邱添，李泰平，肖紅，劉衛(wèi)國，康冰，楊寧

帕金森病(PD)是常見的老年人運(yùn)動障礙，由大腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性引起[1]，主要特征有運(yùn)動遲緩、靜止性震顫、肌強(qiáng)直和姿勢平衡障礙[2-3]。目前治療首選藥為左旋多巴，但長期使用會導(dǎo)致療效降低，不良反應(yīng)增加。近年來，中醫(yī)藥療法逐漸增加。PD在中醫(yī)歸屬“顫證”范疇，病理性質(zhì)總屬于本虛標(biāo)實(shí)，本虛為肝腎虧損，臟腑功能失調(diào)；標(biāo)實(shí)為風(fēng)火痰瘀毒互結(jié)，阻塞腦竅?；谠摬C(jī)認(rèn)識，總結(jié)出熟地平顫方，補(bǔ)腎平肝，取得了滿意的療效[4-5]。但該方治療PD的主要活性成分及作用機(jī)制尚未闡明。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門最近興起的交叉學(xué)科，它將藥理學(xué)和生物信息學(xué)結(jié)合，通過“多成分、多靶點(diǎn)、多通路”全方位系統(tǒng)分析中藥治療相關(guān)疾病的作用機(jī)制。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，結(jié)合分子對接技術(shù)系統(tǒng)分析并探討熟地平顫方治療PD的主要活性成分及其分子作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 熟地平顫方活性成分的篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)(https://www.tcmsp-e.com/)，以口服生物利用度(OB)≥30%、藥物相似度(DL)≥0.18、藥物半衰期(HL)≥4 h[6]且血-腦屏障(BBB)≥-0.3[7]，篩選出熟地平顫方中的主要活性成分。應(yīng)用TCM@TAIWAN臺灣中醫(yī)藥資料庫(http://tcm.cmu.edu.tw/index.php)查詢其他中藥活性成分，然后應(yīng)用SwissADME平臺(http://www.swissadme.ch/index.php)獲得化合物ADME數(shù)據(jù)，設(shè)置參數(shù)腸胃道吸收(GI absorption)為“High”，BBB為“Yes”進(jìn)行篩選[8]。

1.2 熟地平顫方活性成分的作用靶點(diǎn)預(yù)測 將該方活性成分通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)獲得化合物的2D化學(xué)結(jié)構(gòu)SDF格式文件，然后輸入Swiss Target Prediction平臺(http://www.swisstargetprediction.ch)，物種選擇“人類(Homo sapiens)”，預(yù)測該方活性成分的潛在作用靶點(diǎn)(Probability>0)。

1.3 熟地平顫方治療PD作用靶點(diǎn)的預(yù)測 應(yīng)用GeneCards(https://www.genecards.org)和DisGeNET(https://www.disgenet.org/home)疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫以“Parkinson Disease”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，將收集的疾病靶基因與活性成分作用靶點(diǎn)應(yīng)用VENNY 2.1進(jìn)行對比(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)，獲得中藥活性成分和PD共同靶基因。

1.4 熟地平顫方治療PD的靶蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org，Version 11.0)輸入收集的共同靶基因，設(shè)置物種為“人類(Homo sapiens)”，最低相互作用閾值為中度信度(Confidence 0.4)，其余參數(shù)保持默認(rèn)，獲取靶蛋白相互作用的數(shù)據(jù)，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)。通過Cytoscape 3.9.0軟件構(gòu)建熟地平顫方的中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 基因本體論(GO)功能富集和京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(KEGG)通路富集分析 將上述有效成分與PD共同靶基因通過Metascape在線基因注釋平臺(https://metascape.org/gp/index.html)進(jìn)行GO和KEGG富集分析。通過GO收集靶標(biāo)基因或蛋白質(zhì)的分子功能(MF)、細(xì)胞組分(CC)及其相關(guān)的生物學(xué)反應(yīng)(BP)，進(jìn)一步對相關(guān)基因功能進(jìn)行描述。同時KEGG富集收集靶點(diǎn)所涉及的信號通路，以P<0.01為條件進(jìn)行篩選，并結(jié)合DisGeNET富集分析，進(jìn)一步研究熟地平顫方抗PD的主要作用機(jī)制，分析數(shù)據(jù)應(yīng)用clusterProfiler軟件以柱狀圖或氣泡圖可視化展示。

