添加碳源對(duì)不同pH水稻土中反硝化關(guān)鍵功能基因的影響

李健 曲植 張立鑫 李銘江 陸江岳

1 西安理工大學(xué) 省部共建西北旱區(qū)生態(tài)水利國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西安,710048 2 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心 環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京,100085

0 引言

水稻是我國第一大糧食作物，其產(chǎn)量約占全國糧食產(chǎn)量的1/3，截止2022年，我國栽培面積達(dá)到2 900萬hm2[1].為提高作物產(chǎn)量，自20世紀(jì)70年代以來，我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的氮肥施用量迅速增加.根據(jù)FAO的統(tǒng)計(jì)資料，平均每年增加約7.8×105t.2008年耕地面積僅占世界7%的中國，消耗了3.3×107t氮肥，占全球當(dāng)年氮肥消耗量9.2×107t的36%，有預(yù)測(cè)表明，我國的氮肥施用量還可能繼續(xù)增加[2-3].目前，中國稻田的氮素平均利用率僅在30%～40%之間，而造成稻田氮素利用率低下的一個(gè)主要原因是稻田中發(fā)生反硝化作用導(dǎo)致氮素以氣態(tài)形式流失[4-6].

反硝化作用作為土壤中參與氮循環(huán)的重要一環(huán)，是農(nóng)業(yè)上N2O排放的主要來源.反硝化作用是指反硝化微生物在厭氧條件下，將硝酸鹽、亞硝酸鹽逐步還原，最終將氮以一氧化氮(NO)、氧化亞氮(N2O)或分子態(tài)氮(N2)的形式釋放的過程[7-8]，它提高了農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中氮素流失的風(fēng)險(xiǎn)，并導(dǎo)致了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失.

反硝化過程是由微生物驅(qū)動(dòng)的酶促反應(yīng)過程，其反映速率和產(chǎn)物組成顯著受到多種環(huán)境因素直接或間接的影響，如溫度、pH、Eh、水分、含氧量、碳源類型、氮源類型、碳氮比、土壤質(zhì)地、耕作方式及土地利用類型等.近年來，國內(nèi)外眾多學(xué)者圍繞環(huán)境因子對(duì)反硝化作用的影響開展了一系列深入的研究.Tang等[9]通過向亞熱帶和溫帶森林土壤中添加N、P，發(fā)現(xiàn)pH值是反硝化微生物活性的主要控制因子；Tao等[10]通過有無施用有機(jī)肥對(duì)農(nóng)田土壤反硝化微生物群落結(jié)構(gòu)及N2O排放的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)施加有機(jī)肥可顯著提高土壤反硝化酶活性，增加反硝化過程相關(guān)功能基因的數(shù)量，并減少N2O排放量；王麗麗等[11]研究發(fā)現(xiàn)，生物反硝化系統(tǒng)中最好的電子供體是易于生物降解的有機(jī)物，其不僅可提高反硝化速率，還能夠提升生物處理裝置的能力和效率；王海濤等[12]、鄭蘭香等[13]發(fā)現(xiàn)土壤中C/N比越高，反硝化速率越強(qiáng).Shan等[14]、Ryden等[15]、Bhandral等[16]研究也表明有機(jī)碳含量越高，其反硝化潛勢(shì)也越大.這是由于反硝化作用是微生物在厭氧條件下進(jìn)行的硝酸鹽、亞硝酸鹽的異養(yǎng)還原過程，需要碳源作為電子供體參與反應(yīng)[17].淹水條件下微生物利用碳源厭氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸[18-19]、氫離子[20]、CO2等物質(zhì)會(huì)降低土壤pH[21]，而土壤pH是影響反硝化作用最主要也是最復(fù)雜的因素之一，可直接影響參加反硝化作用的反硝化的微生物群落結(jié)構(gòu)和氮氧化物還原酶的活性[22-24].因此碳源是影響反硝化作用的關(guān)鍵因素之一，但是目前關(guān)于外加碳源的研究多見于對(duì)工農(nóng)業(yè)污水脫氮處理，其對(duì)農(nóng)業(yè)土壤尤其是稻田土壤中反硝化作用的影響機(jī)理研究較少，碳源添加對(duì)反硝化過程的影響機(jī)制研究鮮有報(bào)道.

