除磷菌CP-7的篩選及其降解特性研究

王亞軍 司運美

（1.蘭州理工大學(xué)土木工程學(xué)院，蘭州 730050；2.蘭州理工大學(xué)西部土木工程防災(zāi)減災(zāi)教育部工程研究中心，蘭州 730050）

磷是生物中最基本的元素之一，對所有的生理生化過程都至關(guān)重要。然而，磷對水體富營養(yǎng)化的誘導(dǎo)因子高達67%［1-2］，過度排放勢必會導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化，嚴重影響生態(tài)平衡，甚至威脅人類身體健康［3］。因此，污水中磷的去除備受關(guān)注，特別是工業(yè)廢水和生活污水［4］。與傳統(tǒng)物理法和化學(xué)法相比，生物法因其成本低、高效和次生污染少等優(yōu)點仍廣泛應(yīng)用于污水除磷［5］，生物處理法主要是通過微生物自身生長代謝吸收污水中的磷［6］，在短時間內(nèi)聚集超過自身生長所需要的磷并儲存于細胞內(nèi)，達到除磷的目的［7］。

強化生物除磷（enhanced biological phosphorus removal，EBPR）技術(shù)一直是污水處理領(lǐng)域的研究熱點。在EBPR中，除磷菌能夠過度同化磷元素并在有氧條件下儲存于細胞內(nèi)，其選擇性富集承擔去除磷的責任［8］。然而，由于富集除磷菌對磷的去除能力未知，EBPR系統(tǒng)經(jīng)常不能可靠地運行，導(dǎo)致磷去除效果較差［9］。添加高效除磷菌能從根本上有助于EBPR穩(wěn)定高效運行，縮短適應(yīng)時間，大幅度提高除磷效率［10］。目前的研究大多集中在EBPR系統(tǒng)的工藝改進或微生物分析上，忽視了除磷菌的獲取和應(yīng)用，導(dǎo)致除磷菌的種類比較稀少，阻礙了EBPR系統(tǒng)高效除磷。為此，眾多學(xué)者展開了高效除磷菌的篩選及應(yīng)用，Liu等［11］將分離得到的高效除磷菌投入改進中試反應(yīng)器中，除磷率達到將近90%；亢涵等［12］從運行良好的生物除磷SBR反應(yīng)器中篩選出一株高效除磷菌，最適條件下除磷率達到90%以上。因此獲得更高效的除磷菌將有利于提高污水中磷的去除效果，加深對除磷菌的認識，改進除磷菌的分離方法。

除磷菌的降解性能受碳氮源、溫度、PH、鹽濃度、磷濃度和其他細菌等不同因素的影響，研究不同因素下除磷菌降解特性并優(yōu)化最佳降解條件，是高效除磷菌應(yīng)用于強化生物除磷系統(tǒng)并保持高效降解效果的前提。本團隊經(jīng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，蘭州市生活污水中磷濃度與日俱增，給污水廠帶來了一系列問題，最終導(dǎo)致尾水難以長期穩(wěn)定達標。針對這一問題，本研究從蘭州市某生活污水處理廠剩余污泥中篩選分離出對磷具有降解功能的微生物，并進行了菌株鑒定和降解特性研究，旨在為生物強化除磷技術(shù)提供更多的菌種選擇，以期通過原位投加的方式改善污水廠除磷效果不佳的問題。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種分離源 本實驗所用的菌種分離源是蘭州市某生活污水處理廠的剩余污泥，將采集的樣品裝入經(jīng)紫外線殺菌后的封口袋中，放入-20℃的冰箱中保藏備用。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基：蛋白胨 10.0 g/L，酵母膏 5.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，pH 7.0，121℃ 滅菌 20 min；馴化培養(yǎng)基：醋酸鈉 4 g/L，硫酸銨 2.5 g/L，磷酸氫二鈉 12.8 g/L，磷酸二氫鉀 3 g/L，氯化鈉2.5 g/L，硫酸鎂 0.1 g/L，麥芽糖 0.01 g/L，pH 7.0，121℃ 滅菌 20 min；PAOs選擇培養(yǎng)基：馴化培養(yǎng)基中加瓊脂 20 g/L，pH 7.0，121℃ 滅菌 20 min；復(fù)篩培養(yǎng)基：醋酸鈉 4 g/L，硫酸銨 2.5 g/L，牛肉膏 0.22 g/L，七水硫酸亞鐵 0.002 g/L，七水硫酸鎂 0.1 g/L，磷酸二氫鉀 0.1-0.2 g/L，氯化鈉 2.5 g/L，麥芽糖 0.01 g/L，pH 7.0，121℃ 滅菌 20 min。