1.6 分子對接 利用分子對接技術(shù)揭示熟地平顫方治療PD的主要有效成分及其相關(guān)作用靶基因。相關(guān)基因蛋白的晶體結(jié)構(gòu)取自RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫(PDB，https://www.rcsb.org/)。應(yīng)用PyMOL軟件去除水和小分子配體的同時，加入氫并進(jìn)行電荷平衡。應(yīng)用Chem 3D軟件將活性成分的SDF格式轉(zhuǎn)換成MOL2格式。批量分子對接采用iGEMDOCK 2.1軟件，默認(rèn)參數(shù)，結(jié)果以EXCEL色階圖展示。采用結(jié)合能來評估成分與靶點(diǎn)的結(jié)合能力，結(jié)合能<0表明可以自由結(jié)合，結(jié)合能越低表明受體與配體之間的親和力越大，二者發(fā)生相互作用的可能性就越高。

2 結(jié) 果

2.1 中藥活性成分和作用靶點(diǎn)預(yù)測 以O(shè)B≥30%，DL≥0.18，HL≥4 h以及BBB≥-0.3為篩選條件篩選出熟地平顫方主要活性成分(表1)，以腸胃道吸收為“high”，BBB為“yes”條件篩選出天麻主要活性成分(表2)。共得到29個主要活性成分及504個預(yù)測作用靶點(diǎn)。其中作用靶點(diǎn)超過30個的活性成分包括天麻中的蘇齊內(nèi)酯(CID132350840)、4-(4′-羥芐氧基)芐基甲醚(CID5318157)和香茅醛(CID7794)，天南星中8,11,14-二十二碳三烯酸甲酯(CID536-4473)，枸杞子中的阿托品(CID637577)和亞油酸乙酯(CID5282184)，其交集的靶點(diǎn)數(shù)分別是44、40、34、42、35和34。

表1 熟地平顫方主要活性成分基本信息(TCMSP數(shù)據(jù)庫)

表2 天麻主要活性成分信息(TCM@TAIWAN臺灣中醫(yī)藥資料庫)

2.2 治療PD共同靶點(diǎn)的收集 見圖1。使用Gene-Cards和DisGeNET疾病數(shù)據(jù)庫分別檢索到7 722個和2 078個PD相關(guān)基因靶點(diǎn)，將活性成分504個作用靶點(diǎn)與該疾病的靶點(diǎn)進(jìn)行對比，獲得178個共同靶點(diǎn)。

圖1 熟地平顫主要中藥活性成分作用靶點(diǎn)-PD靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 共同靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過STRING數(shù)據(jù)庫分析178個映射獲得PD的交集靶點(diǎn)，構(gòu)建熟地平顫方抗PD的PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)。中藥成分和作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0軟件構(gòu)建熟地平顫方的中藥-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)。借助軟件內(nèi)置計算工具計算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征值參數(shù)，節(jié)點(diǎn)度值≥60獲得熟地平顫方治療PD最相關(guān)的11個基因，包括AKT1、ALB、MAPK3、CASP3、APP、EGFR、MAPK1、MAPK8、HSP90AA1、PTGS2和STAT3，見表3。

表3 熟地平顫方治療PD主要作用的相關(guān)基因

2.4 GO功能富集分析 見圖4。以P<0.01為篩選條件，活性成分篩選出參與藥效的主要BP包括化學(xué)突觸傳遞的調(diào)節(jié)、跨突觸信號的調(diào)節(jié)、細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)、神經(jīng)元凋亡和絲氨酸肽基修飾等，主要CC包括神經(jīng)元胞體、膜筏、膜微區(qū)、突觸前和突觸膜等，MF主要包括調(diào)控絲氨酸/蘇氨酸及酪氨酸蛋白激酶活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、肽鏈內(nèi)切酶活性和銨離子結(jié)合等功能。

