張 瑜，張叁保，申玉建，胡艷，黃艷娜，韋英明，陳少梅，宣澤義，蔣欽楊*

（1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004；2.廣西大學(xué)農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，廣西南寧 530004；3.廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所，廣西家畜遺傳改良重點實驗室，廣西南寧 530005）

努比亞山羊原產(chǎn)于非洲，是世界著名的乳肉兼用型品種，具有體型大、適應(yīng)能力強、繁殖性能高和生長速度快等優(yōu)勢，適用于雜交改良地方品種。隨著全球氣候變暖，熱應(yīng)激（Heat Stress,HS）已成為危害全球畜牧業(yè)的主要環(huán)境應(yīng)激。在高溫條件下，當(dāng)環(huán)境的有效溫度超過活畜的等熱區(qū)時，動物的總熱負荷超過其散熱能力，機體發(fā)生HS 反應(yīng)。而現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)集約化、規(guī)模化的特點更是加重了HS 對畜禽的傷害。據(jù)報道，山羊的等熱區(qū)為20～28℃，適宜的氣候環(huán)境溫度為5～25℃，相對濕度為30%～70%。雖然山羊具有較強的耐受力，但長期處于HS 狀態(tài)，其生長、繁殖性能和免疫功能也會受到損害。骨骼肌是負責(zé)機體運動和平衡的重要器官，在動物的能量儲存和消耗過程中扮演著不可替代的角色。因此，揭示HS 對山羊肌肉生長的影響及作用機制具有重要意義。研究表明，HS 通過降低畜禽采食量影響肌肉生長，最終導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降。在妊娠母豬中，HS 不僅嚴(yán)重影響母豬的生長性能，還會長期影響后代的生長。Li 等研究發(fā)現(xiàn)，孕晚期HS 通過激活MSTN 通路影響仔豬背最長肌肌肉生長，這可能與母豬的乳成分有關(guān)。Gao 等發(fā)現(xiàn)，HS 不僅能誘導(dǎo)細胞凋亡，擾亂細胞周期分布，減少細胞數(shù)量；還可通過Akt/mTOR/S6K 信號通路降低骨骼肌衛(wèi)星細胞數(shù)量。山羊作為在人類生產(chǎn)生活中發(fā)揮重要作用的一類反芻動物，其肌肉組織的生長和組成決定了產(chǎn)肉量和肉品質(zhì)量。因此，揭示HS 對山羊肌肉生長的影響對于畜牧業(yè)具有重要的經(jīng)濟意義。

近年來，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、畜牧等領(lǐng)域，是挖掘特定條件下差異表達基因、揭示分子機制的有效方法。Li 等共發(fā)現(xiàn)HS 湖羊肝臟組織中存在520 個差異表達mRNAs，顯著富集在PPAR 信號通路、維生素消化和吸收等信號通路。Jastrebski 等揭示了HS 通過調(diào)控家禽體內(nèi)負責(zé)調(diào)節(jié)細胞周期、DNA 復(fù)制和DNA 修復(fù)以及免疫功能的基因的表達，從而影響糖代謝、脂肪沉積以及谷胱甘肽生成等過程。Srikanth 等發(fā)現(xiàn)HS 杜洛克豬體內(nèi)上調(diào)基因主要富集在凋亡、toll樣受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和氧化應(yīng)激等信號通路，下調(diào)基因主要富集在免疫應(yīng)答和ATP 合成等信號通路。以上研究均表明，HS 對畜禽的生長發(fā)育至關(guān)重要。目前，有關(guān)HS對畜禽影響的研究主要集中在生長性能、繁殖性能和免疫等方面，但闡述HS 影響肌肉生長發(fā)育機理方面的報道較少。本研究通過建立努比亞山羊HS 模型，采用轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)以期篩選差異表達基因，探究公羊在高溫環(huán)境中肌肉發(fā)育的信號通路，挖掘公羊耐熱相關(guān)的候選基因，為耐熱性公羊的育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 實驗動物 將6 只體況良好、體重相近的努比亞山羊公羊（6 月齡，32.8±3.4 kg）隨機分成對照組（C 組）和熱應(yīng)激組（HS 組），分別飼養(yǎng)于2 個空調(diào)房內(nèi)。每日于08:00 和17:00 飼喂2 次，確保山羊自由采食、自由飲水，飼糧營養(yǎng)水平見表1。定時觀察每只羊的健康及采食狀況。

