葉 鶯，徐晶潔，李 瑾，鮑文麗，祁 文，江 飛,

口腔醫(yī)療器械清洗、消毒、滅菌在口腔臨床具有非常重要的意義，是預(yù)防傳染病在口腔醫(yī)生、工作人員和患者之間的傳播主要手段之一[1]。由于口腔科器械種類(lèi)眾多、體積小、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、表面形貌凹槽和扭曲多，而口腔內(nèi)微生物種類(lèi)眾多、充填和修復(fù)材料多樣、分泌物(血液、唾液等)復(fù)雜，使用后的口腔器械可能被這些含有感染性物質(zhì)的組織、材料污染。常規(guī)機(jī)械和化學(xué)清潔都相當(dāng)困難[2]。即使目前在口腔臨床中已有許多不同的清洗工具的方法，包括手工清洗、超聲波清洗機(jī)和清洗消毒機(jī)，但仍可能有大量口腔材料和生物碎片殘留在器械表面。潛在的感染物質(zhì)可以從被感染的個(gè)體傳染給其他患者[3]。目前清洗消毒流程處理口腔醫(yī)療小器械效果尚存爭(zhēng)議。

氧化鋅丁香酚(zinc oxide eugenol, ZOE)水門(mén)汀，由氧化鋅(質(zhì)量分?jǐn)?shù)70%)和松香組成的粉末部分與丁香酚液體部分調(diào)合制成，能提供很好的密封效果，且丁香酚本身具有殺菌作用。被應(yīng)用于臨時(shí)性修復(fù)體黏結(jié)、齲源性可復(fù)性牙髓炎安撫治療、根管治療封藥等治療[4-7]。但該水門(mén)汀的固化、密封性能也給臨床上清洗牙體組織、口腔器械上的剩余ZOE水門(mén)汀材料帶來(lái)難度[8]。清除口腔金屬表面ZOE水門(mén)汀材料的方法包括：蒸汽清洗、超聲清洗和有機(jī)溶劑溶解，但步驟繁瑣，不適用于臨床處理大量口腔小器械的集中處理[9]。

本研究旨在優(yōu)化臨床上口腔器械上殘留ZOE水門(mén)汀的清洗方法。以常用的金剛砂車(chē)針(TR-13)為例，表面負(fù)載Caviton親水ZOE水門(mén)汀暫封材，在清洗流程中應(yīng)用丁香酚液體溶解器械表面固化的ZOE水門(mén)汀材料。所得結(jié)果從金剛砂車(chē)針上ZOE水門(mén)汀殘留稱(chēng)重、表面清潔度方面，與目前《口腔器械消毒滅菌技術(shù)規(guī)范》中規(guī)定口腔器械、器具和物品的清洗操作方法所得結(jié)果進(jìn)行比較。為有效清洗口腔器械表面ZOE水門(mén)汀提供可行方案。由于我國(guó)目前公立口腔醫(yī)療機(jī)構(gòu)日常門(mén)診量大，所使用的一般流程是在門(mén)診先收集、放置，再集中送消毒。因此，我們?cè)诒狙芯恐序?yàn)證了丁香酚清洗對(duì)集中放置器械是否具有抑菌作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

全能強(qiáng)效多酶清洗液(3M，美國(guó))、醫(yī)用泡沫保濕清洗劑預(yù)處理型(Cinma，美國(guó))、丁香酚(常熟尚齒齒科材料有限公司，中國(guó))、金剛砂車(chē)針(TR-13，Mani，日本)、Caviton親水ZOE水門(mén)汀(GC，日本)、PBS緩沖液(Biosharp，中國(guó))、氯化鈉(滬試、中國(guó))、瓊脂、胰蛋胨、酵母提取物(均購(gòu)自O(shè)xoid，美國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)器械

