劉豪杰，陳雪蕾，包薩如拉

1.鄂州市中心醫(yī)院，湖北 鄂州 436000； 2.內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 通遼 028007

胃癌是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，雖近些年我國胃癌發(fā)病率呈逐年下降趨勢，但總體發(fā)病率仍高于世界平均水平[1]。中藥作為我國特有的衛(wèi)生資源，具有巨大的發(fā)掘潛力，白花蛇舌草、半枝蓮在臨床中常作為藥對進行配伍，增強清熱解毒、消癰散結(jié)的作用。高宏等在重建中氣抗癌湯Ⅰ號中應用白花蛇舌草-半枝蓮藥對觀察其對胃癌術后化療不良反應的作用發(fā)現(xiàn)，其可降低腫瘤術后復發(fā)率、改善患者腸道菌群[2]。乙酸乙酯可提取中藥中的有效成分，是藥理學研究中常用的有機溶劑和萃取劑，研究發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分對胃癌SGC-7901細胞增殖能力有抑制作用，在激發(fā)腫瘤細胞線粒體自噬的同時，誘導細胞線粒體凋亡[3]。腫瘤是一種細胞周期性疾病，細胞周期蛋白的異常表達，將導致細胞周期調(diào)控異常、細胞增殖失控，最終導致腫瘤的形成[4]。雖有研究證實白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分可抑制胃癌SGC-7901細胞增殖，但其對于細胞周期的影響鮮有報道。本研究擬從細胞周期變化及細胞周期關鍵蛋白表達角度著手，深入挖掘白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分對胃癌SGC-7901細胞周期的抑制作用。

1 材料

1.1 細胞人胃癌SGC-7901細胞，購自北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司，貨號：BNCC100674。

1.2 藥物與試劑白花蛇舌草(內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院中藥房，產(chǎn)地：河南，貨號：200620)；半枝蓮(內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院中藥房，產(chǎn)地：浙江，貨號：191022)。兔抗細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)多克隆抗體、兔抗c-Myc多克隆抗體及β-肌動蛋白(β-actin)多克隆抗體(英國Abcam公司，貨號：ab134175、ab185656、ab179467)；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)抗體(上海碧云天生物技術有限公司，貨號：A0208)；BCA 蛋白定量檢測試劑盒(上海源葉生物科技有限公司，貨號：R21250-250T)；結(jié)晶紫染色液(上海紫一試劑廠，貨號：100137)；CCK-8試劑盒(美國AbMole公司，貨號：a953268)；RNase A溶液(北京索萊寶科技有限公司，貨號：R1030)；碘化丙啶(propidium iodide，PI)(北京中科瑞泰生物科技有限公司，貨號：SP4170)。

1.3 儀器WD-9413B型凝膠成像系統(tǒng)(北京六一生物科技有限公司)；SD Cell型轉(zhuǎn)移電泳槽(美國Thermo Fisher Scientific公司)；VE-180型垂直電泳裝置(上海天能科技有限公司)；muLISKAN-MK3型酶標儀(美國Bio-Rad公司)；Waters ACQUITY型超高液相色譜儀(美國Waters公司)；FYL-YS-150L型恒溫箱(北京福意聯(lián)醫(yī)療設備有限公司)；TGL-21M型高速冷凍離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司，離心半徑：10 cm)；CytoFLEX型流式細胞儀(美國貝克曼公司)。

2 方法

2.1 白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分制備及檢測白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分制備方法參考文獻[5]，具體如下：將白花蛇舌草、半枝蓮按質(zhì)量比11取材后進行3次煎煮，無菌紗布過濾，獲得水提物，減壓濃縮得到浸膏。取適量浸膏用石油醚回流脫脂后，再以乙酸乙酯進行多次萃取，濃縮干燥后獲得白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分，并計算提取率。提取率=目標物質(zhì)質(zhì)量/原料物質(zhì)質(zhì)量×100%。白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分檢測：取白花蛇舌草-半枝蓮乙酸乙酯浸膏及對羥基苯乙酮、野黃芩苷、木犀草素、芹菜素標準品，加入1 mL甲醇，充分溶解后過濾、離心，采用超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)進行分析。UPLC色譜條件：柱溫 40 ℃，流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫(0～20 min，5%～95%乙腈；20～22 min，100%乙腈；22～25 min，100%C～5%乙腈)，該部分實驗由內(nèi)蒙古民族大學天然產(chǎn)物化學及功能分子合成重點實驗室完成。

