雷 蕾 關(guān)哲允 曹士亮 王玉民 林春晶彭 寶 劉 鵬 趙麗梅 李志剛 張春寶

（1內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，028042，內(nèi)蒙古通遼；2吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜交大豆育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，130033，吉林長(zhǎng)春；3黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，150086，黑龍江哈爾濱）

大豆作為我國(guó)重要的糧食、油料以及飼料兼用作物，近年來(lái)的生產(chǎn)總量無(wú)法滿足日益攀升的消費(fèi)需求。目前我國(guó)是世界上最大的大豆消費(fèi)國(guó)，也是全球最大的進(jìn)口國(guó)，供需關(guān)系失衡，僅靠國(guó)內(nèi)生產(chǎn)難以滿足需求，大豆高度依賴進(jìn)口的局面難以改變[1]。這其中的主要原因是我國(guó)大豆單產(chǎn)低，效益比較差，同時(shí)耕地面積難以增加，因此提高大豆的單產(chǎn)水平迫在眉睫。雜種優(yōu)勢(shì)普遍存在于生物界，在許多動(dòng)植物上均得以體現(xiàn)，并且被認(rèn)為是提高作物產(chǎn)量的最有效途徑之一[2]。雜種優(yōu)勢(shì)在水稻、玉米、高粱、油菜和棉花等農(nóng)作物的生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用并獲得巨大成功，世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)得到了極大發(fā)展[3-5]。雜交大豆同樣具有較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)，隨著世界上第1個(gè)大豆雜交種“雜交豆1號(hào)”育成并通過(guò)審定[6]，大豆雜種優(yōu)勢(shì)利用進(jìn)入新階段。目前我國(guó)在該領(lǐng)域一直處于國(guó)際領(lǐng)先水平，截至2021年底，在東北及黃淮海大豆主產(chǎn)區(qū)已審定39個(gè)大豆雜交品種[1]。雖然目前已有一批大豆雜交種育成并通過(guò)審定，但是在雜交種實(shí)際選育過(guò)程中仍存在大量雜交組合盲目配制的問(wèn)題，導(dǎo)致雜交種的產(chǎn)出率低，部分雜交組合的雜種優(yōu)勢(shì)不強(qiáng)，限制了強(qiáng)優(yōu)勢(shì)雜交種的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。借鑒玉米和水稻等作物的雜交育種經(jīng)驗(yàn)，只有將來(lái)源不明的種質(zhì)資源劃分到正確的雜種優(yōu)勢(shì)群，才能更好地利用雜種優(yōu)勢(shì)模式，提高育種效率，培育出更多的新品種，將雜種優(yōu)勢(shì)最大效應(yīng)[7]發(fā)揮在雜種優(yōu)勢(shì)群內(nèi)，進(jìn)行親本遺傳改良和創(chuàng)制，在不同雜種優(yōu)勢(shì)群間進(jìn)行雜交組合配制，是強(qiáng)優(yōu)勢(shì)雜交種選育的重要理論基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)單序列重復(fù)（simple sequence repeats，SSR）作為一種多態(tài)性高、重復(fù)性好且較穩(wěn)定的分子標(biāo)記，在雜種優(yōu)勢(shì)群劃分和遺傳多樣性分析中被廣泛應(yīng)用。如Senior等[8]利用70個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)94份美國(guó)玉米自交系材料進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)類群的鑒定分析，證實(shí)雜種優(yōu)勢(shì)類群的鑒定結(jié)果與系譜吻合；聶永心等[9]利用70個(gè)SSR分子標(biāo)記對(duì)20個(gè)玉米自交系劃分了5個(gè)雜種優(yōu)勢(shì)群，聚類分析結(jié)果與系譜基本一致，表明SSR標(biāo)記可以進(jìn)行玉米自交系遺傳變異分析，并用于雜種優(yōu)勢(shì)群的劃分；羅小金等[10]利用36個(gè)SSR分子標(biāo)記將58份秈型水稻劃分為3個(gè)雜種優(yōu)勢(shì)類群，并發(fā)現(xiàn)類群間組合優(yōu)勢(shì)強(qiáng)于類群內(nèi)組合；張濤等[11]利用44個(gè)與水稻產(chǎn)量性狀基因緊密連鎖的功能基因標(biāo)記對(duì)三系雜交水稻親本進(jìn)行遺傳多樣分析，將雜交水稻親本劃分為保持系群和恢復(fù)系群，并且證明了功能基因標(biāo)記與普通分子標(biāo)記相比具有更高的DNA多態(tài)性檢測(cè)效率，能夠準(zhǔn)確、可靠地劃分類群；于海至[12]利用49個(gè)SSR分子標(biāo)記對(duì)199份油菜強(qiáng)優(yōu)勢(shì)雜交種親本進(jìn)行聚類分析，最終將大部分親本劃分為2個(gè)雜種優(yōu)勢(shì)群，分析后發(fā)現(xiàn)遺傳距離中等偏大的親本間進(jìn)行組配，雜種優(yōu)勢(shì)較為明顯。在大豆中也開展了利用SSR標(biāo)記進(jìn)行雜交大豆親本間遺傳多樣性的分析。吳倩等[3]利用SSR分子標(biāo)記遺傳距離預(yù)測(cè)大豆親本間雜種優(yōu)勢(shì)，最終發(fā)現(xiàn)SSR分子標(biāo)記對(duì)大豆親本間雜種優(yōu)勢(shì)預(yù)測(cè)未能達(dá)到顯著水平；白志元等[13]也利用了SSR標(biāo)記對(duì)32份雜交大豆親本進(jìn)行了遺傳多樣性分析，經(jīng)聚類分析發(fā)現(xiàn)，親本間可以根據(jù)地理來(lái)源進(jìn)行類群劃分。但上述研究?jī)H僅是通過(guò)多態(tài)性標(biāo)記進(jìn)行分群聚類，不同群內(nèi)和群間雜交是否具有雜種優(yōu)勢(shì)的研究尚未深入展開。

