藏藥材唐古特鐵線蓮質(zhì)量標準提升

萬玉瑩，陳曉奇，王喜錕，鄧順艷，鄒海飛，周燕，達娃卓瑪1，*（1.中藥（藏藥）質(zhì)量控制重點實驗室 西藏自治區(qū)食品藥品檢驗研究院，拉薩 850005；.西藏大學(xué)，拉薩 85001；.中國科學(xué)院成都有機化學(xué)研究所，成都 61001；.中國科學(xué)院成都生物研究所，成都 6100）

唐古特鐵線蓮[Clematis tangutica（Maxim.）Korsh.]是毛茛科（Ranunculacea）鐵線蓮屬（ClematisL.）藤本植物，又稱甘青鐵線蓮，藏文名稱“葉芒那布”，主要分布于青海和西藏等高原地區(qū)，地上部分入藥[1]。據(jù)《晶珠本草》和《藏藥志》等藏藥典籍記載，其性辛、甘、溫，祛寒，增生胃火，活血通瘀，破痞瘤積聚[2-3]，對心血管系統(tǒng)疾病有良好的療效，常用于治療消化不良，寒性腫瘤等癥[4]，是藏成藥益心康泰膠囊的組方藥材之一[5]。目前，從唐古特鐵線蓮中共分離得到72種化學(xué)成分，主要是三萜皂苷類化合物，苷元多為齊墩果烷型五環(huán)三萜結(jié)構(gòu)，主要分為常春藤皂苷元型三萜皂苷（43種）和齊墩果酸型三萜皂苷（12種）。其中常春藤皂苷元型三萜皂苷具有心肌保護抗缺血性腦損傷抗腫瘤細胞和抗菌活性等[6-11]。

1995年衛(wèi)生部頒《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準》藏藥（第一冊）收載的唐古特鐵線蓮藥材質(zhì)量標準水平低，包括名稱、來源、性狀、生藥鑒別、炮制、性味與歸經(jīng)、功能與主治、用法與用量、貯藏[12]，無法達到質(zhì)量控制目的，所以亟需對其質(zhì)量標準進行修訂提高。本研究根據(jù)《中國藥典》2020年版第四部通則相關(guān)規(guī)定，增補薄層鑒別、含量測定、各檢查項及浸出物等檢測項目[13]，以其為藏藥材質(zhì)量標準進一步完善奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

Waters Acquity UPLC H-CLASS液相色譜儀（四元泵，PDA檢測器，柱溫箱，自動進樣器，Empower 色譜數(shù)據(jù)工作站）；Sartorius BT 25 S（十萬分之一）和 BSA124S-CW（萬分之一）電子天平（德國賽多利斯公司）；常春藤皂苷元對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量以98.3%計）；硅膠G板（青島海洋化工有限公司）。

1.2 試藥

唐古特鐵線蓮藥材19批次，采集自西藏自治區(qū)及青海省不同地區(qū)，經(jīng)西藏自治區(qū)藏醫(yī)院格桑巴珠副主任藥師和四川省中醫(yī)藥科學(xué)院周毅研究員鑒定為毛茛科植物唐古特鐵線蓮[Clematis tangutica（Maxim.）Korsh.]。7～8月花果期采集地上部分，切段曬干，粉碎后過2號篩，混合均勻，備用。樣品信息見表1。甲醇、乙腈為色譜純（美國Fisher公司）；水為超純水；其余試劑均為分析純。

表1 唐古特鐵線蓮藥材采集信息Tab 1 Sample information of Clematis tangutica (Maxim.) Korsh.

2 方法與結(jié)果

2.1 藥材性狀特征

本品莖細長，有時彎曲，具縱棱，灰棕色或棕褐色，質(zhì)硬而脆，易折斷，斷面較平坦，白色；葉卷曲皺縮，破碎，棕褐色或灰綠色，展開后小葉片呈狹長圓形或披針形，深裂，邊緣具缺刻狀鋸齒，背面被疏毛；花呈荷苞狀，有的壓扁，桔黃色，萼片4，長橢圓形，先端漸尖，外面被柔毛；果序呈絨球狀或扁絨球狀，柄長，瘦果倒卵形，長約4～7 mm，具長柔毛。氣微，味微苦[12]。唐古特鐵線蓮干燥藥材見圖1。

圖1 唐古特鐵線蓮干燥藥材Fig 1 Dry medicinal material of Clematis tangutica（Maxim.）Korsh.

