基于生物信息學(xué)的肝內(nèi)膽管癌差異表達(dá)基因譜中關(guān)鍵基因的篩選及分析

陳偉毅，陳立軍

（湖南醫(yī)藥學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖南懷化418000）

肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是指起源于肝內(nèi)膽管上皮的一種惡性腫瘤。ICC 約占肝臟原發(fā)惡性腫瘤的10%~15%，是發(fā)病率僅次于肝細(xì)胞肝癌的肝臟原發(fā)惡性腫瘤[1]。ICC 早期往往無典型臨床癥狀，大多數(shù)患者確診時往往已失去了手術(shù)的機(jī)會，而未行手術(shù)治療者，預(yù)后極差[2]。因此對ICC 的早期診斷對于改善患者的預(yù)后具有重要意義。

目前臨床上診斷ICC 所使用的腫瘤標(biāo)記物特異度及敏感度欠缺，診斷價值很低[3]，尋找新的具有臨床診斷價值的潛在生物標(biāo)志物對提高ICC 患者的早期診斷率具有重要作用。

隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，二代測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于探索腫瘤新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[4]?，F(xiàn)今研究[5]表明，基因組的不穩(wěn)定性以及變異性可能會對ICC 的發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生影響。本研究通過生物信息學(xué)方法篩選ICC 的關(guān)鍵調(diào)控基因，評估關(guān)鍵調(diào)控基因?qū)CC 的預(yù)測能力，為診斷和治療ICC 患者提供新的思路，為深入認(rèn)識ICC 疾病提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 原始數(shù)據(jù)下載

從公共數(shù)據(jù)庫GEO 中下載2個ICC 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，編號分別為GSE107943 和GSE119336。數(shù)據(jù)集信息、檢測平臺以及樣本分類等信息具體見表1。

表1 ICC轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息和樣本分類Table 1 ICC transcriptome data information and sample classification

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)預(yù)處理過程 GSE107943 數(shù)據(jù)集預(yù)處理過程：⑴使用MAP-R Seq 管道進(jìn)行分析RNA 測序樣本。⑵采用bowtie1 軟件進(jìn)行選項比對，雙端讀段由TopHatv2 對比人類參考基因組hg19后構(gòu)建。⑶使用FeatureCounts 軟件量化基因表達(dá)，每個樣本的映射讀段與ENSEMBL 的GRCh37.75 RNA 特征參考基因定義文件對齊，然后量化。⑷將與每個RNA 特征對齊的原始讀取數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化為RPKM值。GSE119336 數(shù)據(jù)集預(yù)處理過程：⑴測序讀段被修剪為適配器序列，屏蔽低復(fù)雜性或低質(zhì)量序列。⑵使用TopHat （v2.0.10） 將序列與人類參考基因組（hg19 版本）和RefSeq 注釋基因進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄本剪接位點(diǎn)。⑶根據(jù)TopHat 生成的基因圖譜，使用Cufflinks （v2.1.1） 評估基因表達(dá)水平。⑷將每個基因的表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為FPKM 值，以便于樣本之間的轉(zhuǎn)錄水平比較。

1.2.2 差異表達(dá)基因篩選 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)預(yù)處理后，采用R 語言的edgeR 包對ICC 組織和正常組織進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選，設(shè)置校正P<0.01 且|log2FC|≥2為閾值條件。

1.2.3 差異表達(dá)基因的GO 和KEGG 富集分析 使用R 語言 的clusterProfiler、org.Hs.eg.db程序包對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 功能（包括生物學(xué)過程BP、細(xì)胞組分CC、分子功能MF）和KEGG 通路富集分析，并將TOP5 的顯著富集結(jié)果以氣泡圖展示。