1.2 方法

1.2.1 高效除磷菌的篩選 稱5 g樣本污泥到三角瓶中并用45 mL無菌水稀釋成泥水混合液，放在恒溫磁力攪拌器上攪拌10 min，使菌膠團充分被打散，靜置數(shù)分鐘后，吸取5 mL上清液接種于100 mL馴化培養(yǎng)基中，在30℃，150 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d為一個周期，然后吸取5 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到新的馴化培養(yǎng)基中，對上述過程循環(huán)進行4個周期。取馴化后的菌液進行梯度稀釋并涂布于PAOs選擇培養(yǎng)基中，在30℃的生化培養(yǎng)箱中進行48 h的培養(yǎng)，挑取不同形態(tài)的菌落進行多次劃線分離菌株直至獲得單菌落。用接種環(huán)挑取純化后的菌種，接入100 mL復(fù)篩培養(yǎng)基中，置于30℃，150 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進行振蕩培養(yǎng)72 h，同時設(shè)未接菌對照，測定培養(yǎng)液中TP的含量，篩選出TP降解率高的菌株。

1.2.2 種子液的制備 挑取一環(huán)菌苔（30℃下培養(yǎng)了24 h）接種到 LB 培養(yǎng)基中，在30℃，150 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，通過調(diào)節(jié)和鏡檢使菌懸液濃度約為1×108CFU/mL。

1.2.3 除磷菌的鑒定 根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［13］對菌株的形態(tài)和生理生化特征進行鑒定。菌株的16S rDNA 測序鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建均由廣州美格生物科技有限公司完成。

1.2.4 除磷菌生長曲線的測定 接種 6%（V/V）的種子液于150 mL 液體LB培養(yǎng)基中，在30℃，150 r/min 的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，每4 h取樣一次用紫外分光光度計測定OD600的值，即為菌體細胞密度，根據(jù)所測定的吸光度值繪制菌株的生長曲線。

1.2.5 除磷菌降解性能影響因素

1.2.5.1 碳源 分別以乙酸鈉、葡萄糖、蔗糖、草酸鈉和淀粉為碳源，將6%（V/V）的種子液轉(zhuǎn)接到不含碳源的50 mL復(fù)篩培養(yǎng)液中，在30℃，150 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中經(jīng)過72 h培養(yǎng)后，測定不同碳源下菌株TP降解率和OD600。

1.2.5.2 氮源 分別以亞硝酸鈉、硫酸銨、氯化銨、硝酸鈉和硝酸鉀為氮源，將6%（V/V）的種子液轉(zhuǎn)接到不含氮源的50 mL復(fù)篩培養(yǎng)液中，在30℃，150 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中經(jīng)過72 h培養(yǎng)后，測定不同氮源下菌株TP降解率和OD600。

1.2.5.3 碳氮比 將6%（V/V）的種子液轉(zhuǎn)接到碳氮比分別為 1∶3、1∶1、3∶1、5∶1、7∶1和10∶1的50 mL復(fù)篩培養(yǎng)液中，在30℃，100 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中經(jīng)過72 h培養(yǎng)后，測定不同碳氮比下菌株TP降解率和OD600。

1.2.5.4 接種量 分別移取2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%（V/V）的種子液，按不同接種量轉(zhuǎn)接到含50 mL復(fù)篩培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中，在30℃，150 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中經(jīng)過72 h培養(yǎng)后，測定不同接種量下菌株TP降解率和OD600。