2.5 KEGG通路富集分析 KEGG富集分析顯示，主要信號通路包括神經(jīng)活動配體-受體相互作用、cAMP信號通路、雌激素信號通路和磷脂酶D信號通路等(圖5)。此外，熟地平顫方在細(xì)胞凋亡、內(nèi)分泌抵抗、自噬等方面發(fā)揮作用，還可治療Alzheimer’s病(AD)、脂質(zhì)代謝紊亂和動脈粥樣硬化、胰腺癌和前列腺癌等，但目前未見相關(guān)報道。DisGeNET功能富集顯示熟地平顫方廣泛參與認(rèn)知障礙、淀粉樣變性、記憶缺陷、神經(jīng)痛和成癮行為等方面的改善(圖6)。

2.6 分子對接結(jié)果 通過STRING數(shù)據(jù)庫和Cytos-cape軟件獲得潛在靶蛋白AKT1、ALB、MAPK3、CAS-P3、APP、EGFR、MAPK1、MAPK8、HSP90AA1、PTG-S2和STAT3，從RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫獲取其晶體結(jié)構(gòu)作為結(jié)合受體。以熟地平顫方中篩選出的29個活性成分為配體，以左旋多巴為對照，應(yīng)用iGEMDOCK軟件以默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行批量對接。結(jié)果顯示，CID 246983(Lan-osterol，羊毛甾醇)、CID 5997(Cholesterol，膽固醇)與PTGS2、CID 9548595(Sitosterol alpha1，α1-谷甾醇)與ALB結(jié)合能量值分別為-124.04 kcal/mol、-123.77 kcal/mol和-122.08 kcal/mol，均低于-120 kcal/mol且低于左旋多巴與相應(yīng)蛋白的結(jié)合能值，見表4。

表4 潛在靶蛋白與熟地平顫方主要活性成分對接結(jié)果(kcal/mol)

3 討 論

3.1 熟地平顫方有效成分和潛在靶點(diǎn)探討

PD常見于中老年人，可導(dǎo)致生活質(zhì)量下降以及照護(hù)負(fù)擔(dān)增加[9]。長期臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，熟地平顫方主以滋補(bǔ)肝腎、通絡(luò)解毒，可以改善PD的臨床癥狀、延緩該病進(jìn)展[10]。熟地平顫方由熟地黃、枸杞子、桑寄生、白芍、天麻、僵蠶、莪術(shù)、生天南星、全蝎、蜈蚣組成，以滋補(bǔ)肝腎、通絡(luò)解毒立法，諸藥合用，共奏滋肝補(bǔ)腎，搜風(fēng)解毒，有通絡(luò)散結(jié)之功[11]。本研究經(jīng)過篩選共獲得該方29種主要活性成分，504個潛在作用靶點(diǎn)，其中枸杞子的有效成分和作用靶點(diǎn)最多。作用靶點(diǎn)數(shù)量較多的活性成分有天麻中的蘇齊內(nèi)酯、4-(4′-羥芐氧基)芐基甲醚和香茅醛，天南星中的8,11,14-二十二碳三烯酸甲酯，枸杞子中的阿托品和亞油酸乙酯等，這些主要活性成分可能在治療過程中發(fā)揮重要作用。熟地平顫方29種主要活性成分治療PD最相關(guān)的11個基因中AKT1[12-13]、MAPK1[12，14]、STAT3[12，15]、MAPK8[16]、EGFR[17]、APP[18]、HSP90AA1[19]、PTGS2[20]和ALB[21]已被證實(shí)與PD密切相關(guān)。

