李 容 肖海蓉 劉 冰 王少為

作者單位：1.英科博雅集團(tuán)有限公司 214000 2.博雅干細(xì)胞科技有限公司 214092 3.國(guó)家老年醫(yī)學(xué)中心 北京醫(yī)院 100730

人口老齡化是全球面臨的共同的社會(huì)問(wèn)題。2021年第七次全國(guó)人口普查結(jié)果顯示，中國(guó)60歲及以上人口超過(guò)2.6億，占總?cè)丝诘?8.70%[1]。預(yù)計(jì)到2025年，60歲及以上人口將超過(guò)總?cè)丝诘?0%，我國(guó)將步入中度老齡化社會(huì)[2]。如何延緩衰老,改善老年人的衰老狀態(tài)，使老年人健康長(zhǎng)壽，已經(jīng)成為重要的社會(huì)問(wèn)題和醫(yī)學(xué)問(wèn)題。

人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(hPMSCs)是一種具有自我復(fù)制和多向分化潛能的多能干細(xì)胞。符合2006年國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)(ISCT)的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的定義標(biāo)準(zhǔn)[3]:①體外培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)；②細(xì)胞表面高表達(dá)CD73、CD90和CD105(陽(yáng)性率≥95%)；不表達(dá)CD34、CD45、CD11b/CD14、CD79α/CD19以及HLA-DR；③具有向骨、軟骨和脂肪細(xì)胞分化的能力。最新研究表明，hPMSCs可以向骨、軟骨、脂肪、肌肉、肝臟、心臟、胰腺、內(nèi)皮、肺和神經(jīng)等多種細(xì)胞分化[4]。具有促血管生成[5]、免疫調(diào)節(jié)作用[6]，在心肌梗死[7]、中風(fēng)和腦創(chuàng)傷[8,9]、呼吸窘迫綜合征和肺炎[10,11]、肝纖維化[12]、脊髓損傷[13]、骨關(guān)節(jié)炎[14]以及抗衰老[15]等領(lǐng)域具有治療潛力。

本研究應(yīng)用D-gal誘導(dǎo)小鼠衰老模型，經(jīng)小鼠尾靜脈移植hPMSCs，每周一次，連續(xù)4周，觀察衰老小鼠癥狀的變化，血清、肝臟、脾臟、肺臟、腦組織中超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量的變化，評(píng)估人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的抗衰老作用。

1.資料與方法

1.1 衰老小鼠模型的建立 60只8周齡健康C57BL/6J雌性小鼠，由南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院提供。隨機(jī)分為對(duì)照組、衰老模型組和hPMSCs組(即細(xì)胞組)，每組20只。小鼠每日頸背部皮下注射5%的D-gal，注射量為0.25ml/10g，連續(xù)8周，建立衰老小鼠模型。對(duì)照組小鼠頸背部皮下注射相同體積的生理鹽水。

1.2 hPMSCs的分離和培養(yǎng) 清洗人胎盤組織，將胎盤小葉剪至約0.2cm3，加入復(fù)合酶，37℃消化30min，收集細(xì)胞，以10000細(xì)胞/cm2密度接種，DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞匯合度達(dá)到80%，使用0.25%胰蛋白酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。ADAM自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和活率檢測(cè)。

1.3 流式分析 流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter FC500)分析hPMSCs表面標(biāo)志物。三陽(yáng)性抗體：CD73-FTIC、CD90-PC5、CD105-PC7，五陰性抗體：HLA-DR-PE、CD11b-PE、CD19-PE、CD34-PE、CD45-PE，進(jìn)行3次分析。

1.4 hPMSCs向骨、軟骨、脂肪細(xì)胞分化 采用Gibco公司的誘導(dǎo)試劑盒，對(duì)P5代hPMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化，通過(guò)茜素紅、阿爾新藍(lán)、油紅O染色，確定其成骨、成軟骨、成脂分化潛能。