1.2.5.5 初始pH 接種 6%（V/V）的種子液于50 mL pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 的復(fù)篩培養(yǎng)基中，在30℃，150 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進行72 h培養(yǎng)，測定不同pH下菌株TP降解率和OD600。

1.2.5.6 培養(yǎng)溫度 將6%（V/V）的種子液轉(zhuǎn)接到含50 mL復(fù)篩培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中，分別將培養(yǎng)基置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃ 和40℃，150 r/min 的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進行72 h培養(yǎng)，測定不同溫度下菌株TP降解率和OD600。

1.2.5.7 初始NaCl質(zhì)量濃度 將 6%（V/V）的種子液轉(zhuǎn)接到含50 mL復(fù)篩培養(yǎng)液的250 mL錐形瓶中，該培養(yǎng)基中初始 NaCl 質(zhì)量濃度分別為0、2.5、5.0、7.5、10.0、15.0 g/L，在 30℃，150 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進行72 h培養(yǎng)，分別測定不同NaCl質(zhì)量濃度下菌株TP降解率和 OD600。

1.2.5.8 初始磷酸鹽濃度 將6%（V/V）的種子液轉(zhuǎn)接到磷酸鹽濃度分別為45 mg/L、70 mg/L、90 mg/L、110 mg/L、130 mg/L、155 mg/L的50 mL復(fù)篩培養(yǎng)液中，在30℃，150 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中經(jīng)過72 h培養(yǎng)后，測定不同磷酸鹽濃度下菌株TP降解率和OD600。

1.2.5.9 其他細菌的相互作用 將所篩選除磷菌種子液與一株銅綠假單胞菌（本課題組實驗室保藏，其具有高油脂降解能力［14］）種子液以1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、2∶1、2∶3、3∶1、3∶2 和 4∶1 的比例混合培養(yǎng)，將5%（V/V）的混合種子液轉(zhuǎn)接到100 mL培養(yǎng)液（初始磷酸鹽濃度為140 mg/L，初始油脂濃度為1.5 g/L）中，在30℃，150 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中經(jīng)過72 h培養(yǎng)后，測定不同比例下的TP降解率。以上每組設(shè)置 3 組平行實驗。

1.2.6 檢測項目與方法 除磷率的測定：TP采用鉬銻抗分光光度法，在700 nm處，以去離子水為參比，測吸光度。除磷率計算如下：

除磷率（%）=（CTP1-CTP2）/CTP1×100%

式中，CTP1為水樣初始總磷濃度，CTP2為水樣反應(yīng)后總磷濃度。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 研究數(shù)據(jù)采用 Excel 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，應(yīng)用 Origin 9.0 進行制圖。

2 結(jié)果

2.1 除磷菌的篩選

從PAOs選擇培養(yǎng)基中挑取形態(tài)不同的菌落，經(jīng)劃線分離得到9株菌株。經(jīng)過篩選最終得到一株對TP降解效果最好的CP-7菌株，該菌株在72 h內(nèi)對TP的降解率為58.52%。

2.2 除磷菌的鑒定

如圖1所示，CP-7菌株為革蘭氏陰性菌，其在固體培養(yǎng)基上呈卵圓形不透明狀，菌落形態(tài)特征如表1所示。CP-7菌株的生理生化特征如表2所示。經(jīng)鑒定CP-7菌株與產(chǎn)酸克雷伯氏菌株（Klebsiella oxytoca strain）的相似度在99.785%（表3），基于16S rDNA序列分析與比對對CP-7菌株進一步進行表征，利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。

圖2 CP-7菌株基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of CP-7 strain based on 16S rDNA

表1 CP-7菌株的形態(tài)特征Table 1 Morphological characteristics of CP-7 strain

表2 CP-7菌株的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of CP-7 strain

表3 通過16S rDNA基因序列分析鑒定CP-7菌株Table 3 Identification of CP-7 strain by 16S rDNA gene sequence analysis