本研究通過室內(nèi)水稻土泥漿厭氧培養(yǎng)試驗(yàn)，在不同本底pH水稻土中添加碳源培養(yǎng)，監(jiān)測(cè)培養(yǎng)過程中土壤pH和無機(jī)氮濃度的變化，并基于DNA和RNA水平分別分析反硝化微生物編碼亞硝酸鹽還原酶的nirK/S和編碼氧化亞氮還原酶的nosZ等功能基因豐度變化，旨在探究添加碳源對(duì)不同本底pH水稻土反硝化過程的調(diào)控機(jī)理，為提高氮素利用效率、溫室氣體減排提供理論支撐.

1 材料方法

1.1 樣品采集

供試水稻土分別采自天津市寶坻區(qū)王卜莊鎮(zhèn)后張司馬村(117.55°E,39.65°N)和廣東省廣州市蘿崗區(qū)九龍鎮(zhèn)洋田村(106.71°E,26.49°N).前者為多年種植單季稻土壤，以字母BD表示；后者為多年種植雙季稻土壤，以字母GZ表示.在水稻落干期，采集稻田耕層0～20 cm的土壤，揀去植物殘?bào)w，自然風(fēng)干，磨細(xì)，過1 mm篩，避光保存，備用.供試土壤的理化性質(zhì)如表1所示.

表1 供試水稻土的理化性狀

1.2 培養(yǎng)試驗(yàn)

1.2.1 風(fēng)干土預(yù)培養(yǎng)

分別取BD、GZ風(fēng)干水稻土各1 kg，調(diào)節(jié)其質(zhì)量含水率至15%，于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中好氧培養(yǎng)7 d以恢復(fù)土壤微生物活性.

1.2.2 泥漿厭氧培養(yǎng)試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)置：本試驗(yàn)選取兩個(gè)因子，即土壤樣品本底pH和外源添加有機(jī)碳(葡萄糖)濃度，其中土壤樣品為酸性的GZ土壤和堿性的BD土壤；葡萄糖濃度設(shè)置3個(gè)水平，分別為0、25和100 mmol·L-1，依次標(biāo)記為CK、L和H(表2).

表2 試驗(yàn)設(shè)置

淹水處理：取預(yù)培養(yǎng)土樣3 g置于10 mL玻璃培養(yǎng)瓶中，加入1.5 mL KNO3溶液作為氮源，再根據(jù)處理添加1.5 mL相應(yīng)濃度的葡萄糖溶液作為碳源，最終制成水土比為1∶1的泥漿.

厭氧培養(yǎng)：淹水處理后，培養(yǎng)瓶加橡膠塞封口，以60 mL·min-1的流速充入高純氮?dú)馐蛊恐蠳2交換循環(huán)至少20次，以去除瓶中的O2使其達(dá)到厭氧環(huán)境，后加鋁蓋密封，置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱避光培養(yǎng).

1.2.3 樣品采集與保存

分別于培養(yǎng)開始后的第0、0.5、1、2、3、4、5、6、7、9和11天采集土壤樣品，直接用于土壤pH的測(cè)定；分別于培養(yǎng)開始后的第0小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)、0.5天、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、9天、11天，采集土壤樣品置于2 mL凍存管中，液氮冷凍后，-80 ℃保存，供提取土壤DNA和RNA使用；同時(shí)采集樣品置于-20 ℃冰箱保存，以供土壤無機(jī)氮的測(cè)定.采集樣品時(shí)先將培養(yǎng)瓶置于冰上預(yù)冷10 min.

1.3 土壤pH測(cè)定

取泥漿樣品搖勻后，采用pH計(jì)(MT-5000)依次對(duì)不同處理樣品進(jìn)行測(cè)定.

1.4 土壤無機(jī)氮素含量測(cè)定

1.5 土壤總DNA的提取

取0.5 g-80 ℃冷凍保存的樣品，使用DNA提取試劑盒(E.Z.N.A.? Soil DNA Kit，Omega Bio-tek)按照試劑盒說明書步驟提取土壤總DNA，提取的DNA樣品分裝后保存在-80 ℃(長期)低溫冰箱中.

1.6 土壤總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄

取0.5 g-80 ℃冷凍保存的樣品，使用RNA提取試劑盒(E.Z.N.A.? Soil RNA Kit，Omega Bio-tek)按照試劑盒說明書步驟提取土壤總RNA，提取的RNA樣品在確保沒有g(shù)DNA后，使用RNA-cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，TaKaRa)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，分裝后保存在-80 ℃(長期)低溫冰箱中.

