.5 定值

基于數(shù)字PCR方法，對(duì)質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite的拷貝數(shù)進(jìn)行定值，內(nèi)源基因與Moonlite品系特異性序列的數(shù)字PCR一維散點(diǎn)圖如圖5所示，拷貝數(shù)濃度結(jié)果見(jiàn)表5。20次測(cè)定后，基因的平均拷貝數(shù)濃度為6.13×10μL，Moonlite品系特異性序列的平均拷貝數(shù)濃度為6.10×10μL，總標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.13和0.21，總相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.11%和3.45%，均小于25%，在可接受范圍內(nèi)。

2.6 不確定度評(píng)估

均勻性帶來(lái)的不確定度計(jì)算結(jié)果顯示，分別以基因和Moonlite品系特異性序列的測(cè)定數(shù)據(jù)計(jì)算，均為0.10。穩(wěn)定性帶來(lái)的不確定度采用-20 ℃長(zhǎng)期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果為=0.019 0，=0.009 4。定值帶來(lái)的不確定度計(jì)算結(jié)果為=0.048，=0.073。由各分量合成的合成不確定度=0.11，=0.12。計(jì)算后，擴(kuò)展不確定度為0.22×10μL，為0.24×10μL，擴(kuò)展因子為2。

A，康乃馨內(nèi)源ANS基因；B，Moonlite品系特異性序列。A， Carnation endogenous gene ANS； B， Moonlite specific sequence.圖5 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite數(shù)字PCR一維散點(diǎn)圖Fig.5 1-D scatter plot of plasmid DNA standard sample pLite by digital PCR

表5 質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite濃度的數(shù)字PCR結(jié)果

因此，質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite中康乃馨內(nèi)源基因的拷貝數(shù)參考值為(6.13±0.22)×10μL，Moonlite品系特異性序列的拷貝數(shù)參考值為(6.10±0.24)×10μL。

3 結(jié)論與討論

在醫(yī)療分子診斷、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)、食品安全監(jiān)管和生態(tài)環(huán)境安全監(jiān)測(cè)等方面，準(zhǔn)確度高、可靠性好的檢測(cè)技術(shù)和相匹配的標(biāo)準(zhǔn)品是科學(xué)、規(guī)范地進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)工作的前提，借助標(biāo)準(zhǔn)品作為質(zhì)控進(jìn)行檢測(cè)，是監(jiān)管工作具有科學(xué)性和權(quán)威性的保障。在對(duì)轉(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)樣品在檢測(cè)過(guò)程中作為陽(yáng)性對(duì)照必不可少；在對(duì)轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行定量分析時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)樣品是構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線和數(shù)據(jù)測(cè)定的基礎(chǔ)。在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品研發(fā)方面，歐盟聯(lián)合研究中心下屬的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與測(cè)量研究所(IRMM)起步最早，目前已研制了轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、水稻等基體標(biāo)準(zhǔn)樣品近110種，質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品4種。另外，美國(guó)油脂化學(xué)家學(xué)會(huì)(AOCS)也研制了轉(zhuǎn)基因大豆、玉米、甜菜等基體和基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品50多種。基體標(biāo)準(zhǔn)樣品和基因組DNA的制備都需找到并篩選出高純度的轉(zhuǎn)基因純合原材料，并且基體標(biāo)準(zhǔn)樣品制備過(guò)程技術(shù)要求高，成本高昂，來(lái)源有限，有些轉(zhuǎn)基因作物品系很難獲得，因此，限制了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展。每年我國(guó)要進(jìn)口大批量的農(nóng)產(chǎn)品用作食品和飼料原料，其中很多是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品；因此，相關(guān)實(shí)驗(yàn)室對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)必需的標(biāo)準(zhǔn)品需求量很大。目前，我國(guó)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品主要還是依靠進(jìn)口，不僅價(jià)格高昂，到貨周期長(zhǎng)，而且覆蓋的轉(zhuǎn)基因作物品系有限，不能滿足轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品日常檢測(cè)工作需求。

近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品已成為一種新型標(biāo)準(zhǔn)品，其研發(fā)和使用更加靈活，且成本更低，獲得了相關(guān)領(lǐng)域?qū)＜业恼J(rèn)可。質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品可以通過(guò)微生物進(jìn)行大量培養(yǎng)獲得，提取過(guò)程簡(jiǎn)便，純度較高不易降解，且成本低效益高。因此，國(guó)際上越來(lái)越多的研究人員對(duì)質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品展開(kāi)了研究。質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，在玉米、大豆、油菜、水稻等轉(zhuǎn)基因作物的定性、定量檢測(cè)中得到了應(yīng)用。同時(shí)研究者們也研制出了可檢測(cè)多個(gè)目的基因的多靶標(biāo)質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品。如可同時(shí)檢測(cè)8個(gè)轉(zhuǎn)基因油菜RF1、RF2、MS1、MS8、Topas19/2、Oxy235、RT73和T45品系的復(fù)合型標(biāo)準(zhǔn)樣品，可同時(shí)檢測(cè)3種轉(zhuǎn)基因水稻KMD1、TT51-1和KF6品系的標(biāo)準(zhǔn)樣品等?？紤]到轉(zhuǎn)基因康乃馨原材料很難獲得，不適于研制基體標(biāo)準(zhǔn)品和基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品。因此，本研究采用更加靈活的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品制備轉(zhuǎn)基因康乃馨檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品。

本研究研制了適于轉(zhuǎn)基因康乃馨Moonlite品系檢測(cè)的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite，其為質(zhì)粒核酸懸浮液，無(wú)色透明。經(jīng)測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)樣品具有良好的均勻性和穩(wěn)定性，適合長(zhǎng)途運(yùn)輸，在低溫條件下可至少保存6個(gè)月。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，pLite中康乃馨內(nèi)源基因的拷貝數(shù)參考值為(6.13±0.22)×10μL，Moonlite品系特異性序列的拷貝數(shù)參考值為(6.10±0.24)×10μL。目前，國(guó)際上還沒(méi)有轉(zhuǎn)基因康乃馨檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的相關(guān)報(bào)道，本研究研制的質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品pLite，填補(bǔ)了該領(lǐng)域的空白，為我國(guó)轉(zhuǎn)基因康乃馨的有效檢測(cè)與監(jiān)管提供了技術(shù)支撐。