模擬酸雨對(duì)三葉草種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響

岳雪嬌， 劉 英， 向仰州， 黃 沛， 姚 斌

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院荒漠化研究所， 北京 100091；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院生態(tài)保護(hù)與恢復(fù)研究所， 北京 100091；3.貴州師范學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院， 貴陽 550018； 4.貴州師范學(xué)院地理與資源學(xué)院， 貴陽 550018)

TrrifoliumrepensL.

酸雨是當(dāng)前影響和破壞生態(tài)系統(tǒng)的世界性重大環(huán)境問題之一[1-2]。近年來，我國酸雨有加重和蔓延的趨勢(shì)，2020年我國能源總需求量為23.2億～31.0億噸標(biāo)準(zhǔn)煤(其中90%的能源是化石燃料)，致酸物質(zhì)(如二氧化硫、氮氧化物)的排放量大幅增加[2]。現(xiàn)階段我國受酸雨影響的地區(qū)已占國土面積的30%，酸雨給我國的經(jīng)濟(jì)建設(shè)和人民生活造成了很大損失，已成為制約我國經(jīng)濟(jì)和社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的一個(gè)重要環(huán)境因素。

在土壤日益酸化的背景下，酸雨加快了土壤鹽基離子流失，導(dǎo)致酸化程度不斷加劇，不同程度影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。酸雨脅迫能不同程度改變植物細(xì)胞質(zhì)膜的透性，導(dǎo)致細(xì)胞功能喪失，表現(xiàn)為植物葉片不能正常進(jìn)行光合作用，根系對(duì)土壤營養(yǎng)物質(zhì)的吸收存在障礙。已開展的酸雨脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育響應(yīng)特征及機(jī)理研究[3-6]的目標(biāo)作物主要是糧食作物(如水稻[3,5,7]、小麥[3,5])、經(jīng)濟(jì)作物(如油菜[3,5]、白菜[9]、板藍(lán)根[1]、棉花[11])、飼料作物(紫花苜蓿[8]、小黑麥[4])等，對(duì)草本植物的研究相對(duì)較少。白三葉和紅三葉是豆科三葉草屬多年生草本植物，兼具色澤美、綠期長(zhǎng)、修剪次數(shù)少及固氮能力強(qiáng)等特性，為優(yōu)良的牧草，同時(shí)在草坪建植中被廣泛使用。酸雨對(duì)優(yōu)質(zhì)牧草和重要草坪建植種三葉草的影響將逐步引起研究者的重視。但目前關(guān)于模擬三葉草逆境脅迫的研究多集中于干旱脅迫[12-13]、鹽脅迫[14-15]及重金屬脅迫[16-17]，酸雨脅迫對(duì)三葉草生長(zhǎng)發(fā)育的研究報(bào)道甚少。鑒于此，通過研究不同pH的酸雨脅迫條件下白三葉和紅三葉的種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)特征，量化判別二者對(duì)酸雨抵抗能力的強(qiáng)弱及差異，以期為酸雨或土壤酸化嚴(yán)重地區(qū)選種及其管理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料白三葉購自貴州克勞沃草業(yè)有限公司，品種為海法白三葉(TrifoliumrepensL.cv.Haifa)；紅三葉由貴州綠地生態(tài)科技有限公司提供，品種為岷山紅三葉(Trifoliumpretense‘Minshan’)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別對(duì)白三葉和紅三葉進(jìn)行不同的模擬酸雨脅迫處理，以去離子水為對(duì)照，共12個(gè)處理，5次重復(fù)。模擬酸雨的制備參照文獻(xiàn)[18]配制：先用硫酸和硝酸制備pH=1.0的酸雨母液，其中硫酸根和硝酸根的體積比為4.7∶1。以去離子水為稀釋液，將母液分別調(diào)制成pH值為 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0的酸雨，并經(jīng)ZD-型自動(dòng)電位滴定儀校準(zhǔn)(上海雷磁儀器公司)后備用。