本研究利用篩選獲得的14個(gè)在雜交大豆親本間具有較好多態(tài)性的產(chǎn)量性狀連鎖SSR標(biāo)記，對(duì)2002-2022年在東北春大豆主產(chǎn)區(qū)審定的30個(gè)雜交種所用的43份親本材料進(jìn)行親緣關(guān)系分析和遺傳多樣性評(píng)價(jià)，探討親本間地理來(lái)源及遺傳距離對(duì)強(qiáng)優(yōu)勢(shì)雜交種創(chuàng)制的影響，為今后指導(dǎo)親本選育方向及提高雜交組合組配效率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況與材料

試驗(yàn)材料為吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院雜交大豆團(tuán)隊(duì)育成的30個(gè)春大豆雜交種的親本材料，包括來(lái)源于中國(guó)東北、美國(guó)和意大利的不育系配套保持系20份與恢復(fù)系23份，共計(jì)43份。所有試驗(yàn)材料于2021年5月種植在吉林省長(zhǎng)春市范家屯鎮(zhèn)雜交大豆核心育種基地（124°83′E，43°43′N）。試驗(yàn)地行長(zhǎng) 3m，行距65cm，株距15cm。對(duì)所有試驗(yàn)材料進(jìn)行編號(hào)，每份試驗(yàn)材料種植1行。進(jìn)行常規(guī)田間管理，并在試驗(yàn)田四周設(shè)置保護(hù)行，在行頭插牌做標(biāo)記。選取43份親本材料V2期（第2個(gè)3小葉時(shí)期）的新鮮葉片置于液氮中運(yùn)輸，于-80℃冰箱保存。

1.2 SSR標(biāo)記篩選

對(duì)公開發(fā)表文獻(xiàn)中與大豆籽粒大小、單株粒重、每莢粒數(shù)、單株莢數(shù)、百粒重、分枝數(shù)和主莖節(jié)數(shù)等產(chǎn)量性狀相關(guān)SSR分子標(biāo)記進(jìn)行檢索，選取66個(gè)緊密連鎖的SSR標(biāo)記，其引物序列送北京六合華大基因科技有限公司合成。篩選多態(tài)性好、重復(fù)性高、帶型清晰的分子標(biāo)記用于對(duì)43份親本材料進(jìn)行多態(tài)性的檢測(cè)。

1.3 基因組DNA提取及PCR檢測(cè)

使用Nu Clean Plant Genomic DNA Kit（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）提取試驗(yàn)材料葉片基因組DNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳以及微量分光光度計(jì)（thermo，NanoDrop 2000）對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行濃度和質(zhì)量檢測(cè)，檢測(cè)合格的DNA放置于-20℃冰箱保存。