超聲波清洗機(jī)(德瑞，中國(guó))、電子天平(精度0.1 mg，華潮高科，上海)、優(yōu)瑪醫(yī)用干燥柜(優(yōu)瑪，中國(guó))、潔凈工作臺(tái)(蘇凈泰安，中國(guó))、恒溫培養(yǎng)箱(Shellab，美國(guó))、離心機(jī)(Thermo，美國(guó))、恒溫振蕩器(旻泉儀器，中國(guó))、高壓蒸汽滅菌器(致微，美國(guó))、微孔板分光光度計(jì)(Spectramax，美國(guó))、細(xì)菌濁度計(jì)(昕銳，中國(guó))、SBC-12離子濺射儀(中科科儀，中國(guó))、Phenom LE場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(Phenom-World公司，荷蘭)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

取全新的金剛砂車(chē)針，分為9組，每組10支。A～E組進(jìn)行ZOE水門(mén)汀清洗實(shí)驗(yàn)，E′、F、G、H組進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。具體分組及操作見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)分組及樣品處理

1.4 樣品預(yù)處理

1.4.1 ZOE水門(mén)汀污染樣品制備 A～E組金剛砂車(chē)針直接在工作端均勻涂布一層Caviton親水ZOE水門(mén)汀暫封材料，晾干備用。E′、F組在菌液污染后涂布。

1.4.2 菌液污染樣品制備 接種環(huán)取少量金黃色葡萄球菌，涂抹于LB瓊脂培養(yǎng)板上，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，24 h后可用。選取菌落置于1.5 mL EP管中，PBS緩沖液吹打混勻，4 000 r/min離心5 min后棄上清，重復(fù)一次后，用LB培養(yǎng)基重懸至1×108CFU/mL的金黃色葡萄球菌備用。E′、F、H組車(chē)針置于菌液中浸泡30 min后備用。

1.5 實(shí)驗(yàn)步驟

1.5.1 水門(mén)汀清洗實(shí)驗(yàn) A組浸泡于清水中，B組浸泡于1∶200 3M全能強(qiáng)效多酶清洗液中，C組浸泡于醫(yī)用泡沫保濕清洗劑，D組浸泡于丁香酚液體中。每組各浸泡30 min后撈出，按編號(hào)放置于醫(yī)用小器械清洗盒中，流水沖洗后，放入1∶200配制的3M全能強(qiáng)效多酶清洗液超聲清洗5 min。為節(jié)省清洗時(shí)間，設(shè)置E組為直接丁香酚超聲清洗5 min。完成清洗后，干燥，電子天平稱(chēng)重。

1.5.2 抑菌實(shí)驗(yàn) E′組車(chē)針預(yù)處理后丁香酚超聲清洗5 min；F組車(chē)針預(yù)處理后丁香酚超聲清洗5 min，多酶清洗液浸泡30 min；G為陰性對(duì)照組，不進(jìn)行預(yù)處理及清洗浸泡；H為陽(yáng)性對(duì)照組，浸泡菌液30 min。將E′、F、G、H組的車(chē)針?lè)謩e以無(wú)菌生理鹽水沖洗3 s后置于含1 mL LB培養(yǎng)液的1.5 mL EP管中，于37 ℃、200 r/min的恒溫振蕩器中搖菌6、24 h。每管取100 μL菌液置于96孔板中，用微孔板分光光度計(jì)測(cè)定在600 nm處的光密度D[10-11]，通過(guò)分析細(xì)菌渾濁度檢驗(yàn)多酶清洗液抑菌作用。

1.5.3 掃描電鏡檢測(cè) 各組車(chē)針經(jīng)過(guò)固定、脫水后使用SBC-12離子濺射儀進(jìn)行噴金處理。Phenom LE場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡采用10 kV高電壓、低束流、二次電子模式進(jìn)行表面掃描，選取車(chē)針工作段中1/3處掃描拍攝。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS 18.0和GraphPad Prism7.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)差異分析采用單因素方差分析和兩兩比較進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 結(jié) 果

2.1 不同清洗劑浸泡再經(jīng)多酶清洗液超聲清洗效果

金剛砂車(chē)針原始質(zhì)量、負(fù)載ZOE水門(mén)汀后的車(chē)針質(zhì)量結(jié)果如表2所示：各組車(chē)針質(zhì)量、表面負(fù)載的ZOE水門(mén)汀無(wú)差異。