圖1 CP-7菌株菌落特征Fig.1 Colony characteristics of CP-7 strain

2.3 除磷菌生長曲線的測定

微生物的生長曲線可以直觀地反映其生長規(guī)律和增殖情況。從圖3可以看出，在接種量為 6%（V/V）的情況下，CP-7菌株在0-24 h能很快適應(yīng)新的環(huán)境，菌體數(shù)量快速增加；24-84 h 時CP-7菌株處于穩(wěn)定生長時期，生長逐漸趨于平緩，OD600處于2.5左右并保持長時間的穩(wěn)定，說明該菌株能較快地適應(yīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的環(huán)境進行自身繁殖，并且穩(wěn)定期維持時間較長；在84 h后CP-7菌株的菌體密度出現(xiàn)略微的衰減，代謝產(chǎn)物的積累和營養(yǎng)物質(zhì)比例失衡影響了微生物的生長，菌體數(shù)量達到峰值。

圖3 CP-7菌株生長曲線Fig.3 Growth curve of CP-7 strain

2.4 除磷菌降解性能影響因素

2.4.1 碳源 由圖4可以看出，在不同碳源條件下，CP-7菌株的生長情況和TP降解率呈現(xiàn)差異，在以葡萄糖為唯一碳源時，CP-7菌株生長最好，除磷效果也最佳，72 h內(nèi)TP降解率達到67.04%；在以乙酸鈉、蔗糖、草酸鈉和淀粉為唯一碳源時，TP降解率均較低；草酸鈉為唯一碳源時，CP-7菌株生長狀況最差，除磷效果也最不理想。所以在本實驗所研究碳源中，葡萄糖是CP-7菌株發(fā)揮除磷能力的最佳碳源。

圖4 碳源對CP-7菌株總磷降解效果的影響Fig.4 Effect of carbon source on the TP degradation of CP-7 strain

2.4.2 氮源 由圖5可以看出，在不同氮源條件下，CP-7菌株的生長情況和TP降解率同樣呈現(xiàn)差異，在以硫酸銨為唯一氮源時，除磷效果最好，72 h內(nèi)TP降解率達到40%左右；在以亞硝酸鈉為唯一氮源時，TP降解率最低且生物量也最少；在以硝酸鈉為唯一氮源時OD600最高，但TP降解率并不高；說明在本實驗所研究氮源中，硫酸銨是CP-7菌株發(fā)揮除磷能力的最佳氮源。

圖5 氮源對CP-7菌株總磷降解效果的影響Fig.5 Effect of nitrogen source on TP degradation of CP-7 strain

2.4.3 碳氮比 探究6種不同C/N對CP-7菌株TP降解率的影響，相關(guān)性分析顯示C/N、TP降解率和OD600三者之間無顯著相關(guān)性（P＞0.05），由圖6可以看出，不同C/N下，CP-7菌株的除磷效果均有所不同；隨C/N的增加，TP降解率呈上升趨勢，其中C/N為5∶1時除磷效果最好，TP降解率達到58.5%，C/N比升至7∶1時，除磷效果開始變差，C/N為1∶3時，除磷效果最差；從生物量來看，C/N為5∶1時OD600最大，達到1.3以上，C/N為1∶3時，OD600最低；過高或過低的C/N使氮源或碳源不足，抑制了CP-7菌株的生長，說明CP-7菌株適宜在C/N比為5∶1下生存。

圖6 C/N對CP-7菌株總磷降解效果的影響Fig.6 Effect of C/N on the TP degradation of CP-7 strain

2.4.4 接種量 由圖7可以看出，接種量對CP-7菌株降解性能影響較大。相關(guān)性分析顯示，接種量為2%-8%時，接種量和TP降解率均與OD600存在顯著正相關(guān)（P＜0.05），當培養(yǎng)基中的接種量僅為2%時，TP降解率即達到了60%以上，說明菌株可以較快的適應(yīng)環(huán)境并降解污染物；當接種量由2%增加到8%時，CP-7菌株TP降解率也不斷增加，接種量為8%時，降解率達到最大75.94%；當接種量大于8%時降解率開始下降，原因可能是菌株的快速繁殖與代謝，使產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物過多積累，加之培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)不足溶解氧含量下降，從而抑制了CP-7菌株降解磷能力；OD600隨接種量的增加而不斷增大，說明接種量會促進菌株的大量增殖，接種量為14%時，OD600達到最大1.169。