利用SSR分子標(biāo)記對(duì)親本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為15μL，包括2×ES Taq Master Mix For Page（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）7.5μL、ddH2O 4.5μL、上下游引物各 1μL、模板 1μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，退火溫度為42℃～60℃，72℃延伸30s，循環(huán)33次；72℃延伸5min，最終4℃保存。利用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，電泳前在PCR產(chǎn)物中加入變性劑3μL[14]，95℃變性10min。變性后的樣品置于凝膠點(diǎn)樣孔恒定電壓300V電泳2h，電泳結(jié)束后在400mL水中加入Super GelRed熒光染料（蘇州宇恒生物科技有限公司）試劑40μL，染色10～20min，通過(guò)紫外凝膠成像儀（UVP，GelDoc-It 310）成像，記錄條帶數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)電泳條帶遷移的位置對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行記錄，同一位置條帶以同一數(shù)字進(jìn)行記錄，缺失條帶記為“9”，利用Excel記錄試驗(yàn)結(jié)果。利用Power Marker v3.25軟件，采用算術(shù)平均非加權(quán)方法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）對(duì)親本材料進(jìn)行聚類分析，獲得聚類樹狀圖。利用Power Marker v3.25[15]計(jì)算每個(gè)標(biāo)記的多態(tài)性信息含量（polymorphism information content，PIC），PIC=1-∑Pi2，Pi表示群體中含有第i個(gè)等位變異的比例[16]、等位變異數(shù)（allele number，Na）、遺傳多樣性系數(shù)（genetic diversity index，GI）、主效基因頻率（major alle frequency，MAF）和遺傳距離（genetic distance，GD）。根據(jù)SSR標(biāo)記對(duì)43份親本材料檢測(cè)到的基因型及利用Power Marker v3.25軟件得到的分群結(jié)果，利用R語(yǔ)言ggplot 2作主坐標(biāo)分析（principal co-ordinates analysis，PcoA），最終將各點(diǎn)PcoA結(jié)果坐標(biāo)繪制在二維平面圖上，制成散點(diǎn)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性SSR分子標(biāo)記篩選

通過(guò)對(duì)文獻(xiàn)檢索并合成的66個(gè)與產(chǎn)量相關(guān)性狀緊密連鎖的SSR分子標(biāo)記，首先利用4份不同來(lái)源地的親本進(jìn)行初篩，最終篩選出14個(gè)多態(tài)性好、帶型清晰、檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定的SSR標(biāo)記用于進(jìn)一步分析，具體分子標(biāo)記信息見表1。

表1 14個(gè)SSR標(biāo)記信息Table 1 14 Primers information table

2.2 基于SSR多態(tài)性數(shù)據(jù)的聚類分析

根據(jù)PowerMarker v3.25軟件通過(guò)Nei's距離利用UPGMA將43份材料的SSR標(biāo)記多態(tài)性數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。根據(jù)聚類結(jié)果（圖1），43份親本被聚為2個(gè)類群。其中類群Ⅰ中包含27份材料，大部分為中國(guó)來(lái)源，國(guó)外材料有美國(guó)JLCMS179B、JLCMS254B和JLCMS164B與意大利JLR83；類群Ⅱ中包含16份材料，均為美國(guó)來(lái)源。從表2可以看出，2002-2022年?yáng)|北春大豆區(qū)審定的30個(gè)雜交種中，25個(gè)雜交種的親本屬于2個(gè)類群，另有4個(gè)為類群Ⅰ內(nèi)雜交獲得，1個(gè)為類群Ⅱ內(nèi)雜交獲得。說(shuō)明多數(shù)的雜交種親本來(lái)源分屬于不同的雜種優(yōu)勢(shì)類群。

圖1 SSR標(biāo)記對(duì)親本材料的UPGMA聚類分析Fig.1 UPGMA cluster of parent materials based on SSR markers

另外，根據(jù)表2中所列親本間的地理來(lái)源信息，26個(gè)雜交種屬于國(guó)內(nèi)與國(guó)外親本雜交獲得，僅有2個(gè)為美國(guó)親本間雜交獲得，2個(gè)為國(guó)內(nèi)親本間雜交獲得。雜交種親本來(lái)源既滿足不同類群又符合不同地理來(lái)源的雜交種個(gè)數(shù)為23個(gè)，說(shuō)明分子標(biāo)記劃分的雜種優(yōu)勢(shì)類群結(jié)果與地理來(lái)源分布基本一致。分子標(biāo)記劃分的雜種優(yōu)勢(shì)類群結(jié)果與地理來(lái)源分布不一致的情況主要表現(xiàn)為，雜交種親本均來(lái)自美國(guó)，但分子標(biāo)記分析結(jié)果可以劃分為類群Ⅱ（吉育612），分別屬于美國(guó)和中國(guó)的吉農(nóng)H1和吉育667以及均屬于中國(guó)的吉育635和吉育653被劃分到了類群Ⅰ。