2.2 顯微特征

2.2.1 靠近根部的莖橫切面 類圓形，表皮細胞1列；雙層纖維束呈環(huán)狀排列，大小不一，月牙形，外環(huán)一周環(huán)繞約14～18個，內(nèi)環(huán)一周環(huán)繞約11～13個；外韌維管束周狀排列，呈倒卵形，一周環(huán)繞約7～8個，長徑約占橫切面半徑的2/5，木質(zhì)部呈倒三角狀，形成層不明顯；髓部呈類圓形，約占橫切面半徑的 1/6，髓射線7～8條，放射狀分布在髓部外周到皮層（見圖2）。

圖2 靠近根的莖橫切面Fig 2 Cross section of the stem near the root

2.2.2 莖橫切面 類圓形，表皮細胞1列；皮層偶見次生保護組織周皮細胞2～3列；纖維束呈環(huán)狀排列，類半圓型，約占橫切面半徑的1/4，一周環(huán)繞約12～13個；外韌維管束類橢圓形，長徑約占橫切面半徑的2/5，周狀排列，一周環(huán)繞約12個；髓部約占橫切面半徑的 1/5，由15～20列細胞環(huán)繞排列組成（見圖3）。

圖3 莖橫切面Fig 3 Cross section of the stem

2.2.3 主葉脈橫切面 上、下表皮細胞各1列，橢圓形或類圓形；葉肉大型薄壁細胞，3～4列疏松排列；上表皮內(nèi)側(cè)見柵欄組織1～2列，緊密排列；海綿組織細胞3～4列，疏松排列且不規(guī)則；中部有雙韌維管束，類卵形，長徑約占橫切面寬度的1/3，韌皮部細胞緊密排3～5列（見圖4）。

圖4 主葉脈橫切面Fig 4 Cross section of the main vein

2.2.4 生藥粉末 非腺毛多細胞多碎斷，細胞連接處常有細胞縊縮，頂端細胞呈類橢圓形；葉表皮細胞表面觀為呈類多角形，氣孔為不定式，散在草酸鈣結(jié)晶，呈多面體形，表面觀呈多角形[12]；纖維成束，導(dǎo)管多為具緣紋孔導(dǎo)管、螺紋導(dǎo)管和環(huán)紋導(dǎo)管，直徑14.09～68.46 μm；種毛多見，透明，多斷裂（見圖5）。

圖5 生藥粉末Fig 5 Crude drug powder

2.3 薄層鑒別

2.3.1 對照品、供試品溶液制備 稱取常春藤皂苷元對照品適量，加甲醇溶解制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL－1的對照品溶液。供試品溶液按照“2.7.3”項下方法制備。

2.3.2 方法 照薄層色譜法（通則0502），吸取上述對照品溶液2 μL，供試品溶液2～3 μL，點于同一硅膠 G 薄層板，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（6∶4∶0.25）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸-乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰，可在樣品及對照品相應(yīng)位置上觀察到相同的紫紅色斑點[14]（見圖6）。

圖6 唐古特鐵線蓮TLC圖Fig 6 TLC of Clematis tangutica（Maxim.）Korsh.

2.4 水分測定

不同產(chǎn)地的唐古特鐵線蓮藥材水分含量7.51%～12.55%，平均值含量為9.8%。以平均值上浮30%為上限，暫定本品水分不得過13.0%[15]。19批藥材水分合格率為100%，結(jié)果見表2。

2.5 灰分、酸不溶性灰分測定

不同產(chǎn)地的唐古特鐵線蓮藥材總灰分含量為4.54%～7.68%，平均值為5.9%，以平均值上浮30%為上限，暫定本品總灰分含量不得過8.0%。酸不溶性灰分含量為0.10%～1.06%，平均值為0.36%，但批次T2020-01、T2020-10酸不溶性灰分含量分別為0.95%、1.06%，考慮到唐古特鐵線蓮藥材雖為地上部分入藥，但在采收集過程中難免摻入泥沙，故建議將酸不溶性灰分含量限量暫定為不得過1.00%[16]。藥材總灰分合格率約為100%，酸不溶性灰分合格率約為95%。結(jié)果見表2。