分別選取籽粒飽滿，粒徑大小相近的白三葉和紅三葉種子用于試驗(yàn)，先用0.05%的高錳酸鉀溶液消毒30 min，去離子水漂洗3次，然后用吸水紙吸干種子表面的水分得到備用草種。根據(jù)國際種子檢驗(yàn)規(guī)程[19]，采用雙層濾紙發(fā)芽。在預(yù)先進(jìn)行標(biāo)記的培養(yǎng)皿中鋪2層濾紙，選取預(yù)處理后的白三葉和紅三葉種子放在濾紙上，50粒/皿，種子間距盡量保持一致。然后用移液管分別準(zhǔn)確量取pH值為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0的模擬酸雨溶液加入培養(yǎng)皿中，因?yàn)V紙干燥，第一次酸雨用量12 mL，以后每次用量10 mL。為保證酸雨濃度不變，每2 d更換一次相應(yīng)的酸液。將各處理培養(yǎng)皿移至GXZ型光照培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)進(jìn)行培養(yǎng)，溫度(25±0.5)℃，光照時(shí)間12 h/d。以后每天打開2次，與外界換氣5 min。發(fā)芽以突破種皮的胚軸長(zhǎng)度達(dá)到真種子自身的長(zhǎng)度為標(biāo)準(zhǔn)，每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽的種子數(shù)。

1.3 種子萌發(fā)的觀測(cè)與評(píng)估

發(fā)芽勢(shì)(%)=(4 d內(nèi)正常發(fā)芽粒數(shù)/供試種子數(shù))×100%[20]；

發(fā)芽率(%)=(8 d內(nèi)全部正常發(fā)芽粒數(shù)/供試種子數(shù))×100%[21]；

用電子天平稱量2個(gè)品種幼苗鮮重；

將2個(gè)品種幼苗放置在80 ℃的恒溫箱中，24 h后取出用電子天平直接稱重；

發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)，式中，Gt為總的發(fā)芽粒數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)[22]；

活力指數(shù)=GI×S，式中，GI為發(fā)芽指數(shù)，S為第8天單株幼苗平均鮮重[1]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用DPS 14.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析[16]，并用Duncan’s 法進(jìn)行處理間的多重比較，利用sigmaplot 12.5 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸雨脅迫對(duì)紅三葉和白三葉種子發(fā)芽的影響

植物受到逆境脅迫會(huì)導(dǎo)致植物生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，植物種子耐受環(huán)境因素脅迫的表現(xiàn)各異。模擬酸雨對(duì)2種三葉草種子發(fā)芽勢(shì)的影響見圖1。由圖1可知，隨著酸雨pH值的降低，紅三葉與白三葉種子的發(fā)芽勢(shì)均呈減小趨勢(shì)，且其發(fā)芽勢(shì)均低于對(duì)照。酸雨pH值5.0處理紅三葉與白三葉種子的發(fā)芽勢(shì)均與對(duì)照差異不顯著，受酸雨脅迫影響不明顯。紅三葉品種除pH值5.0處理外，其余處理的種子發(fā)芽勢(shì)均與對(duì)照差異極顯著(p<0.01)，但處理間無顯著性差異。酸雨pH值2.0和pH值2.5處理白三葉的種子發(fā)芽勢(shì)與對(duì)照差異極顯著(p<0.01)，pH值3.0處理與對(duì)照差異顯著(p<0.05)。

模擬酸雨對(duì)2種三葉草種子發(fā)芽率的影響見圖2。由圖2可知，隨著酸雨pH值的降低，紅三葉與白三葉種子發(fā)芽率均呈減小趨勢(shì)。但與對(duì)照相比，紅三葉與白三葉種子發(fā)芽率在pH值為5.0酸雨處理下略有增加，而其余處理的種子發(fā)芽率均低于對(duì)照。紅三葉品種在pH值為5.0時(shí)受酸雨脅迫的影響不明顯，其余處理的種子發(fā)芽率均與對(duì)照呈差異極顯著(p<0.01)，且pH值為3.0、2.5、2.0處理較pH值為4.0、3.5處理差異極顯著(p<0.01)。pH值為5.0和pH值為4.0處理白三葉受酸雨脅迫的影響不明顯，其余處理的種子發(fā)芽率均與對(duì)照差異極顯著(p<0.01)，且pH值為2.5和pH值為2.0的酸雨處理與pH值為3.5處理呈差異極顯著(p<0.01)。