表1 基礎(chǔ)飼糧營養(yǎng)水平

1.2 主要試劑及儀器 Trizol、PCR 擴增試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；超微量紫外分光光度計購自賽默飛世爾科技有限公司；PCR 儀（BIO-RAD）購自美國Applide Biosystems 公司；Apresys 179-TH 溫濕度記錄儀購自艾普瑞（上海）精密光電有限公司。

1.3 HS 模型建立 實驗山羊分別飼養(yǎng)于2 個空調(diào)房內(nèi)，HS 組空調(diào)房另配有加熱裝置，保證其能控制環(huán)境溫度和相對濕度。預(yù)飼期為7 d，2 個空調(diào)房的初始溫度為23℃，相對濕度為50%。正式實驗為30 d，C 組保持23℃不變，HS 組9:00—17:59 逐漸升溫至35℃，18:00至次日8:59 降溫至30℃。在空調(diào)房中部距離地面1.7 m處掛置Apresys 179-TH 溫濕度記錄儀，設(shè)10 min 為間隔，記錄實驗期間溫度和濕度，利用Tucker 等提出的THI 公式測定環(huán)境溫濕度指數(shù)（THI）：THI=（1.8×T+32）-［（0.55-0.0055×RH）×（1.8×T-26）］，T 為溫度（℃），RH 為相對濕度。

正式實驗結(jié)束后，分別采集2 組山羊腿臀肌肉樣品，用于轉(zhuǎn)錄組測序分析。

1.4 努比亞山羊總RNA 提取 采用Trizol 法提取努比亞山羊腿臀肌肉組織總RNA，紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度，留用濃度>500 ng/μL，且1.6

1.5 轉(zhuǎn)錄組（RNA-Seq）測序分析 提取6 只努比亞山羊肌肉組織總RNA，送至上海歐易生物科技有限公司進行高通量測序?？俁NA 經(jīng)純化后對其完整性和濃度進行檢測，檢測合格的樣品經(jīng)純化后，構(gòu)建mRNA 文庫?；贗llumina HiSeq 測序平臺，對質(zhì)檢合格的文庫進行測序，回收測序數(shù)據(jù)。經(jīng)FastQC 軟件質(zhì)控獲得純凈序列（Clean reads），然后將得到的Reads 比對到參考基因組上，使用FPKM 標(biāo)準(zhǔn)化對HS 組及C 組樣本進行基因表達量分析。

1.6 差異表達基因的分析及篩選 采用檢驗對2 個樣品的基因表達進行差異分析，根據(jù)基因表達量對各樣品進行主成分分析（PCA），對差異表達的基因進行富集分析，通過BLAST 比對GO 與KEGG 數(shù)據(jù)庫，獲得注釋信息，結(jié)合FoldChange>2、<0.05 及基因在通路中的功能等條件篩選出HS 組山羊和C 組山羊肌肉組織的差異表達基因。

1.7 實時熒光定量PCR 以努比亞山羊肌肉組織總RNA 為模板，篩選4 個熱休克蛋白家族的基因，利用實時熒光定量PCR 檢測其相對表達量以評判HS 模型的建立結(jié)果。為進一步驗證RNA-Seq 測序獲得HS 努比亞山羊差異表達基因的準(zhǔn)確性，隨機選擇9 個差異表達基因，對其進行實時熒光定量PCR 驗證。根據(jù)GenBank 發(fā)布的山羊基因序列（登錄號見表2），利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計特異性引物，引物序列見表2。以山羊-肌動蛋白（-，登錄號：XM-018039831.1）為內(nèi)參基因。引物均由南寧捷尼斯生物科技有限公司合成。

表2 實時熒光定量PCR 引物序列

PCR 反應(yīng)體系20 μL：上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA 2 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL，ddHO 7 μL。PCR 擴增程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸15 s，共35個循環(huán)。