表2 各實(shí)驗(yàn)組車(chē)針及ZOE稱(chēng)重結(jié)果及清除率

在肉眼觀察各組車(chē)針清洗效果，可明顯看出A、B、C組仍殘留大量ZOE水門(mén)汀，經(jīng)過(guò)丁香酚浸泡的D組車(chē)針表面的ZOE水門(mén)汀清除得較為干凈(圖1)。

在掃描電鏡下觀察：A組車(chē)針表面，未見(jiàn)明顯的ZOE水門(mén)汀脫落，車(chē)針金剛砂粒之間嵌滿(mǎn)致密的ZOE水門(mén)汀，大部分金剛砂粒被覆蓋；B組雖然在車(chē)針表面仍存在大量ZOE水門(mén)汀，但在電鏡下顯示ZOE水門(mén)汀結(jié)構(gòu)疏松，并且有少量脫落；C組表面ZOE水門(mén)汀脫落區(qū)域增大，脫落的斑塊較為明顯；D組車(chē)針表面未見(jiàn)明顯的ZOE水門(mén)汀，高光亮點(diǎn)區(qū)域?yàn)檐?chē)針表面的金剛砂，金剛砂顆粒明顯，車(chē)針表面未見(jiàn)明顯ZOE水門(mén)汀覆蓋(圖1)。

黃色虛線標(biāo)注區(qū)域a為ZOE水門(mén)汀脫落區(qū)域，紅色虛線標(biāo)注區(qū)域b為T(mén)R-13車(chē)針表面的金剛砂顆粒

統(tǒng)計(jì)使用單因素方差分析

電鏡觀察后對(duì)每組車(chē)針進(jìn)行稱(chēng)重，與負(fù)載ZOE水門(mén)汀后車(chē)針的質(zhì)量對(duì)比，如表2所示：D組的ZOE水門(mén)汀清除率明顯高于其余三組；而A、B、C組ZOE水門(mén)汀清除率無(wú)明顯差異。清洗后車(chē)針質(zhì)量與清洗后質(zhì)量相比，D組車(chē)針表面ZOE水門(mén)汀殘留顯著少于其他組。

2.2 丁香酚浸泡后多酶清洗液超聲清洗與丁香酚超聲清洗ZOE水門(mén)汀效果比較

雖然丁香酚浸泡后，車(chē)針表面ZOE水門(mén)汀已大部松解、剝脫，但仍會(huì)有部分殘留?？紤]超聲清洗會(huì)顯著提高清洗效率，因此，本研究嘗試直接采用丁香酚對(duì)負(fù)載ZOE水門(mén)汀的車(chē)針進(jìn)行清洗。如圖1所示：D組為丁香酚浸泡30 min后多酶超聲清洗5 min，E組為丁香酚直接超聲清洗5 min，大體照片中未見(jiàn)清洗效果差異。再次對(duì)兩組車(chē)針進(jìn)行稱(chēng)重，結(jié)果所示：D、E兩組車(chē)針表面ZOE水門(mén)汀殘余質(zhì)量(P=0.162 3)和清除率(P=0.168 1)無(wú)差異。因此，直接用丁香酚超聲清洗器械表面ZOE水門(mén)汀可大大縮短椅旁預(yù)處理時(shí)間。

2.3 丁香酚抑菌效果

在電鏡下觀察如圖2A所示，全新金剛砂車(chē)針(陰性對(duì)照G組)上未見(jiàn)有菌。金黃色葡萄球菌液浸泡的車(chē)針(陽(yáng)性對(duì)照H組)上吸附大量細(xì)菌，劃紅色線區(qū)域?yàn)榫洳糠?。通過(guò)丁香酚超聲清洗后，車(chē)針表面僅存在少量細(xì)菌。經(jīng)過(guò)6 h搖菌培養(yǎng)，陽(yáng)性對(duì)照組中渾濁度已有明顯增加(圖3，P<0.01)。而丁香酚超聲清洗后的實(shí)驗(yàn)組中無(wú)明顯變化；直到搖菌培養(yǎng)24 h后，LB培養(yǎng)液明顯渾濁，說(shuō)明已有較多細(xì)菌擴(kuò)增(P<0.05)。因此，我們嘗試在丁香酚超聲清洗后配合使用多酶清洗液，觀察是否可以有較好的抑菌效果(各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比)，結(jié)果如圖3顯示：丁香酚超聲清洗后，經(jīng)多酶浸泡(F組)可明顯抑制細(xì)菌增殖。