圖1 模擬酸雨對(duì)紅三葉和白三葉種子發(fā)芽勢(shì)的影響Fig.1 The effect of simulated acid rain on the seed germination potential of red and white clover

圖2 模擬酸雨對(duì)紅三葉和白三葉種子發(fā)芽率的影響Fig.2 The effect of simulated acid rain on the seed germination rate of red and white clover

2.2 酸雨脅迫對(duì)紅三葉和白三葉種子活力的影響

一般而言，發(fā)芽率能反映環(huán)境脅迫對(duì)種子萌發(fā)的影響，但要反映出種子的活力及出苗的整齊程度則很難，通常以種子發(fā)芽指數(shù)來表征種子的活力。模擬酸雨對(duì)2種三葉草種子發(fā)芽指數(shù)的影響見圖3。由圖3可知，隨著酸雨脅迫強(qiáng)度增加，紅三葉與白三葉種子發(fā)芽指數(shù)均呈減小趨勢(shì)。紅三葉種子發(fā)芽指數(shù)均低于對(duì)照，且僅pH值為2.0和pH值為3.0處理與對(duì)照差異極顯著(p<0.01)，pH值為2.5處理與對(duì)照差異顯著(p<0.05)，其余處理種子發(fā)芽指數(shù)均與對(duì)照差異不顯著。白三葉除pH值為5.0處理外，其余處理的種子發(fā)芽指數(shù)均與對(duì)照差異極顯著(p<0.01)，且處理間均差異極顯著(p<0.01)。

圖3 模擬酸雨對(duì)紅三葉和白三葉種子發(fā)芽指數(shù)的影響Fig.3 The effect of simulated acid rain on the seed germination index of red and white clover

模擬酸雨對(duì)2種三葉草種子活力指數(shù)的影響見圖4。由圖4可知，隨著酸雨脅迫強(qiáng)度增加，紅三葉種子活力指數(shù)無明顯變化趨勢(shì)，而白三葉種子活力指數(shù)呈現(xiàn)明顯減小趨勢(shì)。相較于紅三葉，白三葉種子活力指數(shù)受到酸雨脅迫的影響更明顯。紅三葉除pH值為2.0處理與對(duì)照差異顯著外(p<0.05)，其余處理的種子活力指數(shù)均與對(duì)照差異不顯著。白三葉種子活力指數(shù)均低于對(duì)照，且pH值為5.0處理的種子活力指數(shù)與對(duì)照無顯著性差異，受酸雨脅迫影響不明顯；其余處理下的種子活力指數(shù)均與對(duì)照差異極顯著(p<0.01)，但處理間均無顯著性差異。

2.3 酸雨脅迫對(duì)紅三葉和白三葉幼苗重量的影響

酸雨脅迫會(huì)對(duì)植物的生物量產(chǎn)生影響，模擬酸雨對(duì)2種三葉草幼苗鮮重的影響見圖5。由圖5可知，隨著酸雨脅迫強(qiáng)度增加，紅三葉與白三葉幼苗鮮重均呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，且兩個(gè)品種的幼苗鮮重均低于對(duì)照。相較于紅三葉，白三葉幼苗鮮重受酸雨脅迫的影響更明顯。pH值為5.0處理的紅三葉幼苗鮮重與對(duì)照無顯著差異，受酸雨脅迫影響不明顯；其余處理的幼苗鮮重均與對(duì)照差異極顯著(p<0.01)，但處理間均無顯著性差異。白三葉僅pH值為2.0和pH值為2.5處理與對(duì)照差異極顯著(p<0.01)，而pH值為3.5處理與對(duì)照差異顯著(p<0.05)，其余處理的幼苗鮮重均與對(duì)照差異不顯著。