1.2.4 差異表達(dá)基因的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（Protein-Protein Interaction，PPI）Networks 構(gòu)建與關(guān)鍵模塊挖掘 采用STRING 數(shù)據(jù)庫（https://www.string-db.org）對差異表達(dá)基因進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，設(shè)置combined score>0.9 為閾值條件，然后使用Cytoscape 軟件對其進(jìn)行可視化。采用Cytoscape 軟件中的MCODE 插件對PPI 網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行辨別，并從中挖掘出關(guān)鍵調(diào)控基因，設(shè)置參數(shù)為：Degree Cutoff=2，Node Score Cutoff=0.2，Max. Depth=100，K-Core=2。

1.2.5 關(guān)鍵調(diào)控基因的表達(dá)分析與驗證 通過SPSS26.0 分析關(guān)鍵調(diào)控基因在ICC 組織和正常組織中的表達(dá)，分析方法采用獨(dú)立樣本t檢驗，采用UALCAN、GEPIA 數(shù)據(jù)庫對基因表達(dá)進(jìn)行驗證。

1.2.6 關(guān)鍵調(diào)控基因的泛癌表達(dá)分析 在UCSC XENA 數(shù)據(jù)庫（https://xenabrowser.net/datapages）下載經(jīng)統(tǒng)一處理的TCGA 和GTEx 的RNAseq 數(shù)據(jù)，使用R 語言的ggplot2 包對關(guān)鍵調(diào)控基因進(jìn)行泛癌表達(dá)分析。

1.2.7 關(guān)鍵調(diào)控基因在ICC 中的共表達(dá)基因分析、PPI 網(wǎng)絡(luò)分析、富集分析 在TCGA 數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov）下載膽管癌RNAseq 數(shù)據(jù)，使用R 語言的stat 包分析編碼基因與關(guān)鍵調(diào)控基因的相關(guān)系數(shù)，選取相關(guān)系數(shù)TOP10 的編碼基因進(jìn)行可視化。采用STRING 數(shù)據(jù)庫對相關(guān)系數(shù)TOP10 的編碼基因和關(guān)鍵調(diào)控基因進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，利用Metasacape 網(wǎng) 站（http://metascape.org）進(jìn)行富集分析。

1.2.8 關(guān)鍵調(diào)控基因的表達(dá)與腫瘤分期、分級、淋巴轉(zhuǎn)移、預(yù)后關(guān)系的分析 利用UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析關(guān)鍵調(diào)控基因與腫瘤分期、分級、淋巴轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。利用GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析關(guān)鍵調(diào)控基因與患者預(yù)后的相關(guān)性。

1.2.9 關(guān)鍵調(diào)控基因表達(dá)對ICC 免疫細(xì)胞浸潤的影響分析 在TCGA 數(shù)據(jù)庫下載膽管癌RNAseq 數(shù)據(jù)，使用R 語言GSVA 包計算免疫浸潤相關(guān)性及顯著性。

1.2.10 繪制ROC 曲線評價關(guān)鍵調(diào)控基因?qū)CC 的診斷能力 使用Graphpad 8.0 軟件繪制受試者工作特征曲線（ROC 曲線）。ROC 曲線下面積（AUC）越接近于1.0，其診斷效果越好。

1.2.11 細(xì)胞及培養(yǎng) 人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞（HIBEC）購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞（RBE）購于中科院上海細(xì)胞庫，兩種細(xì)胞株均采用含10% 的胎牛血清的RPMI 1640，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2孵箱中，每48 h 進(jìn)行消化傳代。

1.2.12 RT-qPCR 檢測mRNA 表達(dá) 采用TRIzol 法（美國Invitrogen 公司）提取細(xì)胞總RNA，用分光光度計檢測RNA 濃度，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa 公 司） 將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然 后 用SYBR Green 法（美國Thermo Fisher 公司）進(jìn)行實時熒光定量PCR，以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達(dá)量。Polo 樣激酶1 （Pololike Kinase, PLK1）上游引物：5'-GCT GGG CAA CCT TTT CCT G-3'，下游引物：5'-CCA GTG GGA TCT GTC TGA AGC-3'；羥基酸氧化酶（hydroxyacid oxidase 2，HAO2）上游引物：5'-TGA CAG ACT TTC AGG CCC AT-3'，下游引物：5'-CAC TGA TCT CCT CCC CTT GG-3'；纖維膠凝蛋白（ficolin-2，F(xiàn)CN2）上游引物：5'-CTG CCA TGT GT CAA ACC TGA A-3'，下游引物：5'-TTC CCC GAC TTC CAG TTG ATG-3'；GAPDH 上游引物：5'-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3'，下游引物：5'-GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG-3'。