1.8 統(tǒng)計分析 THI 數(shù)據(jù)使用Excel 2010 軟件進行統(tǒng)計整理后，采用SPSS 17.0 軟件比較不同處理的均值與標(biāo)準(zhǔn)誤，并進行One-Way ANOVA 方差分析。采用2方法計算基因的相對表達量，利用檢驗進行顯著性分析，并利用GraphPad 軟件進行繪圖，以<0.05 表示差異顯著，<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 HS模型 Tucker 等按THI 將山羊HS分為4個等級：THI<72 時表示無HS；72 ≤THI ≤79 時為輕度HS；7988 時為重度HS。如圖1 所示，實驗期間HS 組空調(diào)房每日平均THI 均在81.18 以上，表明山羊處于高度HS 狀態(tài)，其中00:00—08:50 平均THI 為80.16，9:00—18:59 平均THI 為82.46，19:00 至23:50平均THI 為80.46；C 組空調(diào)房每日平均THI 均在70 以下，表明該條件下山羊沒有處于HS 狀態(tài)。

圖1 實驗期間溫濕度指數(shù)

篩選4 個熱休克蛋白70 家族基因，實時熒光定量PCR 檢測其相對表達量。如圖2 所示，HS 組基因相對表達量高于C 組（<0.01），HS 組基因相對表達量高于C 組（<0.05），表明HS模型建立成功。

圖2 熱休克蛋白家族基因的相對表達量

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的過濾及質(zhì)量評估 將原始的測序數(shù)據(jù)中除去低質(zhì)量、帶接頭的序列后，每個樣品的測序所得數(shù)據(jù)組成見表3。由表3 可知，每個樣品的原始序列數(shù)都在40 M 以上，每個樣本獲得的純凈堿基數(shù)都超過了5 G，6 個樣品共獲得了39 G 的純凈堿基，Q30 均在94% 以上，表明測序質(zhì)量較好，完整性較高，可用于后續(xù)生物信息學(xué)分析。

表3 數(shù)據(jù)產(chǎn)出質(zhì)量情況表

2.3 表達差異分析結(jié)果 轉(zhuǎn)錄組測序共鑒定到20 587個基因，利用DESeq 軟件對各個樣本基因表達進行差異分析，按照表達差異倍數(shù)log|FoldChange|>1、顯著性<0.05 選差異表達基因，結(jié)果顯示，共得到95 個差異基因，其中34 個上調(diào)基因，61 個下調(diào)基因（圖3A）。對所有基因和樣品進行雙向聚類分析，結(jié)果表明，相關(guān)性較高，均一性較好（圖3B）。根據(jù)基因表達量對各樣品進行主成分分析（PCA），距離越近說明樣本間相似性越高。PCA 分析結(jié)果顯示，HS 山羊與對照組山羊樣品分離相對較明顯（圖3C），表明兩組樣本在基因表達的構(gòu)成上存在一定差異。

圖3 差異表達基因分析圖

2.4 差異表達基因的實時熒光定量PCR 驗證結(jié)果 為驗證RNA-Seq 測序結(jié)果的可靠性，選擇9 個差異表達基因（和）進行實時熒光定量PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)和基因在HS 努比亞山羊肌肉組織中的相對表達量低于C 組山羊（<0.01），而和基因在HS 努比亞山羊肌肉組織中的相對表達量高于C 組山羊（<0.01）（圖4），即實時熒光定量PCR 檢測結(jié)果與RNA-Seq 測序結(jié)果趨勢一致。

圖4 差異表達基因RT-PCR 驗證分析

2.5 差異表達基因的GO 功能富集分析 對差異表達基因進行GO 功能富集分析，結(jié)果顯示共涉及509 個GO 條目，分為3 個大類：細胞組分（Cellular Component，67個）、分子功能（Molecular Function，127 個）和生物學(xué)過程（Biological Process，315 個）。選取每個大類中富集最顯著的前10 個功能類別進行分析，結(jié)果顯示，差異上調(diào)基因主要富集在氧載體活性（Oxygen Carrier Activity）、氧結(jié)合（Oxygen Binding）、血紅素結(jié)合（Heme Binding）、血紅蛋白復(fù)合體（Hemoglobin Complex）和細胞質(zhì)核區(qū)（Perinuclear Region of Cytoplasm）等功能；差異下調(diào)基因主要富集在等離子膜（Plasma Membrane）、薄膜的整體組成部分（Integral Component of Membrane）、細胞外空間（Extracellular Space）和鈣離子結(jié)合（Calcium Ion Binding）等功能（圖5）。

