王小燕，李虎玲，張 晶，王 凱

（新疆醫(yī)科大學(xué) a. 公共衛(wèi)生學(xué)院；b. 醫(yī)學(xué)工程技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830017）

宮頸癌（cervical cancer，CC）作為最常見的女性惡性腫瘤之一，是女性癌癥死亡的第四大原因，2020年全世界約有60.4萬新發(fā)病例和34.2萬死亡病例［1］。雖然對宮頸癌的早期篩查和預(yù)防接種工作有所擴(kuò)大，但全球?qū)m頸癌新發(fā)病例數(shù)量仍持續(xù)增加，這意味著宮頸癌仍是一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問題［2］。目前，仍缺乏有效地指導(dǎo)宮頸癌治療的預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。因此，尋找新的生物標(biāo)志物，探討其病理機(jī)制，對改善宮頸癌患者的生存具有重大價(jià)值。

磷脂酶A2-VII（phospholipase A2 groupⅦ，PLA2G7）的基因位于6號染色體6p12.3條帶，編碼的蛋白質(zhì)為Lp-PLA2，又名PAF-AH［3］。既往研究表明，PLA2G7是一種腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞衍生因子［4］，在調(diào)節(jié)肝癌［5］、乳腺癌［6］、前列腺癌（prostate adenocarcinoma，PRAD）［7］的細(xì)胞遷移中起關(guān)鍵作用。目前，有關(guān)PLA2G7在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用研究鮮有報(bào)道。本文旨在通過多種腫瘤數(shù)據(jù)庫探索PLA2G7在宮頸癌中的表達(dá)、預(yù)后價(jià)值及其生物學(xué)功能情況，以期作為預(yù)測宮頸癌免疫治療應(yīng)答的新的生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 cBioPortal數(shù)據(jù)庫分析

cBioPortal數(shù)據(jù)庫（https://www.cbioportal.org/）可用于多種癌癥基因組數(shù)據(jù)集的交互式探索［8］。該數(shù)據(jù)庫包含TCGA數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov/）的同源數(shù)據(jù)，可用于研究體細(xì)胞突變、DNA拷貝數(shù)突變、DNA甲基化和其他基因類型。本研究使用該數(shù)據(jù)庫分析PLA2G7基因在所有TCGA腫瘤類型中的突變類型和拷貝數(shù)改變信息。在cBioPortal數(shù)據(jù)庫首頁點(diǎn)擊“Quick select”中的“TCGA PanCancer Atlas Studies”，然后點(diǎn)擊“Query By Gene”，輸入基因名稱“PLA2G7”進(jìn)行分析。

1.2 GEO數(shù)據(jù)庫分析

GEO數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）是數(shù)據(jù)集的國際公共數(shù)據(jù)庫，包括來自單通道和雙通道測定mRNA表達(dá)的數(shù)據(jù)以及基因組DNA和蛋白質(zhì)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)［9］。本研究使用GEO中的GEO2R分析平臺(tái)識別4個(gè)表達(dá)譜數(shù)據(jù)集（GSE63514、GSE67522、GSE9750和GSE7803）中PLA2G7的差異表達(dá)。GSE63514包含28個(gè)宮頸腫瘤組織和24個(gè)宮頸正常組織，GSE67522包含20個(gè)宮頸腫瘤組織和22個(gè)宮頸正常組織，GSE9750包含27個(gè)宮頸腫瘤組織和24個(gè)宮頸正常組織，GSE7803包含21個(gè)宮頸腫瘤組織和10個(gè)宮頸正常組織。以|log2FC| ＞1和調(diào)整P值（adj.P）＜0.05為差異基因的篩選條件。

1.3 GEPIA2數(shù)據(jù)庫分析

GEPIA2（http://gepia2.cancer-pku.cn）是最近發(fā)布的分析工具，包含8 587個(gè)正常樣本和9 736個(gè)腫瘤樣本的RNA測序表達(dá)數(shù)據(jù)，可用于差異分析、患者生存分析和相關(guān)性分析［10］。使用“Profile”工具確定泛癌中PLA2G7表達(dá)水平，“Survival Map”工具確定泛癌中PLA2G7表達(dá)與總生存（overall survival，OS）的關(guān)聯(lián)，對數(shù)秩檢驗(yàn)比較高表達(dá)PLA2G7組與低表達(dá)PLA2G7組的患者Kaplan-Meier生存圖。