1.2.13 Western blot 檢測蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞蛋白，采用BCA 法測量蛋白濃度，每組取60 g 蛋白樣品進(jìn)行電泳，之后將蛋白轉(zhuǎn)移到PDVF 膜上，5%脫脂奶粉封閉后加入一抗4 ℃孵育過夜，再加入二抗孵育2 h，曝光顯影，以GAPDH 為內(nèi)參計算蛋白相對表達(dá)量。PLK1、HAO2、FCN2、GAPDH 抗體均購自美國Abcam 公司。

2 結(jié) 果

2.1 ICC差異表達(dá)基因分析結(jié)果

采用R 語言的edgeR 包對兩個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，設(shè)置校正P<0.01 且|log2FC|≥2 為閾值條件。GSE107943 數(shù)據(jù)集中共篩選出2 242個（3.88%）差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因1 320個，下調(diào)基因922個（圖1A）。GSE119336 數(shù)據(jù)集中共篩選出1 663個（6.50%） 差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因904個，下調(diào)基因759個（圖1B）。兩個數(shù)據(jù)集共同的差異表達(dá)基因為1 123個（圖1C），其中有567個基因為共同上調(diào)基因（圖1D），527個基因為共同下調(diào)基因（圖1E）。表2 羅列了2個數(shù)據(jù)集中差異表達(dá)最大的5個共同上調(diào)和共同下調(diào)基因。共同上調(diào)和共同下調(diào)的基因共1 094個。在ICC 的發(fā)生機(jī)制中這1 094個差異表達(dá)基因可能起著非常重要的作用，故后續(xù)分析都根據(jù)此。

圖1 ICC差異表達(dá)基因的分析結(jié)果 A：GSE107943差異表達(dá)基因火山圖；B：GSE119336差異表達(dá)基因火山圖；C：兩個數(shù)據(jù)集共同差異表達(dá)基因Venn圖；D：兩個數(shù)據(jù)集共同上調(diào)基因Venn圖；E：兩個數(shù)據(jù)集共同下調(diào)基因Venn圖Figure 1 Results of analysis of differentially expressed genes in ICC A: Volcano map of GSE107943; B: Volcano map of GSE119336; C: Venn diagram of differentially expressed genes both in GSE107943 and GSE119336; D: Venn diagram of up-regulated differentially expressed genes;E:Venn diagram of down-regulated differentially expressed genes

表2 兩個數(shù)據(jù)集中差異表達(dá)最大的5個共同上調(diào)和下調(diào)基因Table 2 The five co-up-regulated and co-down-regulated genes

2.2 ICC差異表達(dá)基因功能和通路富集分析

對1 094個差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 富集分析結(jié)果顯示：1 094個共同差異表達(dá)基因主要參與BP 的小分子分解代謝、有機(jī)酸生物合成、羧酸生物合成、羧酸分解代謝、有機(jī)酸分解代謝等過程（圖2A）；CC 主要與含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞頂端、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔、頂端質(zhì)膜、血液微粒等有關(guān)（圖2B）；MF 主要與酶結(jié)合、硫化合物結(jié)合、羧酸結(jié)合、維生素結(jié)合、單加氧酶活性等有關(guān)（圖2C）。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，1 094個共同差異表達(dá)基因主要參與碳代謝、補(bǔ)體與凝血級聯(lián)、氨基酸生物合成、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝等（圖2D）。