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增

使用1.5小節(jié)和1.6小節(jié)中提取的DNA和cDNA為模板分別選取反硝化微生物亞硝酸鹽還原酶(nirK/S)基因和氧化亞氮還原酶(nosZ)基因的對(duì)應(yīng)引物對(duì)(表3)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，與已知濃度的含有各基因的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒擴(kuò)增結(jié)果比對(duì)，得到各樣品中對(duì)應(yīng)基因表達(dá)量.

表3 使用的PCR擴(kuò)增引物

1.8 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)方差分析和相關(guān)性分析用SPSS 20.0軟件完成，采用單因素方差分析法區(qū)分樣品間的顯著性差異(One Way ANOVE，LSD檢驗(yàn))；使用Origin 2021軟件繪圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖添加對(duì)水稻土pH的影響

BD(寶坻水稻土)在未添加葡萄糖的情況下，其pH幾乎沒有發(fā)生變化；而在添加葡萄糖后的2 d內(nèi)土壤pH值顯著下降，后趨于穩(wěn)定，并呈現(xiàn)外源添加葡萄糖濃度越高，pH降低幅度越大的特點(diǎn).在低葡萄糖處理?xiàng)l件下，土壤pH值在2 d內(nèi)由7.78下降至6.24；而在高葡萄糖處理?xiàng)l件下，土壤pH值在2 d內(nèi)由7.77下降至6.08，之后仍存在緩慢降低，3 d后基本穩(wěn)定(圖1a).GZ(廣州水稻土)在未添加葡萄糖的情況下，其pH值隨培養(yǎng)時(shí)間延長而緩慢上升，在整個(gè)培養(yǎng)期間由初始的4.51上升至6.42，增幅達(dá)1.91個(gè)單位.其中低葡萄糖添加處理，pH隨培養(yǎng)時(shí)間呈現(xiàn)先升高后降低再升高的緩慢變化趨勢(shì)，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)pH上升1個(gè)單位；而高葡萄糖添加處理，pH隨培養(yǎng)時(shí)間呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)，其中培養(yǎng)5 d后pH最高為5.23，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)pH上升0.22個(gè)單位，說明添加外源葡萄糖可減小土壤pH上升幅度，尤其是在高濃度葡萄糖處理?xiàng)l件下更為顯著(圖1b).

圖1 土壤pH變化

2.2 葡萄糖添加對(duì)水稻土無機(jī)氮含量的影響

圖2 無機(jī)氮濃度變化

2.3 葡萄糖添加對(duì)土壤中反硝化功能基因數(shù)量的影響

BD水稻土在未添加葡萄糖的培養(yǎng)過程中nirK基因拷貝數(shù)幾乎沒有變化，而添加葡萄糖處理使得nirK基因拷貝數(shù)發(fā)生顯著變化，其中在低葡萄糖處理下，nirK基因拷貝數(shù)整體上隨時(shí)間呈現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)，分別于培養(yǎng)3 d和7 d時(shí)達(dá)到峰值，最大值為6.46×107copies/g(soil)；而在高葡萄糖處理下，nirK基因拷貝數(shù)變化幅度更大，分別于第4 d和6 d時(shí)達(dá)到峰值，其最大值為1.17×108copies/g(soil)；之后nirK基因拷貝數(shù)均下降至初始水平(圖3a).GZ水稻土在不同濃度葡萄糖添加下整體上均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中無葡萄糖添加處理的降幅最大，為53.82%，低葡萄糖添加處理和高葡萄糖添加處理分別下降23.54%、41.89%(圖3b).

BD水稻土在未添加葡萄糖的培養(yǎng)過程中nirS基因拷貝數(shù)在第6 d達(dá)到最低值，于第9 d達(dá)到峰值，整體上呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì).在葡萄糖添加下，nirS基因拷貝數(shù)變化顯著，其中低葡萄糖添加使得nirS基因拷貝數(shù)于第3～7天均處于較高水平，7天時(shí)存在最大值為1.77×109copies/g(soil)，隨后nirS基因拷貝數(shù)迅速下降，9 d后達(dá)到最低，為2.08×108copies/g(soil)；而高葡萄糖添加使得在第5 d后存在明顯峰值，為1.59×109copies/g(soil)，其余階段nirS基因拷貝數(shù)均與培養(yǎng)初期水平相當(dāng)(圖3c).GZ水稻土在高葡萄糖添加下nirS基因拷貝數(shù)整體水平較其他兩個(gè)處理稍高，其余各處理nirS基因拷貝數(shù)在整體上均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，其中無葡萄糖添加處理的降幅最大，為50.36%，低葡萄糖添加處理和高葡萄糖添加處理分別下降42.86%、38.93%(圖3d).