2.2 SGC-7901細胞培養(yǎng)與分組取對數(shù)生長期胃癌SGC-7901細胞，胰蛋白酶消化后調(diào)整細胞密度為5×104mL-1，接種于96孔板，每孔100 μL，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。將細胞分為對照組及白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低、中、高劑量組，分別予以0 mg·L-1、10 mg·L-1、30 mg·L-1、50 mg·L-1白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分處理，每組設5個平行孔。5%CO2、37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞，每天換液1次，培養(yǎng)48 h后取對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。

2.3 CCK-8法檢測SGC-7901細胞增殖能力取對數(shù)生長期SGC-7901細胞，調(diào)整細胞濃度至5×104mL-1，接種于96孔板，每孔100 μL，5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，按“2.2項”所述方法對細胞進行分組及藥物干預，培養(yǎng)12 h、24 h、48 h后每孔加入CCK-8試劑 10 μL，孵育2 h，每組設3個復孔，并設置空白孔3個。采用酶標儀在450 nm波長處檢測吸光度值。

細胞增殖抑制率=(對照組OD值-實驗組OD值)/(對照組OD值-空白孔OD值)×100%

2.4 平板細胞克隆形成實驗按“2.2項”所述方法對細胞進行分組及藥物干預，培養(yǎng)48 h后，將各組細胞分別制備成1.0×103L-1細胞懸液，接種于6孔板中，每孔1 mL，每組設3個復孔，5%CO2、37 ℃恒溫孵育箱中培養(yǎng)24 h后，棄除培養(yǎng)液，加入不含藥物的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)液，直至肉眼可見細胞集落形成。磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)清洗6孔板后加入甲醇溶液，固定20 min，PBS清洗，加入結(jié)晶紫染色液，固定5 min，PBS清洗后用 ImageJ 統(tǒng)計每孔克隆形成數(shù)，計算每組細胞的克隆形成率。

克隆形成率=(克隆數(shù)/接種細胞數(shù))×100%

2.5 流式細胞術檢測SGC-7901細胞周期按“2.2項”所述方法對細胞進行分組及藥物干預，培養(yǎng)24 h后，棄上清，使用胰酶消化細胞，離心后棄上清，加體積分數(shù)75%預冷乙醇溶液，振蕩，4 ℃固定過夜。加入RNase A溶液，1 500 r·min-1離心 10 min，棄上清，室溫條件下每管加30 μL PI進行染色，4 ℃避光孵育30 min，上機檢測各組細胞周期的分布情況，數(shù)據(jù)用 MultiFit LT 軟件進行分析。

2.6 蛋白免疫印跡檢測相關蛋白的表達按“2.2項”所述方法對細胞進行分組及藥物干預，培養(yǎng) 24 h 后，棄上清，胰蛋白酶消化細胞，離心后棄上清，加細胞裂解液裂解細胞。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量。每組細胞樣本的蛋白上樣量為25 ng，采用10% SDS-PAGE進行電泳，經(jīng)電轉(zhuǎn)膜后封閉于脫脂牛奶中，分別加入Cyclin D1及 c-Myc 一抗(稀釋比例為11 000)，4 ℃封閉過夜，經(jīng)TBS溶液洗膜3次后加入山羊抗兔二抗(稀釋比例為1500)，TBS洗膜3次后ECL顯像，用凝膠圖像處理系統(tǒng)對蛋白條帶進行處理，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin的灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。