圖2 ICC共同差異表達(dá)基因的功能和通路富集 A：共同差異表達(dá)基因的GO—BP富集；B：共同差異表達(dá)基因的GO—CC富集；C：共同差異表達(dá)基因的GO—MF富集；D：共同差異表達(dá)基因的KEGG通路富集Figure 2 GO and KEGG enrichment of common differentially expressed genes in ICC A: GO—BP enrichment; B: GO—CC enrichment;C:GO—MF enrichment;D:GO—BP enrichment

2.3 ICC 差異表達(dá)基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)分析及關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)分析

采用STRING 數(shù)據(jù)庫對1 094個共同差異表達(dá)基因進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，使用Cytoscape 進(jìn)行可視化，該P(yáng)PI 網(wǎng)絡(luò)共有451個節(jié)點(diǎn)和1288 條邊（圖3）。使用MCODE 插件一共篩選出17個關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)，取得分最高的前3個子網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析（表3）（圖4），從中挖掘出3個關(guān)鍵調(diào)控基因PLK1、HAO2、FCN2（表4）。

圖3 ICC差異表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)Figure 3 PPI network of the differentially expressed genes in ICC

表3 得分前三的子網(wǎng)絡(luò)模塊信息Table 3 Information of the top 3 sub-network modules

圖4 ICC差異表達(dá)基因PPI網(wǎng)絡(luò)中3個關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)Figure 4 Three key subnetworks in ICC differential expression gene PPI network

表4 關(guān)鍵蛋白調(diào)控功能基因節(jié)點(diǎn)信息Table 4 Node information of the key genes

2.4 關(guān)鍵調(diào)控基因表達(dá)分析及驗證

采用獨(dú)立樣本t檢驗比較ICC 組織和正常肝臟組 織 中PLK1、HAO2、FCN2 表達(dá)，ICC組織中PLK1 表達(dá)明顯高于正常組織，HAO2、FCN2 表達(dá)明顯低于正常組織，差異均有顯著性（均P<0.001）（圖5A）。結(jié)果表明PLK1 在ICC 中呈高表達(dá)、HAO2、FCN2 在ICC 中呈低表達(dá)。利用UALCAN 中的TCGA 數(shù)據(jù)庫對3個基因在ICC 中的表達(dá)進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)PLK1 在ICC 中高表達(dá)，HAO2、FCN2 在ICC 中低表達(dá)，與分析結(jié)果一致（圖5B）。利用GEPIA 數(shù)據(jù)庫對3個基因的表達(dá)進(jìn)行驗證，發(fā)現(xiàn)PLK1 在ICC 中高表達(dá)，HAO2、FCN2 在ICC 中低表達(dá)，與分析結(jié)果也是一致的（圖5C）。

圖5 關(guān)鍵調(diào)控基因的表達(dá)分析及驗證 A：PLK1、HAO2、FCN2在ICC組織和正常組織中的表達(dá)差異；B：PLK1、HAO2、FCN2在UALCAN數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)差異；C：PLK1、HAO2、FCN2在GEPIA數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)差異Figure 5 Expression analysis and validation of the key regulatory genes A: The expression differences of PLK1, HAO2 and FCN2 between ICC and normal tissues; B: The expression differences of PLK1, HAO2 and FCN2 in UALCAN database;C:The expression differences of PLK1,HAO2 and FCN2 in GEPIA database

2.5 關(guān)鍵調(diào)控基因在腫瘤中的表達(dá)分析

采用UCSC XENA 數(shù)據(jù)庫分析PLK1、HAO2、FCN2 在腫瘤中的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)在33 種腫瘤中，PLK1 在28 種腫瘤表達(dá)明顯增高（圖6A），HAO2 在24 種腫瘤表達(dá)明顯降低（圖6B），F(xiàn)CN2 在27 種腫瘤表達(dá)明顯降低（圖6C）。

圖6 PLK1、HAO2、FCN2在腫瘤中的表達(dá)情況分析 A：PLK1在28/33種腫瘤中表達(dá)上調(diào)；B：HAO2在24/33種腫瘤中表達(dá)下調(diào)；C：FCN2在27/33種腫瘤中表達(dá)下調(diào)Figure 6 Analysis of the expressions of PLK1, HAO2 and FCN2 in tumors A: Up-regulation of PLK1 in 28/33 tumors;B:Down-regulation of HAO2 in 24/33 tumors;C:Down-regulation of FCN2 in 27/33 tumors