BD水稻土在未添加葡萄糖時(shí)，nosZ基因呈現(xiàn)出先增加隨后緩慢下降趨于穩(wěn)定的規(guī)律，其中于第2天達(dá)到峰值1.04×109copies/g(soil)；在低葡萄糖處理下，nosZ基因拷貝數(shù)變化顯著，于第4～7 d均維持在較高水平，最大值為1.58×109copies/g(soil)，之后迅速降低，第9天達(dá)到最低，為2.59×108copies/g(soil)；在高葡萄糖處理下，nosZ基因變化相對(duì)平緩，于第5天存在較小峰值，為9.59×108copies/g(soil)(圖3e).GZ水稻土在未添加葡萄糖的培養(yǎng)過程中nosZ基因拷貝數(shù)整體水平較其他兩個(gè)處理稍高，呈現(xiàn)先減后增的趨勢(shì).葡萄糖添加使得nosZ基因拷貝數(shù)整體上均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，低葡萄糖添加處理和高葡萄糖添加處理分別下降68.46%、66.47%(圖3f).

圖3 功能基因拷貝數(shù)變化

2.4 葡萄糖添加對(duì)各功能基因轉(zhuǎn)錄本數(shù)量的影響

BD水稻土在不同濃度葡萄糖添加下，nirK基因轉(zhuǎn)錄本數(shù)量均出現(xiàn)明顯變動(dòng)，并且均于培養(yǎng)第6天出現(xiàn)峰值，但低葡萄糖處理的峰值明顯要高.此外在整個(gè)培養(yǎng)過程中，低葡萄糖處理nirK基因轉(zhuǎn)錄本數(shù)量變動(dòng)也更為明顯，于培養(yǎng)第3天后較先出現(xiàn)最高峰，其nirK基因轉(zhuǎn)錄本的最大值為2.95×105copies/g(soil)，顯著高于未添加葡萄糖處理的4.12×104copies/g(soil)和高葡萄糖添加處理的5.93×104copies/g(soil)(圖4a).GZ水稻土在無葡萄糖和低葡萄糖添加下，nirK基因轉(zhuǎn)錄本數(shù)量變動(dòng)不大，且整體水平高于高葡萄糖添加處理.在高葡萄糖添加下，nirK基因轉(zhuǎn)錄本數(shù)量隨培養(yǎng)時(shí)間在緩慢下降，至培養(yǎng)結(jié)束nirK基因轉(zhuǎn)錄本數(shù)量減少1.10×104copies/g(soil)，同比降低71.21%(圖4b).

BD水稻土在未添加葡萄糖和低葡萄糖添加下，nirS基因轉(zhuǎn)錄本數(shù)量明顯高于高葡萄添加處理，并且均于培養(yǎng)第3天出現(xiàn)峰值，但低葡萄糖處理的峰值更高，而高葡萄糖添加下nirS基因轉(zhuǎn)錄本數(shù)量沒有明顯變化.此外低葡萄糖處理中nirS基因轉(zhuǎn)錄本數(shù)量于培養(yǎng)5天后出現(xiàn)第2個(gè)峰值，其nirS基因轉(zhuǎn)錄本的最大值為4.10×107copies/g(soil)，顯著高于無葡萄糖處理的2.51×107copies/g(soil)和高葡萄糖處理的8.32×106copies/g(soil)(圖4c).在GZ水稻土培養(yǎng)過程中，各個(gè)處理nirS基因轉(zhuǎn)錄本數(shù)量于培養(yǎng)前2 d內(nèi)均出現(xiàn)不同程度的降低，其中高葡萄糖添加處理下降98.08%，顯著高于其余兩個(gè)處理.至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，葡萄糖的添加未使得nirS基因轉(zhuǎn)錄本數(shù)量發(fā)生明顯改變，而在未添加葡萄糖時(shí)，nirS基因轉(zhuǎn)錄本數(shù)量于培養(yǎng)第9天開始出現(xiàn)明顯上升的現(xiàn)象(圖4d).