表2 水分、總灰分、酸不溶性灰分的測定結(jié)果(n＝2)Tab 2 Water，total ash and acid insoluble ash (n＝2)

2.6 浸出物測定

隨機選取一批藥材為代表（批號：T2020-02），對浸出物提取方法和提取溶劑進行考察。結(jié)果表明，熱浸法以純水作為溶劑時得到浸出物含量最高，結(jié)果見表3。以熱浸法水提19批不同產(chǎn)地唐古特鐵線蓮藥材，結(jié)果水溶性浸出物含量為21.16%～40.32%，平均值為30.6%，以藥材干燥品平均值70%為下限，暫定本品水溶性浸出物不得少于20.0%。藥材浸出物合格率為100%。結(jié)果見表4。

表3 浸出物提取方法的考察(n＝2)Tab 3 Extraction method(n＝2)

表4 水溶性浸出物含量(n＝2)Tab 4 Content of water-soluble extract (n＝2)

2.7 常春藤皂苷元含量測定

2.7.1 色譜條件 色譜柱：納譜分析 Chrom CoreC18（Ⅱ）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸水＝85∶15；流速1.0 mL·min－1；檢測波長 210 nm；柱溫 30℃；進樣量 10 μL。

2.7.2 對照品溶液的制備 精密稱取常春藤皂苷元對照品適量，用甲醇稀釋得到1005.5 μg·mL－1的對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液2 mL，用甲醇定容到10 mL量瓶中，得到201.1 μg·mL－1的對照品溶液。

2.7.3 供試品溶液的制備 精密稱取唐古特鐵線蓮藥材粉末（過2號篩）1.0 g，精密加入75%乙醇50 mL，稱量。常溫超聲（200 W，53 kHz）30 min，放置室溫，稱量，用75%乙醇補足減失的重量；搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液25 mL，加入濃鹽酸3 mL水浴回流4 h，靜置，冷卻，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，二氯甲烷萃取6次，每次20 mL，合并提取液，旋干，殘渣加適量甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，隨后用甲醇定容，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，續(xù)濾液作為供試品溶液[17]。

2.7.4 系統(tǒng)適用性試驗 精密吸取對照品溶液、供試品溶液、空白溶液（甲醇）進行測定。結(jié)果顯示，常春藤皂苷元與相鄰色譜峰的分離度均＞1.5，與其他組分可以達到完全分離，對稱因子在0.95～1.05，峰形對稱，理論塔板數(shù)≥7000，結(jié)果見圖7。

圖7 常春藤皂苷元HPLC色譜圖Fig 7 HPLC chromatogram of hederagenin

2.7.5 線性關(guān)系考察 精密量取“2.7.2”項下對照品儲備液0.025、0.05、0.1、0.5、1、2、3、5、10 mL置10 mL量瓶中，制成常春藤皂苷元對照品系列溶液；以對照品質(zhì)量濃度（X，μg·mL－1）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，進行線性回歸[18]，得回歸方程為Y＝9.473×103X＋4.652×104（r＝0.9999），結(jié)果表明，常春藤皂苷元在2.5137～1005.5 μg·mL－1與峰面積線性關(guān)系良好。

2.7.6 定量限與檢測限考察 精密量取“2.7.2”項下對照品儲備液逐步稀釋，進樣測定，按照信噪比（S/N）約為 10∶1 計算，得到常春藤皂苷元定量限為25.14 ng；按S/N約為 3∶1計算，得到常春藤皂苷元檢測限為7.54 ng。

2.7.7 儀器精密度考察 對照品溶液連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果常春藤皂苷元峰面積的RSD為0.60%，表明該儀器精密度良好。

2.7.8 重復(fù)性考察 取同一批藥材（批號：T2020-02）平行進行6次試驗，結(jié)果顯示，常春藤皂苷元含量的RSD為1.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.9 穩(wěn)定性考察 取藥材（批號：T2020-02）制樣后 0、2、4、6、8、10、12 h 進樣，記錄峰面積。結(jié)果常春藤皂苷元的峰面積RSD為0.72%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.10 加樣回收率考察 精密稱取已知含量的唐古特鐵線蓮藥材（批號：T2020-02）9份，每份約0.5 g，按待測成分含量的80%、100%、120%精密加入質(zhì)量濃度為0.042 72、0.052 24、0.062 70 mg·mL－1的常春藤皂苷元溶液50 mL，按“2.7.3”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算回收率。結(jié)果顯示，常春藤皂苷元低、中、高質(zhì)量濃度平均加樣回收率分別為99.25%、98.02%、98.89%，RSD分別為0.85%、1.6%、1.2%，表明方法準確度良好。