圖2 不同處理組抑菌效果(掃描電鏡)

*:P<0.05；**：P<0.01

3 討 論

根據(jù)國(guó)家頒布的WS 310-2016《醫(yī)院消毒供應(yīng)中心規(guī)范》[12]和WS 506-2016《口腔器械消毒滅菌技術(shù)規(guī)范》[9]的相關(guān)細(xì)則要求，對(duì)于結(jié)構(gòu)復(fù)雜不易清洗的口腔器械(如口腔小器械、刮匙等)：①宜保濕放置，保濕液可選擇應(yīng)用飲用水或酶類(lèi)清洗劑；②使用專(zhuān)用超聲網(wǎng)籃超聲清洗；③要達(dá)到滅菌水平。目前，我院對(duì)于車(chē)針、銼針等口腔小器械使用后，在椅旁階段，采用多酶清洗液浸泡后送供應(yīng)室集中處理；當(dāng)車(chē)針器械進(jìn)入供應(yīng)室后，再次用多酶溶液并配合超聲設(shè)備進(jìn)行清洗；之后清水漂洗，進(jìn)行煮沸預(yù)消毒；預(yù)消毒處理后對(duì)器械進(jìn)行干燥并打包，最后使用高溫蒸汽滅菌。經(jīng)過(guò)這些流程，對(duì)于器械表面的活性微生物已可以達(dá)到滅菌效果。但由于沒(méi)有針對(duì)ZOE水門(mén)汀材料的專(zhuān)門(mén)清洗流程，因此，臨床中依然經(jīng)常肉眼可見(jiàn)ZOE水門(mén)汀材料附著在口腔小器械表面。我們針對(duì)這一現(xiàn)狀，在本研究中應(yīng)用臨床廣泛使用的成品Caviton親水ZOE水門(mén)汀暫封材污染粗糙表面的口腔小器械，希望通過(guò)清洗流程上的優(yōu)化，來(lái)解決這一問(wèn)題。因?yàn)閆OE水門(mén)汀在器械表面有黏結(jié)性，清理不凈對(duì)滅菌后的口腔器械再次使用時(shí)雖無(wú)微生物來(lái)源的危害，但會(huì)降低器械在后續(xù)使用中的切削效率；另一方面，再次使用過(guò)程中先前黏附在器械上的材料碎屑還可能再次剝脫[13]。因此，我們需要對(duì)目前的口腔小器械清洗流程進(jìn)行優(yōu)化。