圖5 差異表達基因的GO 功能富集分析

2.6 差異表達基因的KEGG 通路富集分析 KEGG 富集分析結(jié)果顯示，差異表達基因共涉及156 個通路。選取富集最顯著的前20 條KEGG 通路，其中，差異上調(diào)基因主要富集在瘧疾（Malaria）、非洲錐蟲病（African Trypanosomiasis）、自然殺傷細胞介導(dǎo)細胞毒性（Natural Killer Cell Mediated Cytotoxicity）和人類免疫缺陷病毒1 感染（Human Immunodeficiency Virus 1 Infection）等通路；差異下調(diào)基因富集在MAPK 信號通路（MAPK Signaling Pathway）、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化（Fluid Shear Stress and Atherosclerosis）和Ras 信號通路（Ras Signaling Pathway）（圖6）；包含差異基因較多的通路與免疫反應(yīng)和能量代謝密切相關(guān)。

圖6 差異表達基因的KEGG 通路富集分析

挑選與肌肉發(fā)育相關(guān)且顯著差異基因富集較多的8個通路，包括細胞黏附分子（CAMs）、MAPK 信號通路（MAPK Signaling Pathway）、自然殺傷細胞介導(dǎo)的細胞毒性（Natural Killer Cell Mediated Cytotoxicity）、GnRH 信號通路（GnRH Signaling Pathway）、Fc介導(dǎo)的吞噬作用（Fc Gamma R-Mediated Phagocytosis）、黏著斑（Focal Adhesion）、磷脂酶D 信號通路（Phosp holipase D Signaling Pathway）、mTOR 信號通路（mTOR Signaling Pathway），共包含16 個差異基因，其中等可能參與調(diào)控HS 山羊肌肉生長發(fā)育（表4）。

表4 HS 山羊肌肉組織差異表達基因顯著性富集的8 條KEGG 信號通路

3 討 論

3.1 HS 對HSP70 家族基因表達的影響 HS 是指動物受到熱環(huán)境的刺激后，溫度感受器發(fā)出神經(jīng)沖動，刺激體溫調(diào)節(jié)中樞，而機體自身的體溫調(diào)節(jié)能力不足，引發(fā)的一系列非特異性反應(yīng)。當(dāng)機體在受到應(yīng)激刺激時，組織細胞會快速產(chǎn)生熱休克蛋白來抵抗應(yīng)激帶來的損傷。研究表明，HSP70 是熱休克蛋白家族中最保守、含量最豐富的一種非特異性內(nèi)源保護蛋白，具有保護變性蛋白折疊、展開和復(fù)性的伴侶活性。有研究表明，HSP70 在熱休克蛋白家族中，對溫度變化最為敏感。Nagayach 等和Banerjee 等通過研究 不同季節(jié)對動物HSP70 家族基因的影響，發(fā)現(xiàn)夏季基因表達量明顯高于冬季。白丹丹研究發(fā)現(xiàn)，三河牛血淋巴細胞HSP70 家族基因（和）的表達量在冷熱應(yīng)激期均顯著升高，說明動物機體在應(yīng)激條件下，自主提高自我保護機制和對外界不良刺激的應(yīng)對能力。彭孝坤研究發(fā)現(xiàn)，HS 肉羊血淋巴細胞和mRNA 表達量都有不同程度的升高，這與本研究結(jié)論一致。眾多報道表明，HSP70 可作為動物冷熱應(yīng)激的重要分子生物標(biāo)志物。因此，本研究選取HSP70 家族中具有代表性的4 個基因，結(jié)果表明，HS 山羊肌肉組織中基因相對表達量都有不同程度的升高，證明HS 模型建立成功。