1.5 hPMSCs移植 衰老模型建成后，細(xì)胞組經(jīng)小鼠尾靜脈注射hPMSCs 2×106細(xì)胞/0.2ml，每周1次，連續(xù)4周。對(duì)照組和模型組給予相同體積生理鹽水。

1.6 小鼠血清、肝臟、脾臟、肺臟、腦組織中SOD、CAT活性和MDA含量 hPMSCs移植后8周,小鼠眼球采血，37℃保存1h，4℃ 4000×g離心10min，收集血清，-20℃保存?zhèn)溆谩囝i處死小鼠，取肝臟、脾臟、肺臟和腦組織，用生理鹽水制備10%勻漿，4℃下4000×g離心10分鐘，收集上清液。根據(jù)說(shuō)明書，檢測(cè)血清、肝臟、脾臟、肺臟和腦組織中SOD、CAT活性和MDA含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組數(shù)據(jù)采用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 hPMSCs的鑒定 倒置顯微鏡觀察人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(hPMSCs)呈梭形，貼壁生長(zhǎng)(見(jiàn)圖1)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)人hPMSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)，CD73、CD90、CD105呈陽(yáng)性，且陽(yáng)性率≥95%；CD34、CD45、CD11b、CD14、CD19、HLA-DR呈陰性表達(dá)。對(duì)hPMSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化，觀察到人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞向骨、軟骨和脂肪細(xì)胞分化。

圖1 P5代hPMSCs呈梭形，貼壁生長(zhǎng)(放大40倍)。

2.2 衰老小鼠模型建立 5%的D-gal小鼠頸背部皮下注射8周，小鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)遲緩、反應(yīng)遲鈍、攝食量減少、體形消瘦、精神萎靡、毛發(fā)稀疏等典型的衰老體征。與對(duì)照組相比，模型組小鼠體重顯著減輕，血清SOD活性和CAT活性顯著降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.05)。以上結(jié)果表明，成功建立小鼠衰老模型。見(jiàn)表1。

表1 模型組與對(duì)照組小鼠體重、血清SOD、CAT和MDA的比較

2.3 hPMSCs移植對(duì)衰老小鼠的影響 小鼠衰老模型建模成功，細(xì)胞組經(jīng)小鼠尾靜脈注射hPMSCs 2×106細(xì)胞/0.2ml，每周1次，連續(xù)4周。hPMSCs首次移植后8周，小鼠精神狀態(tài)改善，體重增加。對(duì)照組小鼠體重(25.2±0.6)g，模型組小鼠體重(17.4±0.4)g，細(xì)胞組小鼠體重(23.2±0.3)g。見(jiàn)表2。

表2 hPMSCs移植后三組小鼠體重的比較

2.4 小鼠血清SOD、CAT活性和MDA含量的比較 hPMSCs移植后8周，對(duì)照組、模型組和細(xì)胞組血清SOD活性分別為(126.37±10.46)U/ml、(65.09±3.15)U/ml和(108.16±6.13)U/ml，血清CAT活性分別為(11.38±1.91)U/ml、(5.82±1.31)U/ml和(9.33±0.85)U/ml，血清MDA含量分別為(5.44±2.80)nmol/ml、(18.64±4.38)nmol/ml和(10.67±2.09)nmol/ml。模型組與對(duì)照組相比，血清中SOD和CAT活性顯著降低(P<0.05)，血清MDA含量顯著升高(P<0.05)。細(xì)胞組與模型組相比，血清中SOD和CAT活性顯著升高，血清MDA含量顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠血清SOD、CAT活性和MDA含量比較

2.5 小鼠組織中SOD、CAT活性和MDA含量比較 模型組與對(duì)照組相比，小鼠肝臟、脾臟、肺臟和腦組織中SOD活性顯著降低(P<0.05)。細(xì)胞組與模型組相比，小鼠肝臟、脾臟、肺臟和腦組織中SOD活性顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 小鼠組織中SOD活性比較 單位：U/mg prot