1.4 PLA2G7表達(dá)在臨床特征亞組中的預(yù)后分析

在TCGA數(shù)據(jù)庫中下載宮頸癌患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床特征數(shù)據(jù)。排除總生存時(shí)間為0 d的患者，以PLA2G7表達(dá)的中位數(shù)為截?cái)嘀?，分為高表達(dá)和低表達(dá)兩個(gè)亞組。采用分層Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析PLA2G7在不同臨床特征亞組中的預(yù)后情況。

1.5 基因集富集分析和基因集變異分析

采用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）和基因集變異分析（gene set variation analysis，GSVA）方法研究PLA2G7在宮頸癌中的生物學(xué)功能。從GSEA官方網(wǎng)站（http://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp）下載基因本體（gene ontology，GO）基因集文件c5.go.v7.4.symbols.gmt和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）基因集文件c2.cp.kegg.v7.4.symbols.gmt。R中的GSEABase和GSVA包分別用于GSEA分析和GSVA分析，并能將與PLA2G7表達(dá)相關(guān)的5個(gè)富集基因集和15條信號通路進(jìn)行可視化。

1.6 TIMER數(shù)據(jù)庫分析

TIMER數(shù)據(jù)庫（https://cistrome.shinyapps.io/timer/）是系統(tǒng)分析不同癌癥類型免疫浸潤的綜合資源，擁有來自TCGA數(shù)據(jù)庫的大部分同源數(shù)據(jù)［11］。通過“Gene”模塊分析PLA2G7表達(dá)與免疫浸潤細(xì)胞豐度的相關(guān)性，包括B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞。此外，通過“Correlation”模塊探索了PLA2G7表達(dá)與腫瘤浸潤免疫細(xì)胞基因標(biāo)志物之間的相關(guān)性。腫瘤浸潤免疫細(xì)胞包括CD8+T細(xì)胞、T細(xì)胞（一般）、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophage cell，TAM）、M1巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）、樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）、輔助性T1細(xì)胞（type 1 T helper cell，Th1）、輔助性T2細(xì)胞（type 2 T helper cell，Th2）、濾泡輔助T細(xì)胞（T follicular helper cell，Tfh）、輔助性T17細(xì)胞（type 17 T helper cell，Th17）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Tregs）和衰竭T細(xì)胞。這些腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的基因標(biāo)志物在以往的研究中已被引用［12］。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用R語言（版本3.6.2）分析數(shù)據(jù)。采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析在臨床特征亞組中的PLA2G7表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，并計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)值及其95%置信區(qū)間。基因表達(dá)的相關(guān)分析通過Spearman相關(guān)性和統(tǒng)計(jì)顯著性進(jìn)行評估。相關(guān)性的強(qiáng)度使用以下絕對值指南確定：0～0.19“非常弱”，0.20～0.39“弱”，0.40～0.59“中等”，0.60～0.79“強(qiáng)”，0.80～1.00“非常強(qiáng)”。P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 PLA2G7基因在泛癌中的遺傳變異情況

研究使用cBioPortal數(shù)據(jù)庫，對PLA2G7基因的遺傳變異進(jìn)行了泛癌分析。該數(shù)據(jù)包括32項(xiàng)TCGA泛癌研究中的10 953例患者/10 967例樣本，基因改變的頻率為2.1%。較為常見的DNA改變是擴(kuò)增和突變。在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（lymphoid neoplasm diffuse large B-cell lymphoma，DLBC）、食管癌（esophageal carcinoma，ESCA）、卵巢漿液性囊腺癌（ovarian serous cystadenocarcinoma，OV）中擴(kuò)增占比較高，在皮膚黑色素瘤（skin cutaneous melanoma，SKCM）、子宮內(nèi)膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC）、子宮肉瘤（uterine carcinosarcoma，UCS）中突變頻率較高（圖1）。