2.7.11 樣品測定 分別取青海、西藏各不同產(chǎn)地的唐古特鐵線蓮藥材，按“2.7.3”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算常春藤皂苷元的含量。結(jié)果表明，19批唐古特鐵線蓮樣品常春藤皂苷元含量差別很大，在 0.074%～1.667%，平均含量為0.591%，結(jié)果見表5。

表5 常春藤皂苷元含量測定結(jié)果 (n＝3)Tab 5 Content determination of hederagenin (n＝3)

2.7.12 樣品中常春藤皂苷元含量限量規(guī)定 由“2.7.11”項下測定結(jié)果可知，19批唐古特鐵線蓮樣品中常春藤皂苷元最高含量約為最低含量的23倍，變異系數(shù)為129%，若按照平均值的80%為限量，則含量不得低于0.473%，此時合格率為53%，這一結(jié)果表明常春藤皂苷元限量的制訂不能采用簡單的平均法[19]。本研究采用一種新的思路來制訂常春藤皂苷元限量以供參考。其核心思想是認為在采樣范圍內(nèi)有一部分唐古特鐵線蓮藥材中常春藤皂苷元的含量達不到設(shè)定的含量限度，例如當(dāng)有10%的樣品中常春藤皂苷元含量達不到定量限度時（即有90%的樣品可以達到含量限度，合格率為90%），把此部分樣品中含量最高值定為該品種藥材最低限量。

首先通過Cubic插值法結(jié)合統(tǒng)計學(xué)原理，由現(xiàn)有離散含量數(shù)據(jù)推算出總體藥材（采樣范圍內(nèi)所有該種藥材）中常春藤皂苷元含量的向上累計頻率分布數(shù)據(jù)，如圖8所示。圖中橫坐標表示藥材中常春藤皂苷元含量，圖中記作“常春藤皂苷元含量x”；縱坐標表示常春藤皂苷元含量低于某一值的所有藥材在全部藥材中所占比重，即統(tǒng)計學(xué)上的“累計頻率”，圖中記作“累計頻率P”。通過四次多項式擬合得出如下回歸方程：

圖8 常春藤皂苷元含量上限與低于該限量藥材所占比重（累計頻率P）擬合曲線圖Fig 8 Fitting curve between the upper limit of Hederagenin content and the proportion of medicinal materials lower than the limit value（cumulative frequency P）

P＝－0.1266＋2.3369x－2.3012x2＋ 1.0480x3－0.1608x4（Adj.R2＝0.9864）

據(jù)此回歸方程可知，當(dāng)P＝0.1時，含量x為0.108%，按干燥品計算，暫定唐古特鐵線蓮樣品中常春藤皂苷元含量不得低于0.10%，最終樣品合格率為95%。需要指出的是由于擬合數(shù)據(jù)源的x在0.074%～1.667%，出于嚴謹性，本公式僅能夠在上述范圍內(nèi)進行有效的計算。

3 討論

3.1 對照物質(zhì)的選擇

青海產(chǎn)唐古特鐵線蓮的質(zhì)量標準研究有以齊墩果酸[20]、蘆丁[21]、槲皮素、山柰酚、異鼠李素[22]為對照物質(zhì)進行含量測定的，但尚未收錄至藥品標準當(dāng)中。前期尋找不同產(chǎn)地唐古特鐵線蓮藥材共同對照物質(zhì)較為困難，而文獻所報道的相關(guān)對照品均未在西藏產(chǎn)唐古特鐵線蓮藥材中發(fā)現(xiàn)。常春藤皂苷元型三萜皂苷是唐古特鐵線蓮藥材的主要化學(xué)成分及活性成分，但常春藤皂苷類成分在紫外可見光區(qū)無吸收，且以其中一種常春藤皂苷類成分作為對照物質(zhì)，往往含量太低，達不到定量要求。故本試驗將各種常春藤皂苷類成分水解后得到常春藤苷元，其在紫外末端有吸收且可以達到定量的要求，從而間接對唐古特鐵線蓮藥材藥效組分進行控制。藥理活性研究表明，常春藤皂苷元具有抗腫瘤、抗抑郁、抗菌抗炎、抗糖尿病等多種藥理作用[23]。因此，考慮臨床功效、含量高低、特征性等因素，本課題將常春藤皂苷元作為對照物質(zhì)，制訂關(guān)于藥材中藥效活性組分的質(zhì)量控制方法。