表2 雜交種親本分群結(jié)果Table 2 Results of parental strata of hybrid species

續(xù)表2 Table 2(continued)

進(jìn)一步對(duì)雜交種親本間GD的分布情況（圖2）進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，43份親本間的GD均值為0.3845，30個(gè)雜交種成對(duì)親本間的GD均值為0.4650，親本間GD在0.5～0.6的組合頻率最高，共有12個(gè)，占所有組合的40.00%。親本間GD在0.4～0.5的組合有6個(gè)，占總數(shù)的20.00%，親本間GD在0.3～0.4的組合有5個(gè)，占總數(shù)的16.67%。推測(cè)GD在0.4～0.6時(shí)雜種優(yōu)勢(shì)利用效率較高?？紤]到大豆雜種優(yōu)勢(shì)利用時(shí)，為減少組配的盲目性，優(yōu)先組配親本GD在0.5～0.6的雜交組合。

圖2 SSR標(biāo)記分析雜交種親本遺傳距離分布Fig.2 Genetic distance distribution of hybrid parents based on SSR markers

2.3 遺傳多樣性分析

進(jìn)一步對(duì)43份親本材料進(jìn)行遺傳多樣性分析（表3和圖3）發(fā)現(xiàn)，總?cè)旱腗AF均值為0.6871，范圍在0.4419～0.9302；類群Ⅰ均值為0.7233，范圍在0.4074～1.0000；類群Ⅱ的均值為0.7622，范圍在0.5000～1.0000?？?cè)旱腘a均值為2.2143，范圍在2.0000～4.0000；類群Ⅰ的均值為2.0714，范圍在1.0000～4.0000；類群Ⅱ的均值為1.9286，范圍在1.0000～2.0000。總?cè)旱腉I均值為0.4043，范圍在0.1298～0.6101；類群Ⅰ的均值為0.3449，范圍在0.0000～0.6475；類群Ⅱ均值為0.3243，范圍在0.0000～0.5000。總?cè)旱腜IC均值為0.3280，范圍在0.1214～0.5272；在類群Ⅰ中，PIC均值為0.2801，范圍在0.0000～0.5720；在類群Ⅱ中，PIC均值為0.2612，范圍在0.0000～0.3750。總?cè)篏D范圍在0.0000～0.6923，類群Ⅰ的范圍在0.0000～0.6153，類群Ⅱ的范圍在0.0000～0.4285。上述結(jié)果表明，類群Ⅰ的遺傳多樣性水平高于類群Ⅱ。

圖3 SSR標(biāo)記對(duì)群體間的遺傳多樣性分析Fig.3 Analysis of genetic diversity between groups by SSR markers

表3 SSR標(biāo)記對(duì)不同群試驗(yàn)材料的遺傳多樣性分析Table 3 Genetic diversity analysis of test materials by SSR markers on different groups

從圖4中可知，利用PC1和PC2主成分將43份親本清晰地劃分為2個(gè)集合，集合Ⅰ包含23份材料，70%以上為中國(guó)東北材料；集合Ⅱ包含20份材料，全部為美國(guó)材料；有8份材料在2集合交匯位置聚集，這部分材料中存在混合血緣材料。這與SSR標(biāo)記聚類圖的分析結(jié)果較為一致，證明中國(guó)東北與國(guó)外材料之間配制的雜交組合存在較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)。材料間遺傳距離分布范圍較廣，散點(diǎn)密集度較小，進(jìn)一步表明中國(guó)東北春大豆區(qū)審定的雜交種的親本材料分化程度較高，遺傳差異較大，種質(zhì)資源背景較為豐富。

圖4 基于SSR標(biāo)記檢測(cè)基因型及分群結(jié)果的PcoA散點(diǎn)圖Fig.4 PcoA scatter plot based on SSR marker detection of genotype and clustering results