3.2 HS 對肌肉發(fā)育的影響 肌肉發(fā)育在生物個體生長發(fā)育過程中必不可少，由多個基因和外界環(huán)境共同調(diào)控，是現(xiàn)代動物科學(xué)的重要研究方向之一。目前，有關(guān)轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)應(yīng)用于篩選HS 山羊肌肉發(fā)育相關(guān)候選基因的研究很少，所以利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)挖掘調(diào)控HS 山羊肌肉發(fā)育的潛在基因具有重要意義。HS 通過增加動物體內(nèi)的熱負荷，擾亂正常的新陳代謝，除了引起生長速度、采食量和繁殖能力下降外，還會影響肌肉的生理變化，進而降低肌肉生長，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。Ma 等研究發(fā)現(xiàn)，慢性HS 通過下調(diào)IGFs-mTOR 信號通路，導(dǎo)致胸肌質(zhì)量和產(chǎn)量降低，肌肉蛋白質(zhì)合成和氨基酸轉(zhuǎn)運減少，肉雞的生長性能降低。Barnes 等研究發(fā)現(xiàn)，HS 羔羊的采食量、肌肉生長和代謝效率降低，導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降。Gao 等發(fā)現(xiàn)，短期HS 通過激活A(yù)kt/mTOR/S6K 信號通路顯著促進骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖，長期HS 通過抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡降低骨骼肌衛(wèi)星細胞數(shù)量。本研究發(fā)現(xiàn)，HS 山羊肌肉組織中有和等16 個與肌肉發(fā)育相關(guān)的差異表達基因，它們主要富集在8 個通路，包括細胞黏附分子、MAPK 信號通路、自然殺傷細胞介導(dǎo)的細胞毒性、GnRH 信號通路、Fc介導(dǎo)的吞噬作用、黏著斑、磷脂酶D 信號通路、mTOR信號通路。一些與肌肉發(fā)育相關(guān)的通路已被確認，包括GnRH 信號通路、mTOR 信號通路和MAPK 信號通路。有研究表明，MAPK 信號通路是骨骼肌中響應(yīng)氧化、能量和應(yīng)激的主調(diào)控因子，能夠?qū)⒐趋兰≈械募毎麘?yīng)激與適應(yīng)性反應(yīng)結(jié)合起來，其失調(diào)會阻礙骨骼肌的適應(yīng)潛能。另有研究表明，MAPK 信號通路參與骨骼肌生成、肌肉損傷和分化，是激活程序性細胞死亡所必需的，而本研究中MAPK 信號基因的富集可能提示骨骼肌細胞損傷和凋亡的觸發(fā)。Jaafar等研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酶D 信號通路參與肌肉發(fā)育并決定肌肉細胞大小。MAPK、黏著斑和Fc介導(dǎo)的吞噬作用可影響衛(wèi)星成纖維細胞的增殖分化。此外，參考他人對骨骼肌發(fā)育的相關(guān)研究，本研究在參與肌肉生長發(fā)育較為經(jīng)典的通路中篩選出5 個顯著差異表達基因：，其中基因調(diào)控肌肉發(fā)育已有相關(guān)報道，但是和基因的調(diào)控機制還需要更深一步的研究。成纖維細胞生長因子（FGFs）可調(diào)節(jié)肌原細胞的增殖和分化，而Fgf1 作為首次報道的肌細胞生長因子，在成肌細胞中具有有絲分裂作用。研究表明，F(xiàn)gf1 在體外和體內(nèi)都能刺激不同動物成肌細胞的增殖和抑制分化。雙特異性蛋白磷酸酶1（DUSP1），這種磷酸酶可使絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）失活，由此推斷基因可能與HS條件下的肌肉發(fā)育相關(guān)。Zhou 等研究發(fā)現(xiàn)，MET是關(guān)節(jié)彎曲的致病基因，MET 突變可能導(dǎo)致人類骨骼肌發(fā)育不良；而在本研究HS 山羊中，基因差異表達且富集在多條與肌肉發(fā)育相關(guān)的通路上，由此推斷，基因可能參與調(diào)控肌肉發(fā)育。綜上，HS 可能通過MAPK 信號通路、磷脂酶D 信號通路、mTOR 信號通路、黏著斑等信號通路共同發(fā)揮作用，調(diào)控細胞的增殖、凋亡和相關(guān)基因的差異表達，最終影響肌肉發(fā)育過程。

4 結(jié) 論

本研究對努比亞山羊肌肉組織HS 組和C 組進行轉(zhuǎn)錄組分析，共檢測到20 587 個基因，95 個差異表達基因（34 個顯著上調(diào)，61 個顯著下調(diào)）。通過檢測差異表達基因及相關(guān)信號通路，篩選出和等5 個可能調(diào)控肌肉發(fā)育的潛在基因，并主要富集在細胞黏附分子、MAPK 信號通路、磷脂酶D 信號通路和黏著斑等信號通路。本研究結(jié)果為豐富努比亞山羊肌肉組織轉(zhuǎn)錄組信息提供數(shù)據(jù)，為耐熱性山羊的育種提供理論基礎(chǔ)。