圖1 PLA2G7在泛癌中的遺傳變異Fig. 1 Genetic aberration of PLA2G7 in TCGA pan-cancer

2.2 PLA2G7基因在泛癌中的差異表達(dá)和預(yù)后分析

如表1所示，PLA2G7在4個(gè)宮頸癌GEO數(shù)據(jù)集中的差異表達(dá)分析結(jié)果表明，PLA2G7在宮頸腫瘤組織中的表達(dá)水平顯著高于宮頸正常組織。如圖2a所示，PLA2G7在膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma，BLCA）、宮頸鱗癌和腺癌（cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma，CESC）、結(jié)腸癌（colon adenocarcinoma，COAD）、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、食管癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSC）、腎透明細(xì)胞癌（kidney renal clear cell carcinoma，KIRC）、腎乳頭狀細(xì)胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP）、胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma，PAAD）、前列腺癌、直腸腺癌（rectum adenocarcinoma，READ）、皮膚黑色素瘤、胃癌（stomach adenocarcinoma，STAD）、睪丸癌（testicular germ cell tumors，TGCT）、胸腺癌（thymoma，THYM）、子宮內(nèi)膜癌、子宮肉瘤腫瘤組織中顯著高于其正常組織中的表達(dá)水平。如圖2b所示，PLA2G7表達(dá)水平與宮頸癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。圖3所示的生存曲線表明，PLA2G7高表達(dá)的患者OS較長（Log-rankP=0.030）。

圖2 PLA2G7的表達(dá)和預(yù)后分析Fig. 2 Expression and prognostic analysis of PLA2G7

圖3 PLA2G7在宮頸癌中的生存曲線Fig. 3 Survival curve of PLA2G7 in cervical cancer

表1 PLA2G7在4個(gè)GEO數(shù)據(jù)集中的差異表達(dá)Tab. 1 Differential expression of PLA2G7 in 4 GEO datasets

2.3 PLA2G7表達(dá)在臨床特征亞組中的預(yù)后分析

本研究以PLA2G7表達(dá)的中位數(shù)為截?cái)嘀?，?91例患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組并進(jìn)行單因素Cox回歸分析。如表2所示，在291例宮頸癌患者中，PLA2G7高表達(dá)是影響患者生存的保護(hù)因素（HR=0.50，95%CI：0.31～0.80，P=0.004）。為進(jìn)一步探索PLA2G7表達(dá)是否在宮頸癌患者臨床特征亞組中仍具有預(yù)后價(jià)值，通過對PLA2G7表達(dá)在臨床特征亞組中的單因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)，PLA2G7高表達(dá)在年老組（HR=0.49，95%CI：0.26～0.93，

P=0.030）、stageⅠ&stageⅡ（HR=0.47，95%CI：0.26～0.85，P=0.012）以及G3&G4（HR=0.30，95%CI：0.12～0.71，P=0.006）中與患者良好的預(yù)后顯著相關(guān)（表2）。結(jié)果表明，在預(yù)測宮頸癌患者的生存中PLA2G7高表達(dá)具有較高的預(yù)后價(jià)值。

表2 不同臨床特征亞組中PLA2G7的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系Tab. 2 The relationship between PLA2G7 expression and prognosis in different clinical characteristics subgroups

2.4 GSEA和GSVA

為探索PLA2G7在宮頸癌中表達(dá)的生物學(xué)意義，本研究進(jìn)行了GESA和GSVA分析。如圖4a所示，GSEA分析結(jié)果表明，PLA2G7正向調(diào)節(jié)宮頸癌炎癥反應(yīng)、防御反應(yīng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞膜表面、MAPK級聯(lián)調(diào)控以及凋亡信號通路等相關(guān)功能。如圖4b所示，GSVA分析結(jié)果表明，PLA2G7的表達(dá)與造血細(xì)胞譜系、利什曼原蟲感染、趨化因子信號通路以及一些免疫相關(guān)通路，包括同種異體排斥反應(yīng)、T細(xì)胞受體信號通路、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)等呈正相關(guān)。相反，PLA2G7的表達(dá)與細(xì)胞周期相關(guān)途徑和果糖、丁酸代謝等的特定代謝途徑呈負(fù)相關(guān)。