圖4 模擬酸雨對(duì)紅三葉和白三葉種子活力指數(shù)的影響Fig.4 The effect of simulated acid rain on the seed vigor index of red and white clover

圖5 模擬酸雨對(duì)紅三葉和白三葉幼苗鮮重的影響Fig.5 The effect of simulated acid rain on the fresh biomass of red and white clover seedlings

圖6 模擬酸雨對(duì)紅三葉和白三葉幼苗干重的影響Fig.6 The effect of simulated acid rain on the dry biomass of red and white clover seedlings

模擬酸雨對(duì)兩種三葉草幼苗干重的影響見圖6。由圖6可知，隨著酸雨pH值的降低，紅三葉與白三葉幼苗干重均呈緩慢降低趨勢(shì)。pH值為5.0酸雨處理紅三葉的幼苗干重與對(duì)照差異顯著(p<0.05)，其余處理均與對(duì)照差異極顯著(p<0.01)。白三葉幼苗干重雖均低于對(duì)照，但酸雨pH值為3.5、4.0、5.0處理幼苗干重均與對(duì)照差異不顯著，僅酸雨pH值為2.0、2.5、3.0處理與對(duì)照差異極顯著(p<0.01)。

3 討 論

酸雨不僅對(duì)動(dòng)植物具有直接的傷害作用，還會(huì)影響土壤肥力和活性，對(duì)作物生長(zhǎng)造成損害，具有嚴(yán)重的危害性[23-24]。種子萌發(fā)和成苗這兩個(gè)關(guān)鍵階段決定了植物是否能夠正常生長(zhǎng)。

3.1 酸雨脅迫對(duì)三葉草種子萌發(fā)的影響

種子萌發(fā)期是植物生長(zhǎng)周期中極易受到環(huán)境因素影響的關(guān)鍵時(shí)期之一，對(duì)外界環(huán)境十分敏感[25]。種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等指標(biāo)可以用來反映種子的萌發(fā)能力，表征植物抗逆性的強(qiáng)弱[26]。本研究中，紅三葉種子pH值為5.0酸雨處理的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)與對(duì)照差異不顯著，表明適當(dāng)pH的酸雨對(duì)紅三葉種子萌發(fā)無明顯抑制作用，這與王文彥[27]的研究結(jié)果一致。pH值為4.0、3.5酸雨處理的紅三葉種子萌發(fā)雖受到酸雨脅迫影響，但影響較小并且均能正常萌發(fā)。而在酸雨pH值為3.0、2.5、2.0時(shí)，紅三葉種子萌發(fā)受到酸雨脅迫的影響較大，原因可能是重度酸雨脅迫導(dǎo)致種子細(xì)胞內(nèi)保護(hù)酶活性降低，儲(chǔ)藏物質(zhì)分解及呼吸代謝受到抑制，缺少萌發(fā)所需物質(zhì)和能量[28]。但在該處理下仍有部分種子能夠正常萌發(fā)，種子活力指數(shù)甚至與對(duì)照無顯著性差異，說明紅三葉品種的抗酸性能力較強(qiáng)。白三葉品種種子萌發(fā)受酸雨脅迫的影響較大，其種子活力在酸雨脅迫下嚴(yán)重下降。酸雨pH值為3.5、3.0、2.5、2.0時(shí)，有部分種子可以萌發(fā)，這與魏禎禎等[29]對(duì)4種草坪草種子進(jìn)行酸雨pH值為2.0時(shí)的模擬酸雨實(shí)驗(yàn)，得到的種子萌發(fā)均受到完全抑制的結(jié)果不同，說明不同種子對(duì)酸雨的抵抗力各異。在酸雨pH值為5.0的條件下，白三葉種子能夠正常萌發(fā)，種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)甚至略高于對(duì)照，這與王瑞龍[30]等對(duì)三葉鬼針草進(jìn)行的模擬酸雨實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，可能的原因是模擬酸雨中含有部分氮氧化物，氮氧化物可以為種子提供氮源，從而有利于種子萌發(fā)[31]。