圖7 接種量對CP-7菌株總磷降解效果的影響Fig.7 Effect of inoculation amount on the TP degradation of CP-7 strain

2.4.5 初始pH 由圖8可以看出，CP-7菌株可以在pH 4-9之間生長，隨著初始pH的增大CP-7菌株TP降解率不斷提高，pH為4時，降解率最低僅為15.74%，pH為9時，降解率達到最大90.19%，說明該菌具有較廣的pH適應(yīng)范圍，對外界環(huán)境的變化具有一定的緩沖能力；在酸性條件下CP-7菌株OD600小于0.3；當初始pH不斷增大時，OD600也不斷增加，pH為9時OD600達到最大0.975，說明該菌株適合偏堿性環(huán)境；且相關(guān)性分析顯示pH、TP降解率和OD600三者之間存在顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

圖8 pH對CP-7菌株總磷降解效果的影響Fig.8 Effect of pH on the TP degradation of CP-7 strain

2.4.6 培養(yǎng)溫度 由圖9可以看出CP-7菌株對溫度的適應(yīng)范圍較廣，15-40℃均具有一定的降解能力，在低溫15℃時，TP降解率仍可保持在38%左右。20-40℃時，TP降解率基本維持在50%-70%之間，說明CP-7菌株對外界環(huán)境變化具有一定抵抗能力，且相關(guān)性分析顯示，溫度、TP降解率和OD600三者之間無顯著相關(guān)性（P＞0.05）；溫度為30℃時，TP降解率最高達到65.48%，隨后溫度上升降解率降低，原因可能是溫度升高促進了生化反應(yīng)的進行，營養(yǎng)物質(zhì)快速消耗，代謝產(chǎn)物積累過多，抑制了其降解能力。由OD600可以看出在低溫情況下，菌株的生長較快，但是活性不高導(dǎo)致代謝能力較差，而當溫度越高菌株代謝活動加快，在72 h后菌體密度不斷減小。

圖9 溫度對CP-7菌株總磷降解效果的影響Fig.9 Effect of temperature on the TP degradation of CP-7 strain

2.4.7 初始NaCl質(zhì)量濃度 由圖10中可以看出，當初始NaCl質(zhì)量濃度處在0-15 g/L時，CP-7菌株對TP均有降解效果，相關(guān)性分析顯示，初始NaCl濃度與TP降解率之間存在顯著負相關(guān)（P＜0.05）。當NaCl質(zhì)量濃度為2.5 g/L時，CP-7菌株TP降解率達到最大57.02%，此時菌體密度也處于最大；隨著環(huán)境中NaCl質(zhì)量濃度不斷增大，CP-7菌株細胞中的水不斷向細胞外滲，影響菌株生長，導(dǎo)致TP降解率不斷下降，說明NaCl濃度會在一定程度上抑制菌株對磷的吸收；為驗證在低滲情況下CP-7菌株的生長狀況，本研究對NaCl質(zhì)量濃度為0時的情況做了實驗，結(jié)果顯示在不加NaCl時CP-7菌株生長情況良好，TP降解率仍有46.94%，主要是培養(yǎng)基中含有部分鹽離子，其可以簡單維持細胞的滲透壓，說明低滲狀態(tài)對CP-7菌株的生長代謝影響不大。

圖10 初始NaCl濃度對CP-7菌株總磷降解效果的影響Fig.10 Effect of initial NaCl concentration on the TP degradation of CP-7 strain

2.4.8 初始磷酸鹽濃度 由圖11可以看出，初始磷酸鹽濃度對CP-7菌株除磷效果影響較大，初始磷酸鹽濃度處于45-90 mg/L時，除磷效果較好，且濃度為70 mg/L時，TP降解率最高，達到53%，說明CP-7菌株能適應(yīng)磷濃度變化；相關(guān)性分析顯示，初始磷酸鹽濃度與TP降解率之間存在顯著負相關(guān)（P＜0.05），當環(huán)境中磷酸鹽濃度大于90 mg/L時，TP降解率明顯下降，磷濃度較高時，CP-7菌株除磷量逐漸達到飽和使除磷過程趨于停止，導(dǎo)致TP降解率下降；初始磷酸鹽濃度對CP-7菌株生物量影響較小，初始磷酸鹽濃度45-155 mg/L之間時，OD600均在1.0之上，且濃度為70 mg/L時OD600最高為1.21。