圖4 宮頸癌中PLA2G7的GSEA和GSVA分析Fig. 4 GSEA and GSVA analysis of PLA2G7 in cervical cancer

2.5 PLA2G7表達(dá)與免疫浸潤細(xì)胞相關(guān)

圖5表明，在宮頸癌患者中，PLA2G7表達(dá)與腫瘤純度（r=-0.323，P=3.60e-08）、B細(xì)胞（r=0.274，P=3.68e-06）、CD8+T細(xì)胞（r=0.447，P=7.51e-15）、CD4+T細(xì)胞（r=0.440，P=1.51e-14）、巨噬細(xì)胞（r=0.367，P=3.07e-10）、中性粒細(xì)胞（r=0.487，P=6.47e-18）和樹突狀細(xì)胞（r=0.697，P=1.55e-41）的浸潤水平顯著相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)提示，PLA2G7在宮頸癌免疫浸潤中發(fā)揮特定作用，尤其是在中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中。

圖5 宮頸癌中PLA2G7與免疫浸潤細(xì)胞水平的相關(guān)性Fig. 5 Correlation analysis between PLA2G7 and immune infiltration cells level in cervical cancer

2.6 PLA2G7表達(dá)與免疫標(biāo)記基因的相關(guān)性分析

如表3所示，通過純度相關(guān)性調(diào)整后，在TIMER數(shù)據(jù)庫中PLA2G7表達(dá)與免疫細(xì)胞基因標(biāo)記物CD8A、CD3D、CD3E、CD2、CD68、IL10、VSIG4、CD11b（ITGAM）、CCR7、HLA-DPB1、HLA-DRA、HLA-DPA1、T-bet（TBX21）、STAT4、STAT1、IFN-γ（IFNG）、FOXP3、CCR8、PD-1（PDCD1）、LAG3和GZMB的表達(dá)之間存在中等強(qiáng)度的相關(guān)性，并與免疫細(xì)胞基因標(biāo)記物CD86、CD115（CSF1R）、CD163、MS4A4A、CD11c（ITGAX）、CTLA4和TIM-3（HAVCR2）的表達(dá)存在強(qiáng)相關(guān)性。這些基因標(biāo)記物主要為CD8+T細(xì)胞、T細(xì)胞（一般）、單核細(xì)胞、TAM、M2巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞以及不同功能性T細(xì)胞，如Th1細(xì)胞、Tregs細(xì)胞和衰竭T細(xì)胞的標(biāo)記蛋白。

表3 （續(xù)） Tab. 3 (continued)

表3 PLA2G7與免疫細(xì)胞基因標(biāo)志物的相關(guān)性分析Tab. 3 Correlation analysis between PLA2G7 and relate genes and markers of immune cells

3 討論

PLA2G7編碼蛋白Lp-PLA2（又名PAF-AH），是一種與脂蛋白結(jié)合的血漿酶，主要由巨噬細(xì)胞和活化的血小板產(chǎn)生［13-14］。既往研究表明，Lp-PLA2可以作為心腦血管疾病的炎癥生物標(biāo)志物［15］，對預(yù)測心腦血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)具有重要價(jià)值。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，PLA2G7作為巨噬細(xì)胞衍生因子調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的遷移［16］。在鼻咽癌細(xì)胞中，PLA2G7可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和存活［17］；在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤［18］、乳腺癌［6］、前列腺癌［7］細(xì)胞中也有類似的發(fā)現(xiàn)。目前，在宮頸癌中有關(guān)PLA2G7的研究鮮有報(bào)道。本研究分析了PLA2G7在宮頸癌患者中的表達(dá)、預(yù)后價(jià)值及其生物學(xué)功能，這為進(jìn)一步研究PLA2G7在宮頸癌中的作用奠定了基礎(chǔ)。