2.6 關(guān)鍵調(diào)控基因在ICC中的共表達(dá)基因分析

采用TCGA 數(shù)據(jù)庫分析關(guān)鍵調(diào)控基因在ICC 中的共表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)PLK1 與CCNA2、GTSE1 等基因共表達(dá)相關(guān)性最強(qiáng)（圖7A），HAO2 與MTTP、CPS1 等基因共表達(dá)相關(guān)性最強(qiáng)（圖7B），F(xiàn)CN2 與FAM99A、 GDF2 等基因共表達(dá)相關(guān)性最強(qiáng)（圖7C）。

圖7 關(guān)鍵調(diào)控基因在ICC中的共表達(dá)基因分析 A：PLK1共表達(dá)基因熱圖；B：HAO2共表達(dá)基因熱圖；C：FCN2共表達(dá)基因熱圖；D：共表達(dá)基因和關(guān)鍵基因的PPI網(wǎng)絡(luò)；E：共表達(dá)基因GO和KEGG富集分析Figure 7 Co-expression gene analysis of the key regulatory genes in ICC A: Heat map of PLK1 co-expressed genes; B: Heat map of HAO2 co-expressed genes; C: Heat map of FCN2 co-expressed genes; D: PPI network of co-expressed genes and key regulatory genes;E:GO and KEGG enrichment of co-expressed genes

利用STRINGS 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建共表達(dá)基因和關(guān)鍵基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)，該P(yáng)PI 網(wǎng)絡(luò)共有30個節(jié)點(diǎn)和110 條邊（圖7D）。采用Metascape 網(wǎng)站對共表達(dá)基因進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)共表達(dá)基因主要參與細(xì)胞分裂、補(bǔ)體激活、凝集素途徑、甘油三酯代謝過程等（圖7E）。

2.7 關(guān)鍵調(diào)控基因?qū)CC的發(fā)展、預(yù)后的影響分析

利用UALCAN 中的TCGA 數(shù)據(jù)庫分析關(guān)鍵調(diào)控基因?qū)CC 發(fā)展的影響。結(jié)果顯示，PLK1、HAO2、FCN2 表達(dá)與腫瘤分期、分級、淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，PLK1 表達(dá)越高、HAO2、FCN2 表達(dá)越低，腫瘤分期越高、分化越差、越易出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移（圖8A-C）。

圖8 關(guān)鍵調(diào)控基因?qū)CC發(fā)展、預(yù)后的影響 A：PLK1、HAO2、FCN2對腫瘤分級的影響；B：PLK1、HAO2、FCN2對腫瘤分期的影響；C：PLK1、HAO2、FCN2對腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移的影響；D：PLK1、HAO2、FCN2對患者預(yù)后的影響Figure 8 Effects of the key regulatory genes on the development and prognosis of ICC A: Effect of PLK1, HAO2, FCN2 on tumor grade; B: Effect of PLK1, HAO2, FCN2 on tumor stages; C: Effect of PLK1, HAO2, FCN2 on tumor nodal metastasis;E:Effect of PLK1,HAO2,FCN2 on prognosis of patients

利用GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析關(guān)鍵調(diào)控基因?qū)CC 患者預(yù)后的影響。結(jié)果顯示PLK1、HAO2、FCN2 與ICC 患者總體生存率無相關(guān)性（圖8D）。

2.8 關(guān)鍵調(diào)控基因表達(dá)對ICC免疫細(xì)胞浸潤的影響分析

分析關(guān)鍵調(diào)控基因表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PLK1 表達(dá)與Th2 細(xì)胞浸潤正相關(guān)性最大，與NK 細(xì)胞浸潤負(fù)相關(guān)性最大；HAO2 表達(dá)與中性粒細(xì)胞浸潤正相關(guān)性最大，與CD8 T 細(xì)胞浸潤負(fù)相關(guān)性最大；FCN2 表達(dá)與Tcm浸潤正相關(guān)性最大，與aDC 浸潤負(fù)相關(guān)性最大（圖9A）。