3.2 含量測定

3.2.1 供試品溶液制備方法的考察 對供試品制備方法進行考察，采用不同濃度的甲醇、乙醇溶液（50%、75%、100%）作為提取溶劑，發(fā)現(xiàn)當(dāng)提取溶液在75%乙醇時，得到常春藤皂苷元含量最高。在此基礎(chǔ)上，考察超聲、回流兩種提取方式對常春藤皂苷元含量的影響，兩種方式下提取含量接近，考慮到節(jié)約提取時間，最終確定提取方式為超聲30 min。萃取溶劑考察了石油醚、二氯甲烷、三氯甲烷的萃取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用三氯甲烷為萃取溶劑時所得常春藤皂苷元含量是二氯甲烷作為萃取溶劑的1.1倍，但是三氯甲烷毒性較大，為管制化學(xué)試劑，最終選擇二氯甲烷作為萃取溶劑?？疾於燃淄檩腿?次、6次、8次，結(jié)果萃取6次可保證常春藤皂苷元提取完全。對比硫酸、鹽酸以及不加酸提取4 h常春藤皂苷元含量，結(jié)果使用鹽酸水解4 h時提取率較高，確定鹽酸作為水解溶劑。

3.2.2 色譜條件考察 考察了甲醇-冰醋酸（0.2%、0.4%）、甲醇-磷酸水（0.1%、0.2%）、甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（87∶13∶0.04∶0.02）、乙腈-0.1%磷酸水等流動相體系，綜合考慮壓力、峰形以及樣品分離效果等因素，最終確定流動相為甲醇-0.1%磷酸水＝85∶15。

3.2.3 不同產(chǎn)地質(zhì)量標準理化測定結(jié)果差異性分析 為了比較青海、西藏產(chǎn)地（藏醫(yī)院及藏藥廠收集藥材均來自西藏地區(qū)）唐古特鐵線蓮品質(zhì)的差異，利用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0對19批唐古特鐵線蓮樣品中水分、灰分、酸不溶性灰分、浸出物及常春藤皂苷元含量進行獨立樣本t檢驗[24]。

結(jié)果西藏產(chǎn)地藥材水分含量顯著高于青海，推測是因為西藏藥材收集時間在雨季，所以西藏產(chǎn)唐古特鐵線蓮藥材在產(chǎn)地加工、儲運及使用過程中要加強對水分的管理，防止藥材霉變現(xiàn)象的發(fā)生；青海、西藏兩產(chǎn)地間灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物及常春藤皂苷元含量無明顯差異，但是西藏地區(qū)8批次藥材中常春藤皂苷元含量變異系數(shù)約為137%，青海地區(qū)11批次藥材中常春藤皂苷元含量變異系數(shù)約為76%，顯然西藏地區(qū)藥材中常春藤皂苷元含量范圍跨度較大，因此以常春藤皂苷元作為對照物質(zhì)來體現(xiàn)藥材的品質(zhì)，青海產(chǎn)唐古特鐵線蓮藥材整體上要優(yōu)于西藏產(chǎn)唐古特鐵線蓮藥材。

3.3 小結(jié)

本研究通過對多產(chǎn)地唐古特鐵線蓮藥材性狀描述、顯微鑒別及薄層鑒別，可知該植物鑒別特征明顯，可作為唐古特鐵線蓮藥材的鑒別依據(jù)；通過對唐古特鐵線蓮藥材各檢查項及浸出物測定，初步確定各常規(guī)檢測項限量；通過建立常春藤皂苷元對照品的含量測定方法，初步確定唐古特鐵線蓮藥材質(zhì)控指標性化學(xué)成分及限量，為其品種鑒別、藥材質(zhì)量標準的完善及進一步開發(fā)利用提供依據(jù)；首次采用Cubic插值法結(jié)合統(tǒng)計學(xué)原理擬合曲線法制訂對照物質(zhì)限量，為目前質(zhì)量標準研究中含量限度制訂方法提供新的參考。