研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，PLA2G7在多種腫瘤組織中顯著高表達(dá)。生存分析表明：PLA2G7高表達(dá)組的宮頸癌患者預(yù)后更好；同時(shí)，在全人群中的Cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型顯示，PLA2G7為保護(hù)因素；在年老組、stageⅠ&stageⅡ及G3&G4中，PLA2G7的高表達(dá)患者預(yù)后較好，而在年輕組、stageⅢ&stageⅣ和G1&G2中，PLA2G7的高表達(dá)與患者的預(yù)后無關(guān)。由此表明，在不同患者的臨床亞組分析中，PLA2G7高表達(dá)能夠穩(wěn)定地預(yù)測患者的生存。在BRCA1突變卵巢癌中的研究表明［19］，PLA2G7高表達(dá)與總生存期的延長顯著相關(guān)，并首次表明其保護(hù)特性可能與負(fù)調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路相關(guān)。這與本研究中PLA2G7高表達(dá)在宮頸癌患者中的預(yù)后價(jià)值一致，表明PLA2G7可作為宮頸癌的預(yù)后生物標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)，PLA2G7表達(dá)與宮頸癌患者不同的免疫浸潤水平相關(guān)。結(jié)果表明，PLA2G7表達(dá)與CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞存在中等強(qiáng)度的相關(guān)性。腫瘤純度是由臨床腫瘤樣本中的表達(dá)數(shù)據(jù)計(jì)算而來，是分析免疫浸潤水平的重要影響因素［20］。通過TIMER數(shù)據(jù)庫，進(jìn)一步探索PLA2G7表達(dá)與腫瘤純度調(diào)整后的免疫浸潤細(xì)胞基因標(biāo)記物的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，PLA2G7的表達(dá)與多種免疫浸潤細(xì)胞基因標(biāo)記物之間存在顯著相關(guān)性。例如，PLA2G7的表達(dá)與T細(xì)胞的基因標(biāo)記物CD3D、CD3E、CD2的表達(dá)存在中等相關(guān)性，與單核細(xì)胞基因標(biāo)記物CD86和CSF1R以及M2巨噬細(xì)胞基因標(biāo)記物CD163和MS4A4A的表達(dá)呈強(qiáng)相關(guān)性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，PLA2G7的表達(dá)與輔助T細(xì)胞的基因標(biāo)記物T-bet（TBX21）、STAT4、STAT1和IFN-γ（IFNG）的表達(dá)存在顯著相關(guān)性，表明PLA2G7可能調(diào)節(jié)宮頸癌中輔助T細(xì)胞功能的潛在機(jī)制。此外，PLA2G7的表達(dá)與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和衰竭T細(xì)胞的基因標(biāo)記物FOXP3、CCR8、TIM-3、PD-1、CTLA4、LAG3、TIM-3和GZMB的表達(dá)呈正向相關(guān)。其中TIM-3是衰竭T細(xì)胞上的一種關(guān)鍵表面蛋白［21］，與宮頸癌中的PLA2G7表達(dá)高度相關(guān)。由此表明，PLA2G7具有激活調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和誘導(dǎo)T細(xì)胞衰竭的潛力，提示PLA2G7在宮頸癌腫瘤免疫中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

GSEA和GSVA分析了PLA2G7在宮頸癌中的生物學(xué)功能和潛在影響的信號通路，發(fā)現(xiàn)PLA2G7主要在炎癥反應(yīng)、防御反應(yīng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞膜表面、MAPK級聯(lián)調(diào)控以及凋亡信號通路發(fā)揮相關(guān)功能。同時(shí)，PLA2G7的表達(dá)與細(xì)胞黏附分子CAMS、造血細(xì)胞譜系、趨化因子信號通路以及一些免疫相關(guān)通路顯著相關(guān)，表明PLA2G7在宮頸癌患者中具有潛在的免疫調(diào)節(jié)作用，從而改善宮頸癌患者的生存狀況。

綜上所述，本研究基于多種腫瘤數(shù)據(jù)庫以生物信息學(xué)方法分析發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌患者中PLA2G7高表達(dá)可能是通過增強(qiáng)免疫細(xì)胞的募集信號通路、調(diào)節(jié)免疫浸潤細(xì)胞的富集，從而改善宮頸癌患者的生存狀況。后期的進(jìn)一步研究主要是進(jìn)行前瞻性試驗(yàn)驗(yàn)證，未來PLA2G7或可成為一個(gè)預(yù)測宮頸癌患者免疫治療應(yīng)答的生物標(biāo)志物。