圖9 關(guān)鍵調(diào)控基因?qū)CC 免疫浸潤水平的影響 A：PLK1、HAO2、FCN2 表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性；B：PLK1表達(dá)與Th2細(xì)胞、NK細(xì)胞浸潤相關(guān)性；C：HAO2表達(dá)與中性粒細(xì)胞、CD8 T細(xì)胞浸潤相關(guān)性；D：FCN2表達(dá)與Tcm、aDC浸潤相關(guān)性Figure 9 Effect of key regulatory genes on ICC immune infiltration level A: Correlation between PLK1, HAO2, FCN2 expression and immune cell infiltration level; B: Correlation between PLK1 expression and Th2 cells as well as NK cell infiltration; C: Correlation between HAO2 expression and neutrophils as well as CD8 T cells infiltration; D: Correlation between FCN2 expression and Tcm as well as aDC

進(jìn)一步分析關(guān)鍵調(diào)控基因表達(dá)與正、負(fù)相關(guān)性最大細(xì)胞浸潤的顯著性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PLK1 表達(dá)與Th2 細(xì)胞浸潤呈顯著正相關(guān)（r=0.517，P=0.001），PLK1 表達(dá)與NK 細(xì)胞浸潤相關(guān)性不顯著（P=0.090）（圖9B）；HAO2 表達(dá)與CD8 T 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤相關(guān)性均不顯著（P=0.103，P=0.070）（圖9C）；FCN2 表達(dá)與Tcm 浸潤相關(guān)性不顯著（P=0.126），F(xiàn)CN2 表達(dá)與aDC 浸潤呈負(fù)相關(guān)（r=0.435，P=0.008）（圖9D）。

2.9 評估關(guān)鍵調(diào)控基因?qū)CC的診斷能力

繪制ROC 曲線評估關(guān)鍵調(diào)控基因診斷ICC 的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PLK1、HAO2、FCN2 3個基因?qū)CC 的AUC 值均>0.98，表明3個基因?qū)CC 均有較好的診斷能力，其中HAO2 的AUC 值最大，表明HAO2 診斷能力最 好。PLK1 聯(lián) 合HAO2 或FCN2 后AUC 值均為1.000，表明PLK1 聯(lián)合HAO2 或FCN2 對ICC 具有非常好的診斷能力。HAO2 和FCN2 聯(lián)合應(yīng)用后AUC 值為0.999 5，診斷能力略微下降。PLK1、HAO2 和FCN2 3個基因聯(lián)合應(yīng)用后AUC 值為1.000，表明3個基因聯(lián)合應(yīng)用同樣具有非常好的診斷能力（圖10）。

圖10 關(guān)鍵調(diào)控基因?qū)CC的診斷能力分析Figure 10 Diagnostic abilities of the key regulatory genes for ICC

2.10 關(guān)鍵調(diào)控基因在肝膽管癌細(xì)胞中的表達(dá)驗證

檢測關(guān)鍵調(diào)控基因在HIBEC 和RBE mRNA 和蛋白表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PLK1 mRNA 和蛋白在RBE 中表達(dá)顯著高于HIBEC （P<0.01，P<0.001），HAO2、FCN2 mRNA 和蛋白在RBE 系中表達(dá)顯著高低于HIBEC （P<0.01，P<0.001）（圖11）。實驗結(jié)果表明關(guān)鍵調(diào)控基因在細(xì)胞中表達(dá)差異與生物信息學(xué)分析結(jié)果一致。

圖11 關(guān)鍵調(diào)控基因在HIBEC 和RBE 表達(dá)差異 A：兩種細(xì)胞株P(guān)LK1、HAO2、FCN2 mRNA 表達(dá)差異；B：兩種細(xì)胞株P(guān)LK1、HAO2、FCN2蛋白表達(dá)差異Figure 11 Differential expression of key regulatory genes in HIBEC and RBE A: Differential expression of PLK1, HAO2,FCN2 mRNA in two cell lines;B:Differential expression of PLK1,HAO2,FCN2 protein in two cell lines