圖11 初始磷酸鹽濃度對CP-7菌株總磷降解效果的影響Fig.11 Effect of initial phosphate concentration on the TP degradation of CP-7 strain

2.4.9 其他細菌的相互作用 由圖12可以看出，銅綠假單胞菌YZ-1對CP-7菌株降解性能具有促進作用，從而使TP降解率大幅提高，在CP-7/YZ-1為4∶1時，除磷效果最好，TP降解率達到99.43%；在CP-7/YZ-1為1∶4時，除磷效果最差，原因是此比例下除磷菌含量最少，使細菌整體除磷效果最弱，其余各組TP降解率均在90%以上，說明CP-7菌株能和YZ-1菌株協(xié)同參與水中磷的去除，可能原因是兩者之間產(chǎn)生群體感應(yīng)，群體感應(yīng)信號分子促進了某些功能基因的表達，但其中的機理有待進一步確定。

圖12 YZ-1菌株對CP-7菌株總磷降解效果的影響Fig.12 Effect of YZ-1 strain on the TP degradation of CP-7 strain

3 討論

本研究對CP-7菌株降解性能影響因素進行探究，分別從碳氮源種類、C/N、接種量、pH、溫度、NaCl濃度、磷酸鹽濃度和其他細菌幾個方面進行討論。

常見的碳源有糖類、有機酸和油脂等，不同碳源成分和分解速率存在差異，細菌對其利用情況也有所不同；實際污水中有機物成分復(fù)雜，微生物會優(yōu)先利用適合自身的有機物達到去除污染物的目的；蔡曼莎等［15］證明碳源種類會影響細菌除磷能力并改變微生物菌群組成。本實驗中CP-7菌株在以葡萄糖為唯一碳源時，除磷效果最好。氮源影響菌體細胞的生長從而影響污染物去除效果，多數(shù)細菌能以銨鹽作為氮源，獲得較高的生物量和污染物去除效果［16］，本實驗中CP-7菌株在以硫酸銨為唯一氮源時，除磷效果最好。

C/N對微生物細胞生長和代謝都至關(guān)重要，不同細菌對碳源和氮源的需求不同，一般來說，細菌對氮源需求較大，真菌和放線菌等對碳源需求較大［16-17］，此外有研究稱根據(jù)元素分析，微生物細胞的碳氮比一般處于3∶1-5∶1之間［18］，本研究發(fā)現(xiàn)CP-7菌株在C/N為5∶1時除磷效果最好，符合微生物細胞碳氮比一般規(guī)律。

接種量的多少影響微生物的生長代謝能力。接種量少會降低體系中微生物數(shù)量，導(dǎo)致培養(yǎng)時間延長；接種量多會使體系中生長空間和微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)不足，抗微生物化合物產(chǎn)生并過度積累，從而抑制微生物的生長［19］，另外，當接種量過大時，菌種會大量繁殖而聚集成球，導(dǎo)致體系中溶解氧的含量下降［20］。吳曉娜等［21］在研究不同接種量體系下反硝化聚磷菌脫氮除磷特性時發(fā)現(xiàn)，較低和較高的接種量均會使磷酸鹽去除率降低，本研究CP-7菌株接種量為8%時，除磷效果最好，較低和較高接種量下除磷效果均有所下降，與吳等人的研究結(jié)果一致。

pH是影響微生物生命活動的關(guān)鍵因素之一。一方面，pH會作用酶活性，改變核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子所帶電荷，影響微生物細胞生命活動；另一方面，pH可以改變營養(yǎng)物質(zhì)的性質(zhì)和微生物生長環(huán)境中有毒有害物質(zhì)的毒性［20］。微生物細胞內(nèi)的DNA、ATP 等物質(zhì)對酸較為敏感，而RNA、磷脂等對堿較為敏感［22］，微生物在最適pH下活性最高。本研究CP-7菌株pH為9時除磷效果最好，這與大多數(shù)研究結(jié)論一致，活性污泥中的除磷菌在中性和偏堿性環(huán)境下占據(jù)優(yōu)勢，除磷效果較好［23-24］。