模型組與對(duì)照組相比，小鼠肝臟、脾臟、肺臟和腦組織中CAT活性顯著降低(P<0.05)。細(xì)胞組與模型組相比，小鼠肝臟、脾臟、肺臟和腦組織中CAT活性顯著升高(P<0.05),見(jiàn)表5。

表5 小鼠組織中CAT活性比較 單位：U/mg prot

模型組與對(duì)照組相比，小鼠肝臟、脾臟、肺臟和腦組織中MDA含量顯著升高(P<0.05)。細(xì)胞組與模型組相比，小鼠肝臟、脾臟、肺臟和腦組織中MDA含量顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表6。

表6 小鼠組織中MDA含量比較 單位：nmol/ml

3.討論

衰老是一種復(fù)雜的過(guò)程，隨著時(shí)間的推移機(jī)體的組織和器官功能逐漸喪失，衰老與年齡有關(guān)的退行性疾病密切相關(guān)[16]。氧化應(yīng)激理論是衰老的重要理論之一，由于氧自由基(ROS)對(duì)大分子(脂質(zhì)、DNA和蛋白質(zhì))氧化損傷的累積，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)損傷和相應(yīng)功能的喪失，涉及多種疾病如心血管疾病(CVD)、慢性阻塞性肺疾病、慢性腎臟疾病、神經(jīng)退行性疾病、肌肉減少癥、虛弱和癌癥等[16]。ROS水平升高可能導(dǎo)致細(xì)胞衰老，降低ROS水平可以改善細(xì)胞代謝，從而延長(zhǎng)壽命。

文獻(xiàn)報(bào)道，D-gal誘導(dǎo)的小鼠衰老模型，與活性氧化自由基過(guò)剩密切相關(guān)[17～20]。長(zhǎng)期連續(xù)給動(dòng)物注射D-gal，使小鼠細(xì)胞內(nèi)半乳糖濃度增高，引起細(xì)胞代謝紊亂，自由基過(guò)氧化反應(yīng)加劇，產(chǎn)生過(guò)量的超氧陰離子自由基，造成細(xì)胞膜破壞，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，D-gal衰老小鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)遲緩、反應(yīng)遲鈍、攝食量減少、體形瘦削、精神萎靡、毛發(fā)稀疏等典型的衰老體征，并且主要的抗氧化酶SOD和CAT活性顯著降低，MDA含量顯著升高，表明成功建立D-gal衰老小鼠模型。

人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(hPMSCs)具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用，通過(guò)分泌多種生長(zhǎng)因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)和胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)等，促進(jìn)衰老組織再生修復(fù)[21,22],對(duì)衰老相關(guān)的退行性疾病有一定治療潛力[23]。MSCs治療老年衰弱綜合征的Ⅰ期、Ⅱ期臨床試驗(yàn)初步證實(shí)了MSCs的安全性和有效性[15]。最新研究發(fā)現(xiàn)，MSCs通過(guò)SOD和CAT清除氧自由基、減少氧化應(yīng)激，降低MDA水平，實(shí)現(xiàn)抗氧化作用，對(duì)受損組織進(jìn)行修復(fù)[24]。

此外，胎盤是母親和胎兒之間的一個(gè)免疫界面，hPMSCs表達(dá)HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G等免疫耐受分子，在母體對(duì)胎兒的免疫耐受中發(fā)揮重要的作用，比其他來(lái)源的成體MSCs具有更好的免疫調(diào)節(jié)特性[25,26]。

本研究表明，靜脈注射hPMSCs可以改善衰老小鼠的精神狀態(tài)，增加小鼠體重。hPMSCs治療后，衰老小鼠血清、肝臟、脾臟、肺臟和腦組織中，SOD和CAT活性顯著升高(P<0.05)，MDA含量明顯降低(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。hPMSCs可能通過(guò)抗氧化作用發(fā)揮抗衰老作用，為胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞抗衰老的深入研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。