3 討 論

ICC 約占肝臟原發(fā)惡性腫瘤的10%~15%，近年來發(fā)病率呈上升趨勢[6]。由于缺乏特異典型的臨床表現(xiàn)和敏感可靠的診斷標(biāo)志物，多數(shù)ICC 患者被確診時已進(jìn)入晚期，因此急切面臨對ICC 分子機(jī)制的切實解析與探究[7-8]。本研究首先在GEO 數(shù)據(jù)庫中篩選出ICC 轉(zhuǎn)錄組層面的2個高通量數(shù)據(jù)集GSE107943 和GSE119336，從中篩選出3個關(guān)鍵調(diào)控基因PLK1、HAO2、FCN2。對關(guān)鍵調(diào)控基因表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PLK1 在ICC 組織中呈高表達(dá)，HAO2、FCN2 在ICC 組織中呈低表達(dá)。采用TCGA和GTex 數(shù)據(jù)庫聯(lián)合分析關(guān)鍵調(diào)控基因在泛癌中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PLK1 在28 種腫瘤顯著高表達(dá)，HAO2在24 種腫瘤顯著低表達(dá)，F(xiàn)CN2 在27 種腫瘤顯著呈低表達(dá)。通過UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析關(guān)鍵調(diào)控基因與ICC 腫瘤分級和分期、淋巴轉(zhuǎn)移的相關(guān)，發(fā)現(xiàn)PLK1 高表達(dá)、HAO2、FCN2 低表達(dá)提示分化差、分期高、易淋巴轉(zhuǎn)移。分析關(guān)鍵調(diào)控基因表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)PLK1 表達(dá)與Th2 細(xì)胞浸潤呈顯著正相關(guān)，F(xiàn)CN2 表達(dá)與aDC 浸潤呈顯著負(fù)相關(guān)。繪制ROC 曲線評估PLK1、HAO2、FCN2 對ICC 的診斷效果，發(fā)現(xiàn)3個基因?qū)CC 均有較好的診斷能力。采用細(xì)胞實驗驗證關(guān)鍵調(diào)控基因在ICC 中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在RBE 中PLK1 表達(dá)顯著上調(diào)，HAO2、FCN2 表達(dá)顯著下調(diào)。

PLK1 是一種高度保守的絲/蘇氨酸激酶，其在有絲分裂進(jìn)程中的重要作用已經(jīng)被闡明[9]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，PLK1 有誘導(dǎo)DNA 合成、DNA 完整性的檢修以及防止細(xì)胞凋亡方面的作用[10]。PLK1 還能通過磷酸化p53 而抑制其轉(zhuǎn)活性，進(jìn)而抑制p53 發(fā)揮檢驗點(diǎn)蛋白和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能[11]。另外，PLK1 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)PLK1在多種人類腫瘤中呈高表達(dá)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)PLK1在ICC 中的表達(dá)明顯高于正常組織，與上述研究結(jié)果一致。同時本研究發(fā)現(xiàn)PLK1 高表達(dá)與ICC 患者腫瘤分期、分級和淋巴轉(zhuǎn)移、免疫細(xì)胞浸潤有關(guān)，且對ICC 有較好的診斷能力，表明PLK1 有望成為ICC 診斷和治療的新靶點(diǎn)。