溫度是影響微生物生命活動的另一關(guān)鍵因素。低溫會導(dǎo)致膜凝膠，阻礙營養(yǎng)物質(zhì)運輸［25］，從而影響微生物生長，更甚者會使原生質(zhì)體內(nèi)水分結(jié)冰，導(dǎo)致微生物死亡［14］；高溫會使微生物中酶和核酸變性失活，也會導(dǎo)致其死亡。本實驗研究發(fā)現(xiàn)CP-7菌株在20-40℃均有較好的除磷效果，溫度適應(yīng)范圍廣。

NaCl濃度較低時，由于滲透壓變化，廢水中的水分子會大量滲入微生物體內(nèi)，使微生物細胞膨脹，嚴重時會使細胞破裂死亡；NaCl濃度較高時，溶液中具有更高的離子強度和更多的電解質(zhì)，可能會影響酶活性，增加滲透壓并形成磷復(fù)合物，嚴重時細胞脫水死亡［26］。本研究CP-7菌株最佳初始NaCl濃度為2.5 g/L，說明適量的鹽離子會促進微生物性能。

溶液中的磷酸鹽濃度影響除磷菌生長和除磷效果，一般來說在一定范圍內(nèi)，隨著初始磷濃度的增加，除磷菌除磷能力逐漸增強，但培養(yǎng)基內(nèi)部細菌數(shù)量有限，當初始磷濃度達到一定值后，磷的含量便高于細菌所能利用的總量，以致磷降解率下降［27］，CP-7菌株隨初始磷酸鹽濃度的增加，TP降解率先上升后下降，與上述結(jié)論一致。

在水系統(tǒng)中，除磷菌降解性能不僅與環(huán)境有著密切關(guān)系，細菌與細菌之間也能夠彼此制約相互影響。銅綠假單胞菌在水環(huán)境中廣泛存在，并在實際污染物降解過程中發(fā)揮重要作用，其能和克雷伯氏菌相互作用，細菌之間通過產(chǎn)生信號分子協(xié)調(diào)多種基因的表達，調(diào)節(jié)微生物群落結(jié)構(gòu)［28-29］，進而影響污染物去除效果，本研究發(fā)現(xiàn)CP-7菌株與一株銅綠假單胞菌共同作用使除磷效果大大提升，進一步證明了產(chǎn)酸克雷伯氏菌與銅綠假單胞菌間存在相互作用，從而影響污染物去除效果。

相關(guān)性分析顯示，CP-7菌株TP降解率與接種量、初始NaCl濃度和初始磷酸鹽濃度pH具有較高的相關(guān)性，可為后續(xù)CP-7菌株實際應(yīng)用中的參數(shù)調(diào)節(jié)提供理論參考。

4 結(jié)論

從蘭州市某生活污水處理廠取得剩余污泥，將其富集馴化、分離篩選獲得一株除磷菌，經(jīng)過鑒定CP-7菌株與產(chǎn)酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca strain）的相似度為99.785%，確定該菌株為產(chǎn)酸克雷伯氏菌。初步測定CP-7菌株降解能力，其72 h內(nèi)對TP的降解率可達到58.52%。CP-7菌株最適碳源為葡萄糖，最適氮源為硫酸銨，最佳C/N為5∶1；當接種量為8%（V/V）、pH為9、溫度在30℃、NaCl濃度為2.5 g/L、初始磷酸鹽濃度70 mg/L時，CP-7菌株在72 h內(nèi)對TP的降解率達到最大值。此外還發(fā)現(xiàn)CP-7菌株與銅綠假單胞菌YZ-1之間能夠相互作用，協(xié)同作用增強除磷效果，TP降解率可達到99%。