3 結(jié)果

3.1 白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分制備結(jié)果白花蛇舌草-半枝蓮藥對提取物經(jīng)乙酸乙酯萃取后提取率為0.61%。UPLC分析結(jié)果顯示，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯提取物中含有對羥基苯乙酮、野黃芩苷、木犀草素和芹菜素4種化合物，符合白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分成分。見圖1。

圖1 白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分UPLC分析圖譜

3.2 白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分對SGC-7901細胞增殖的影響與對照組比較，培養(yǎng)24 h、48 h及72 h后，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低、中、高劑量組SGC-7901細胞的增殖抑制率均顯著升高(P<0.05)；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低劑量組比較，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中、高劑量組SGC-7901細胞的增殖抑制率顯著升高(P<0.05)；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中劑量組比較，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分高劑量組 SGC-7901 細胞的增殖抑制率顯著升高(P<0.05)。見圖2。

注：A：對照組；B：白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低劑量組；C：白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中劑量組；D：白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分高劑量組；與對照組比較，*P<0.05；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低劑量組比較，#P<0.05；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中劑量組比較，&P<0.05圖2 白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分對SGC-7901細胞增殖的影響

3.3 白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分對SGC-7901細胞克隆能力的影響與對照組比較，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低、中、高劑量組SGC-7901細胞集落形成率均顯著降低(P<0.05)；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低劑量組比較，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中、高劑量組SGC-7901細胞集落形成率均顯著降低(P<0.05)；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中劑量組比較，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分高劑量組SGC-7901細胞集落形成率顯著降低(P<0.05)。見圖3。

注：A：對照組；B：白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低劑量組；C：白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中劑量組；D：白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分高劑量組；與對照組比較，*P<0.05；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低劑量組比較，#P<0.05；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中劑量組比較，&P<0.05圖3 白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分對SGC-7901細胞克隆能力的影響

3.4 白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分對SGC-7901細胞周期變化的影響與對照組比較，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低、中、高劑量組SGC-7901細胞培養(yǎng)24 h后，G0/G1期細胞比例顯著增加(P<0.05)，G2/M期細胞比例顯著降低(P<0.05)；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低劑量組比較，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中、高劑量組G0/G1期細胞比例顯著增加(P<0.05)，G2/M期細胞比例顯著降低(P<0.05)；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中劑量組比較，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分高劑量組G0/G1期細胞比例顯著增加(P<0.05)，G2/M期細胞比例顯著降低(P<0.05)。見圖4。

注：A：對照組；B：白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低劑量組；C：白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中劑量組；D：白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分高劑量組；與對照組比較，*P<0.05；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低劑量組比較，#P<0.05；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中劑量組比較，&P<0.05圖4 白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分對SGC-7901細胞周期分布的影響

3.5 白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分對SGC-7901細胞中Cyclin D1及c-Myc蛋白表達水平的影響與對照組比較，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低、中、高劑量組SGC-7901細胞中Cyclin D1及c-Myc蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低劑量組比較，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中、高劑量組SGC-7901細胞中Cyclin D1及c-Myc蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中劑量組比較，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分高劑量組SGC-7901細胞中Cyclin D1及c-Myc蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。見圖5。

注：A：對照組；B：白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低劑量組；C：白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中劑量組；D：白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分高劑量組；與對照組比較，*P<0.05；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分低劑量組比較，#P<0.05；與白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分中劑量組比較，&P<0.05圖5 白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分對SGC-7901細胞中Cyclin D1及c-Myc蛋白表達的影響

4 討論

白花蛇舌草-半枝蓮藥對抗腫瘤作用是目前的研究熱點，大量研究證實，白花蛇舌草-半枝蓮藥對提取物對乳腺癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌及肝癌均有良好的抑制生長作用[6-9]。研究顯示，白花蛇舌草-半枝蓮可能通過調(diào)控胃癌細胞蛋白聚糖信號通路、磷酸肌醇-3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B，AKT)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路、抑癌基因蛋白53(protein 53，p53)信號通路等抑制胃癌細胞生長[10]，但具體的作用機制和靶點仍需通過動物實驗、細胞實驗甚至臨床研究進行深入探討。