分子對接結(jié)果顯示，羊毛甾醇和膽固醇與PTGS2蛋白、α1-谷甾醇與ALB蛋白具有更緊密的親和力。最新研究[22]也表明，PD發(fā)生與膽固醇存在密切關(guān)聯(lián)。相關(guān)研究[23-24]發(fā)現(xiàn)，膽固醇可以通過p38依賴機(jī)制影響流體剪切力(FSS)介導(dǎo)的COX-2表達(dá)，COX-2受PTGS2基因調(diào)控，因此膽固醇可調(diào)控PTGS2影響PD病程。劉立嬌等[25]研究發(fā)現(xiàn)，血清白蛋白與PD病情的嚴(yán)重程度相關(guān)，但α1-谷甾醇與白蛋白作用影響PD還未見相關(guān)研究。

3.2 熟地平顫方潛在作用機(jī)制探討

3.2.1 神經(jīng)活動配體-受體相互作用 PD基因組學(xué)研究[26-27]發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)活動配體-受體相互作用是影響PD最可能相關(guān)的通路之一。PD病理特征包括黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡和路易體神經(jīng)元內(nèi)聚集。α-突觸核蛋白(α-syn)作為路易小體的主要組成部分，通過聚集成不溶絲狀體參與PD的發(fā)病。研究[28]發(fā)現(xiàn)，α-syn可通過神經(jīng)活動配體受體相互作用通路誘導(dǎo)微小RNA的失調(diào)產(chǎn)生神經(jīng)毒性導(dǎo)致PD。α-syn與AD和PD密切相關(guān)[29-30]。AD主要是淀粉樣蛋白-β(Aβ)通過突觸蛋白的丟失來觸發(fā)突觸損傷；α-syn在PD神經(jīng)元中聚集導(dǎo)致突觸損傷[31]。因此，AD與PD具有共同的生理和病理聯(lián)系，神經(jīng)活動配體-受體相互作用是他們共有的通路之一[32]。KEGG通路富集分析顯示，熟地平顫方也能發(fā)揮治療AD作用，這與上述研究也相符合。

3.2.2 cAMP信號通路 在大腦中，cAMP與學(xué)習(xí)、記憶過程和其他大腦功能密切相關(guān)。作為第二信使，其主要的下游效應(yīng)因子是蛋白激酶A(PKA)[33]。研究[34]發(fā)現(xiàn)，抑制微小RNA-200a可上調(diào)紋狀體多巴胺受體D2的表達(dá)，通過cAMP/PKA通路抑制PD模型大鼠紋狀體的凋亡。Zheng等[35]從白芍提取的芍藥總糖苷(TG)可通過cAMP/PKA通路增加DA的生成治療PD。此外，Ca2+和cAMP信號通路還控制著神經(jīng)遞質(zhì)/激素的釋放和神經(jīng)元的死亡，其與糖尿病[36]和抑郁癥[37]也密切相關(guān)。KEGG通路富集分析顯示，熟地平顫方主要通過該信號通路發(fā)揮改善PD患者早期癥狀的作用。通過第二信使(如cAMP、Ca2+等)激活催化蛋白激酶從ATP轉(zhuǎn)移出磷酸并共價結(jié)合到特定蛋白質(zhì)分子中激活絲氨酸/蘇氨酸及酪氨酸蛋白激酶，從而改變蛋白質(zhì)、酶的構(gòu)象和活性，在突觸前和突觸區(qū)域調(diào)控化學(xué)突觸傳遞、跨突觸信號和鈣離子穩(wěn)態(tài)等[38]，這與GO功能富集分析也相吻合。

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，PD缺失多巴胺會阻礙運(yùn)動，主要通過誘發(fā)基底核直接(dSPNs)或者非直接(iSPNs)通路中紋狀體棘突投射神經(jīng)元分別發(fā)生活動減退或者過度活動來完成。多巴胺D1受體可激活腺苷酸環(huán)化酶、促使形成cAMP，而D2受體則相反，對立的不平衡會導(dǎo)致運(yùn)動機(jī)能異常。臨床常用多巴胺前體左旋多巴(L-DOPA)治療PD造成的這種運(yùn)動障礙。研究[39]發(fā)現(xiàn)，L-DOPA或者D2受體激動劑逆轉(zhuǎn)這些異常情況的效果比D1多巴胺受體激動劑的效果更好。但長期每日服用左旋多巴往往會導(dǎo)致左旋多巴誘導(dǎo)的運(yùn)動障礙，其與紋狀體的主要神經(jīng)元中棘神經(jīng)元中cAMP信號級聯(lián)的失調(diào)密切相關(guān)[40]。劉玉濤等[5]發(fā)現(xiàn)，熟地平顫湯聯(lián)合復(fù)方L-DOPA可顯著提高臨床療效，有效改善PD癥狀的同時延緩了PD進(jìn)程。動物實(shí)驗(yàn)[41]也表明，熟地平顫方可有效減輕黑質(zhì)多巴胺能細(xì)胞損傷，改善PD大鼠震顫麻痹行為。