3 討論

本研究利用SSR分子標(biāo)記根據(jù)遺傳距離對(duì)30個(gè)審定大豆雜交種的43份親本材料進(jìn)行聚類分群，劃分結(jié)果與親本地理來(lái)源結(jié)果基本一致，相同地理來(lái)源的試驗(yàn)材料基本可以聚在一個(gè)大群中，這與鐘文娟等[29]和魏苗等[30]的研究結(jié)果相同，表明SSR標(biāo)記聚類結(jié)果與地理來(lái)源之間存在一致性。個(gè)別不同來(lái)源材料會(huì)聚類到一個(gè)類群，可能是由于跨地區(qū)引種導(dǎo)致的遺傳背景聚合所致，類似的結(jié)果在糜子聚類分群研究中也同樣出現(xiàn)[31]；強(qiáng)海平等[32]利用SSR標(biāo)記對(duì)中國(guó)和美國(guó)來(lái)源的紫花苜蓿進(jìn)行聚類分析時(shí)也發(fā)現(xiàn)，由于每個(gè)品種存在多個(gè)親本參與雜交的過(guò)程，導(dǎo)致部分品種間存在一定的親緣關(guān)系，聚類時(shí)個(gè)別材料出現(xiàn)偏差。也可能是因?yàn)楸狙芯克肧SR標(biāo)記數(shù)量未能覆蓋大豆全部20條染色體，對(duì)個(gè)別親緣關(guān)系較為復(fù)雜的親本無(wú)法進(jìn)行精準(zhǔn)判斷所致。

從分群結(jié)果來(lái)看，30個(gè)審定春大豆雜交種中有26個(gè)為中國(guó)東北與國(guó)外材料雜交組配育成，且上述雜交種親本大多分屬于不同遺傳類群，也印證了遺傳背景差異越大，雜種優(yōu)勢(shì)越強(qiáng)的理論[33]。另外，也不乏國(guó)內(nèi)或美國(guó)材料內(nèi)部的組配育成了強(qiáng)優(yōu)勢(shì)雜交種，這表明同一來(lái)源且屬于同一類群間的親本同樣會(huì)育成強(qiáng)優(yōu)勢(shì)雜交種，但概率會(huì)較低。根據(jù)43份親本聚類分群結(jié)果來(lái)看，80%的雜交種的親本分屬于不同類群，大部分雜交種均由中國(guó)和國(guó)外材料進(jìn)行組配獲得。但個(gè)別材料如來(lái)源于美國(guó)的JLCMS164B和JLCMS254B被聚在中國(guó)東北材料群中，推測(cè)其可能由中國(guó)引進(jìn)尚未被改良或尚存大部分中國(guó)材料遺傳背景，所以通過(guò)SSR標(biāo)記分析將其與中國(guó)材料聚入同一類群。

Lippman等[34]認(rèn)為育種者應(yīng)該努力增加親本種群之間的遺傳距離，以最大化雜種優(yōu)勢(shì)。但Moll等[35]卻提出，親本不應(yīng)超過(guò)最佳GD，以避免由于有害的上位效應(yīng)而降低雜種優(yōu)勢(shì)。然而Boeven等[36]最近的研究證實(shí)，雜種優(yōu)勢(shì)隨親本間GD的增加而穩(wěn)定增加，父母本群體之間可以盡可能保持距離，后代優(yōu)勢(shì)不會(huì)因此而下降。本研究計(jì)算了43份春大豆雜交種親本間的GD，發(fā)現(xiàn)所用雜交種親本的GD在0.4～0.6時(shí)，雜種優(yōu)勢(shì)利用程度較高，這與Moll等[35]的結(jié)論較為一致，然而本研究中仍有部分雜交種親本的GD在0.6～0.7。因此，雜種優(yōu)勢(shì)是否存在最佳GD或者會(huì)隨親本間GD的增加而增加，仍有待于進(jìn)一步開展研究。

4 結(jié)論

利用14個(gè)大豆產(chǎn)量性狀連鎖SSR分子標(biāo)記對(duì)2002-2022年中國(guó)東北春大豆產(chǎn)區(qū)審定的30個(gè)雜交種的43份親本材料進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)群劃分和驗(yàn)證，通過(guò)UPGMA法將43份親本材料劃分為2個(gè)類群，不同地理來(lái)源種質(zhì)資源親緣關(guān)系較近，聚類結(jié)果與地理來(lái)源基本一致。已審定強(qiáng)優(yōu)勢(shì)雜交種的親本80%以上分屬上述2個(gè)類群，且為中國(guó)東北與國(guó)外材料雜交獲得，表明GD較遠(yuǎn)且存在地理遠(yuǎn)源的雜交大豆親本材料之間進(jìn)行雜交組配，會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的雜種優(yōu)勢(shì)。