本研究首先通過UPLC對所得到的提取物進行分析，鑒定后確認采用本實驗所述提取方法得到的提取物為白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分。利用不同含量白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分培養(yǎng)胃癌SGC-7901細胞發(fā)現(xiàn)，不同含量白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分(10 mg·L-1、30 mg·L-1、50 mg·L-1)培養(yǎng)SGC-7901細胞 24 h、48 h及72 h后，細胞增殖抑制率均顯著升高，且藥物劑量越高，增殖抑制率隨之增高，說明白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分可有效降低SGC-7901細胞增殖能力，抑制腫瘤細胞生長，且具劑量依賴性。細胞克隆形成實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分培養(yǎng)的SGC-7901細胞，其克隆能力明顯降低，與CCK-8法檢測細胞增殖抑制率趨勢相同，進一步從可視角度證實該藥對乙酸乙酯組分對胃癌細胞增殖抑制的有效性。

誘導腫瘤細胞凋亡及抑制腫瘤細胞增殖是目前抑制腫瘤細胞生長的主要作用機制[11-14]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細胞周期的改變密切相關，越來越多的學者發(fā)現(xiàn)中藥單體、單味中藥、中藥復方可將腫瘤細胞阻滯于不同細胞周期，對抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有深入研究意義[4]。細胞周期包括 G1期 (DNA 合成前期)、S期(DNA 合成期)、M期(分裂期)、G2期(DNA合成期)及G0期(休眠期)。目前研究證實，G0/G1期、S期、G2/M期是3個調(diào)控細胞周期的關鍵節(jié)點，腫瘤細胞阻滯在上述周期節(jié)點內(nèi)，可明顯抑制細胞增殖[15-17]。本研究結(jié)果顯示，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分干預SGC-7901細胞 24 h 后，G0/G1期細胞比例增加，G2/M期細胞比例降低，且呈劑量依賴型，說明白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分可將胃癌細胞分裂周期阻滯在G0/G1期，且能抑制DNA的合成與分裂，這可能是該藥對組分降低腫瘤細胞增殖及克隆能力的原因之一。

Cyclin D1是腫瘤細胞周期最重要的調(diào)控因子之一，可與細胞周期蛋白依賴性激酶4(cyclin dependent kinase 4，CDK4)及CDK6形成蛋白復合物，使蛋白激酶磷酸化，促進細胞進入S期，對細胞增殖具有正調(diào)控作用[18-19]。另有臨床研究顯示，Cyclin D1在胃癌組織中呈高表達，并且其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關[20]。c-Myc基因是Myc癌基因家族的重要成員之一，也是常見的原癌基因之一，其可參與腫瘤細胞的增殖、遷移過程，并且對細胞的異常分化具有促進作用[21-22]。此外，c-Myc可與Cysclin啟動子相結(jié)合，促進細胞周期蛋白表達上調(diào)，進而加速細胞分化[23-24]。有學者發(fā)現(xiàn)，降低細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)磷酸化程度，腫瘤細胞中c-Myc的表達減少，并可將腫瘤細胞阻滯在G0/G1期，降低腫瘤細胞增殖、遷移及侵襲的能力，說明抑制c-Myc表達可能是抑制腫瘤細胞生長的重要途徑[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分干預胃癌SGC-7901細胞后，細胞中Cyclin D1、c-Myc蛋白表達水平降低，且存在劑量依賴性，說明白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分對SGC-7901細胞中Cyclin D1及c-Myc的表達具有抑制作用。

綜上所述，白花蛇舌草-半枝蓮藥對乙酸乙酯組分可能通過下調(diào)胃癌SGC-7901細胞中Cyclin D1及c-Myc表達水平，將細胞阻滯在G0/G1期，在合成前期抑制腫瘤細胞DNA復制，進而抑制腫瘤細胞的增殖。另外本研究也有不足之處，如本研究雖對G0/G1期的關鍵檢測蛋白Cyclin D1及c-Myc進行檢測，但并未對其上下游傳導信號通路進行檢測，未能知曉其具體機制，有待于進一步研究加以證實。