3.2.3 雌激素信號通路 女性PD發(fā)病率逐年增加，尤其是絕經(jīng)期后，提示雌激素在PD發(fā)病中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[42]。研究[43-44]發(fā)現(xiàn)，雌激素替代療法可以明顯改善PD和癡呆的癥狀。Qin等[45]研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素-7-O-葡萄糖苷可通過雌激素受體介導(dǎo)的信號通路有效保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元免受1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)或1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用。本研究中雌激素信號通路也是熟地平顫方干預(yù)PD的通路之一，但目前還未見相關(guān)研究。

3.2.4 磷脂酶D信號通路 磷脂酶D屬于磷脂酶超家族，廣泛分布于原核生物和真核生物中。它催化甘油磷脂底物的磷酸二酯鍵水解，生成磷脂酸和膽堿、乙醇胺、絲氨酸等親水基團(tuán)等產(chǎn)物。磷脂酶D可促進(jìn)細(xì)胞增殖、發(fā)炎、病毒感染，并在神經(jīng)退行性疾病、人類癌癥和植物應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮作用[46]。Conde等[47]研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酶D激活與氧化誘導(dǎo)的突觸損傷密切相關(guān)，在神經(jīng)元退行性病變中起到非常重要的作用，下調(diào)磷脂酶D1可能為野生型α-syn觸發(fā)的神經(jīng)退行性病變初始階段的早期機(jī)制。此外，磷脂酶D2活性的調(diào)節(jié)在PD的進(jìn)展中也舉足輕重，磷脂酸(磷脂酶D2的產(chǎn)物)作為多種細(xì)胞途徑的第二信使可能是磷脂酶D2誘導(dǎo)神經(jīng)退行性病變的關(guān)鍵[48]。本研究中熟地平顫方是否通過調(diào)節(jié)磷脂酶D的活性發(fā)揮抗PD的作用還需進(jìn)一步研究證實(shí)。

3.2.5 其他 PD病理特征包括黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡和路易體神經(jīng)元內(nèi)聚集。α-syn通過聚集成不溶絲狀體導(dǎo)致突觸損傷，進(jìn)而導(dǎo)致PD[49]。相關(guān)研究[11]證明，熟地平顫方可通過抑制α-syn過表達(dá)，減少黑質(zhì)多巴胺能細(xì)胞的損傷，可有效緩解PD癥狀。DisGeNET富集分析揭示，熟地平顫方廣泛參與了認(rèn)知障礙、淀粉樣變性、記憶缺陷等方面的改善，因此熟地平顫方可全方位改善PD臨床相關(guān)癥狀。此外分析結(jié)果提示，熟地平顫方還可用于治療脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、胰腺癌和前列腺癌等，但目前還未見相關(guān)報道。

3.3 總結(jié)

綜上所述，本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合分子對接技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)熟地平顫方可能通過羊毛甾醇、膽固醇、α1-谷甾醇等關(guān)鍵成分作用于PTGS2、ALB、AKT1等靶點(diǎn)，主要通過神經(jīng)活動配體-受體相互作用、cAMP、雌激素、磷脂酶D等信號通路發(fā)揮治療PD的作用，初步揭示該方通過多成分、多靶點(diǎn)及多通路影響PD進(jìn)程，為其進(jìn)一步研究提供了新的方向。