過氧化物酶體普遍存在于真核細(xì)胞內(nèi)，參與多種代謝途徑[13]。 羥基酸氧化酶（hydroxyacid oxidase，HAO）是過氧化物酶體中所包含的一類氧化酶，一共有3個亞型，其中HAO2 主要在肝臟和腎臟中表達(dá)[14]。研究[15-16]發(fā)現(xiàn)HAO2 在肝癌、腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)下降，與患者的不良預(yù)后相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)HAO2 在ICC 中表達(dá)同樣下降，且HAO2 低表達(dá)提示患者生存較差。HAO2 是催化含羥基的脂肪酸的酶類，直接參與脂肪酸的氧化分解過程，而腫瘤代謝的過程脂肪酸分解減少、合成增加[17]。本研究發(fā)現(xiàn)HAO2 在ICC 中低表達(dá)，提示ICC 可能通過降低HAO2 表達(dá)適應(yīng)其脂代謝重編程的需要，HAO2 可能是糾正ICC 代謝異常的一個潛在靶點(diǎn)。

FCN2 能夠與凝集素相關(guān)絲氨酸蛋白酶形成復(fù)合體，是少數(shù)能激活凝集素補(bǔ)體途徑的分子[18-19]。目前FCN2 研究多集中在感染性疾病，研究報道其單核苷酸多態(tài)性與肺結(jié)核、越南登革熱、意大利風(fēng)濕熱、風(fēng)濕性心臟病等疾病有關(guān)[20-23]。關(guān)于腫瘤方面只有少量報道，Yang 等[24]發(fā)現(xiàn)FCN2 在肝癌組織中呈表達(dá)下調(diào)，F(xiàn)CN2 低表達(dá)與肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)FCN2 在ICC 組織中同樣表達(dá)下降，與ICC 患者腫瘤分期、分級和淋巴轉(zhuǎn)移、免疫細(xì)胞浸潤等相關(guān)，提示FCN2 在ICC 中發(fā)揮重要作用，可能是ICC 的一個潛在的作用靶點(diǎn)。

免疫細(xì)胞在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞行為中發(fā)揮重要作用，越來越多的證據(jù)支持它們在預(yù)測許多癌癥類型的結(jié)果和治療效果方面的具有重要價值[25]。本研究分析了PLK1、HAO2、FCN2 基因表達(dá)與ICC 中各種腫瘤免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)PLK1 表達(dá)與Th2 cells 浸潤呈顯著正相關(guān)，F(xiàn)CN2 表達(dá)與aDC浸潤呈顯著負(fù)相關(guān)，因此PLK1 和FCN2 可能通過調(diào)節(jié)腫瘤免疫影響ICC 進(jìn)展。

本研究篩選出3個對ICC 具有診斷能力的基因，這3個基因在ICC 中均未見報道但在其他腫瘤中均有報道，且報道結(jié)果與本研究結(jié)果基本一致，表明本研究篩選結(jié)果具有較高的可信度。但是本研究也存在著以下不足。第一，該研究是通過生物信息學(xué)方法進(jìn)行的，只進(jìn)行了細(xì)胞實驗驗證，缺乏臨床試驗和動物實驗驗證，因此后續(xù)還需臨床試驗和動物實驗來進(jìn)一步驗證。第二，因為ICC自身的發(fā)生機(jī)制具有異質(zhì)性，而研究樣本數(shù)量是有限的，可能要依賴單細(xì)胞水平的下一代測序技術(shù)迅速發(fā)展來解決這一難題[26-27]。第三，由于ICC疾病在發(fā)生發(fā)展過程中受到多種因素影響[28-30]，只通過轉(zhuǎn)錄組層面來看的話，具有一定的片面性，本研究尚未把代謝組、基因組、蛋白質(zhì)組等多組學(xué)之間的數(shù)據(jù)信息進(jìn)行結(jié)合分析，多組學(xué)的數(shù)據(jù)信息是否有相關(guān)性還需進(jìn)一步探討。

綜上所述，本文通過生物信息學(xué)方法篩選出ICC 中3個關(guān)鍵調(diào)控基因PLK1、HAO2、FCN2，這3個基因?qū)CC 具有很好的診斷和預(yù)測能力，有可能成為ICC 潛在的治療靶點(diǎn)。本研究篩選出的3個關(guān)鍵調(diào)控基因在腫瘤中均有報道，研究結(jié)果具有較高的可信度，可以為深入理解ICC 的分子機(jī)制提供新的觀點(diǎn)和思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。