3.2 酸雨脅迫對(duì)三葉草幼苗生長(zhǎng)的影響

植物對(duì)酸脅迫的耐受存在一定的范圍。研究表明，景天三七能夠適應(yīng)pH值為4.2～6.2的土壤環(huán)境[32]，類蘆能夠耐受的土壤環(huán)境pH值范圍為3.5～5.6[33]，而刨花楠在pH值為2.5的土壤環(huán)境中仍然能夠正常生長(zhǎng)[34]，由此可知，不同植物對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境的酸脅迫的耐受程度不同，而種子成苗是植物生長(zhǎng)周期中決定植物是否能夠正常生長(zhǎng)的兩個(gè)關(guān)鍵階段之一，通過酸雨脅迫對(duì)三葉草幼苗生長(zhǎng)的影響可以在一定程度上判斷其酸雨耐受能力。本研究通過三葉草幼苗的鮮重與干重來評(píng)價(jià)其生長(zhǎng)情況，紅三葉幼苗pH值為5.0酸雨處理的鮮重、干重均與對(duì)照差異不顯著，表明適當(dāng)pH的酸雨對(duì)紅三葉幼苗的生長(zhǎng)無明顯抑制作用。pH值為4.0、3.5酸雨處理的紅三葉幼苗生長(zhǎng)受酸雨脅迫影響較小，表明紅三葉品種可以耐受pH值為4.0、3.5的模擬酸雨，該結(jié)果與郝國寶等[35]對(duì)夏枯草種子進(jìn)行的模擬酸雨實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。而在酸雨pH值為3.0、2.5、2.0時(shí)，紅三葉幼苗生長(zhǎng)受到酸雨脅迫的影響較大。白三葉品種幼苗生長(zhǎng)相較于紅三葉品種受酸雨脅迫的影響更大，酸雨pH值為3.5、3.0、2.5、2.0時(shí)，幼苗的生長(zhǎng)量極小，這與汪賽[36]對(duì)茶幼苗進(jìn)行的酸雨處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，表明白三葉品種的抗酸性能力低于紅三葉品種。

4 結(jié) 論

紅三葉與白三葉種子萌發(fā)和幼苗生物量均不同程度地受到模擬酸雨脅迫的抑制，但隨著酸雨脅迫程度增加，紅三葉種子的萌發(fā)潛力和幼苗的生物量累積均高于白三葉，說明紅三葉對(duì)酸雨脅迫的耐受性更強(qiáng)，本研究中其pH耐受范圍為2.0～4.5。因此，在酸性土壤或酸雨脅迫環(huán)境下，為提高草坪或牧草的產(chǎn)量及質(zhì)量，需要考慮選育抗酸性能力較強(qiáng)的三葉草品種，即可以選擇紅三葉作為耐酸品種。

植物在生長(zhǎng)過程中會(huì)啟動(dòng)一定的防御機(jī)制來應(yīng)對(duì)外界的各種脅迫[37]，當(dāng)前，我國的酸雨問題仍然突出，硫酸型、混合型及硝酸型三種類型的酸雨并存，而且酸雨類型逐漸向硫酸硝酸混合型轉(zhuǎn)變，并且存在向硝酸型酸雨轉(zhuǎn)變的趨勢(shì)[38]。而上述研究?jī)H為紅三葉種子在不同pH混合型酸雨脅迫(硫氮比為4.7∶1)下的初步結(jié)果，其潛在的生理生化及基因水平反饋機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入探討，以期為耐受酸雨的紅三葉品種選育、建植及管理提供理論依據(jù)。