圖4 基因轉(zhuǎn)錄本數(shù)量變化

BD水稻土在低葡萄糖添加下，nosZ基因轉(zhuǎn)錄本數(shù)量整體要高于其余兩個(gè)處理，而未添加葡萄糖時(shí)，nosZ基因轉(zhuǎn)錄本數(shù)無明顯變化；而添加葡萄糖處理中nosZ基因轉(zhuǎn)錄本數(shù)均于1 d后出現(xiàn)峰值，且低葡萄糖添加處理的峰值為4.36×107copies/g(soil)明顯高于高葡萄糖添加處理的2.04×107copies/g(soil)(圖4e).對(duì)于GZ水稻土而言，培養(yǎng)前期各個(gè)處理中nosZ基因轉(zhuǎn)錄本數(shù)量均無明顯變化.在未添加葡萄糖處理中，nosZ基因轉(zhuǎn)錄本數(shù)量于培養(yǎng)6 d后迅速上升，至培養(yǎng)結(jié)束時(shí)增長1.74倍；在低葡萄糖添加處理中，nosZ基因轉(zhuǎn)錄本數(shù)量于培養(yǎng)6 d后出現(xiàn)較小峰值；在高葡萄糖處理中，nosZ基因轉(zhuǎn)錄本數(shù)量整體變化不明顯(圖4f).

3 討論

圖5 nirS/nirK比值變化

nosZ基因編碼的氧化亞氮還原酶(N2OR)是目前已知的唯一能將N2O還原為N2的生物酶,當(dāng)nosZ基因數(shù)量和表達(dá)量受到不利條件的抑制時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致溫室氣體N2O的大量累積.在本試驗(yàn)中，酸性土壤(GZ)經(jīng)過碳源添加處理后，nosZ基因數(shù)量和表達(dá)量收到了抑制作用，且碳源濃度越高，抑制作用越強(qiáng)；堿性土壤(BD)經(jīng)低葡萄糖處理后促進(jìn)了nosZ基因數(shù)量和表達(dá)量，但是高葡萄糖處理下卻抑制了nosZ基因的表達(dá)，這主要是由于在酸性土壤中，由于本身pH很低，加入葡萄糖后使得土壤pH再次下降，從而出現(xiàn)nosZ基因的表達(dá)受抑制.這與朱永官等[27]、潘亞男等[32]、Qu等[33]研究結(jié)果一致，即從基因角度來說，相應(yīng)編碼基因的表達(dá)更易受到土壤pH的影響,低pH會(huì)影響到生物體產(chǎn)生功能性N2O還原酶的能力，當(dāng)土壤pH<7時(shí)反硝化酶nosZ活性逐漸減小；在堿性土壤中，低濃度葡萄糖作為碳源進(jìn)入土壤中，激發(fā)了反硝化微生物的功能活性；而高濃度葡萄糖進(jìn)入土壤所帶來的土壤酸化反而抑制了反硝化微生物的活性，這與封克等[28]的研究結(jié)果一致，即堿性旱地土壤在有碳源加入的情況下，最有利于N2O還原為N2的土壤pH為6.92，當(dāng)添加高濃度葡萄糖時(shí)，土壤將低于這個(gè)最適pH，所以反而抑制了nosZ基因的表達(dá).

4 結(jié)論

本研究揭示了反硝化微生物對(duì)碳源添加的敏感性，葡萄糖添加可以從提供碳源和降低土壤pH兩個(gè)方面，直接或間接的影響水稻土反硝化過程：1)高pH土壤上添加碳源增強(qiáng)了反硝化作用；低pH土壤上添加碳源對(duì)反硝化過程的促進(jìn)作用不明顯.2)不同本底pH的土壤中nirK和nirS基因數(shù)量和表達(dá)量對(duì)加入碳源引起的pH變化的響應(yīng)具有顯著差異，其中nirK基因數(shù)量和表達(dá)量對(duì)于外界環(huán)境變化的響應(yīng)程度相對(duì)更高.3)在低pH土壤上，碳源添加對(duì)nosZ基因數(shù)量和表達(dá)量存在抑制作用，且碳源濃度越高抑制作用越強(qiáng)；在高pH土壤上，低葡萄糖處理下，碳源的刺激作用占主導(dǎo)地位；高葡萄糖處理下，碳源引起的pH變化的抑制作用占主導(dǎo).本研究有助于理解稻田外源有機(jī)物輸入對(duì)土壤反硝化過程的影響機(jī)制，為稻田氧化亞氮減排措施的實(shí)施與評(píng)估提供理論依據(jù).