對(duì)照上述規(guī)范中要求口腔小器械回收后在椅旁保濕的原則和方法，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)分組中設(shè)置了對(duì)車(chē)針進(jìn)行清水浸泡、多酶浸泡的實(shí)驗(yàn)組。因?yàn)閆OE水門(mén)汀有遇水加速凝固的性能[6]，顯然清水浸泡不利于溶解器械表面的ZOE水門(mén)汀。本研究通過(guò)對(duì)清水浸泡后車(chē)針表面進(jìn)行掃描電鏡觀察和殘留物稱(chēng)重，證實(shí)清水浸泡后金剛砂車(chē)針表面依然殘留大量ZOE水門(mén)汀。關(guān)于酶類(lèi)清洗液，目前有單酶類(lèi)和多酶類(lèi)清洗液[14]。單酶類(lèi)清洗液主要是蛋白酶，只能分解蛋白污物。多酶清洗液中主要包括蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等，能更全面地分解清除醫(yī)療器械上的活性污染物[15]。目前我院使用的多酶溶液是全能強(qiáng)效多酶清洗液，其中包含了蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶、表面活性液等成分。雖然這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組車(chē)針?lè)Q重結(jié)果中多酶浸泡處理后的殘余重量(17.7±4.1)mg和清除率(50.83±17.16)%與清水浸泡處理組無(wú)明顯差別，但電鏡下能觀察到多酶浸泡后ZOE水門(mén)汀已有明顯的脫落(圖1中黃色虛線區(qū)域)，且ZOE水門(mén)汀表面出現(xiàn)多孔，質(zhì)地明顯更松散。類(lèi)似的結(jié)果也可在保濕劑浸泡組觀察到。Cinma醫(yī)用保濕清洗劑中同樣含有蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶及碳水化合物分解酶和表面活性劑。多酶浸泡組、保濕劑浸泡組對(duì)ZOE清理效果似乎與多酶中的酶成分關(guān)系不大，而得益于清洗液中的表面活性劑。而經(jīng)過(guò)丁香酚浸泡的實(shí)驗(yàn)組不論從肉眼觀察，還是電鏡觀察，車(chē)針表面的ZOE水門(mén)汀已基本清除(殘余重量?jī)H為(1.3±0.9)mg，清除率高達(dá)(95.06±3.69)%)。該結(jié)果說(shuō)明：丁香酚也是ZOE水門(mén)汀的有效溶劑，以丁香酚浸泡表面黏有ZOE水門(mén)汀的處理是合理且有效的。本研究中僅用丁香酚浸泡30 min即可達(dá)到該清除效果，省時(shí)且并未增加門(mén)診椅旁護(hù)理過(guò)多負(fù)擔(dān)。丁香酚是口腔材料調(diào)配中的常用的液體溶劑，除ZOE水門(mén)汀外，還用于調(diào)制根管糊劑[16]。本研究應(yīng)用丁香酚清洗ZOE水門(mén)汀后，經(jīng)過(guò)流水沖洗、多酶浸泡，以及后續(xù)口腔器械常規(guī)清洗、消毒流程，本身丁香酚也具有揮發(fā)性，因此，清洗后未見(jiàn)器械表面有殘留。另一方面，丁香酚的安全性方面也有文獻(xiàn)報(bào)道：丁香酚對(duì)于不同物種細(xì)胞肽的親和力不同，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞的親和力較差，這也證明其對(duì)人體細(xì)胞也具有較好的安全性[17]。即便器械表面有很微量的殘留，在口腔外用操作中，也不會(huì)有生物安全性方面的風(fēng)險(xiǎn)。

目前在口腔器械消毒流程方面已有團(tuán)隊(duì)提出“處理提前”[18]。臨床針對(duì)不同種類(lèi)、不同污染源的器械進(jìn)行針對(duì)性預(yù)處理，有利于提高后期供應(yīng)室集中處理的效率[19-20]。對(duì)口腔臨床大量使用后的污染的口腔小器械進(jìn)行預(yù)處理，更有必要。上述討論中，雖然丁香酚浸泡30 min，再行多酶超聲5 min已能基本清除表面黏附的ZOE水門(mén)汀，但根據(jù)規(guī)范中的提示在“椅旁預(yù)處理”中加入超聲清洗，是否使得對(duì)ZOE水門(mén)汀的清理更快更簡(jiǎn)便？因此，本研究比較丁香酚浸泡+多酶超聲清洗與直接丁香酚超聲清洗對(duì)清除口腔小器械表面ZOE水門(mén)汀的效果。結(jié)果意外地發(fā)現(xiàn)：直接將黏滿(mǎn)ZOE水門(mén)汀的TR-13車(chē)針置于丁香酚溶液中超聲5 min，與先丁香酚浸泡、再用多酶清洗液超聲清洗結(jié)果無(wú)明顯差異(P=0.162 3)。因此，在椅旁預(yù)處理時(shí)預(yù)備丁香酚溶液，將所收集的黏有ZOE水門(mén)汀的口腔小器械進(jìn)行5 min超聲，即可解決目前消毒流程中無(wú)法有效清理口腔小器械表面殘留ZOE水門(mén)汀的問(wèn)題。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果已說(shuō)明使用丁香酚液超聲清洗含有ZOE水門(mén)汀的表面粗糙小器械能夠獲得很好效果。目前公立口腔醫(yī)療機(jī)構(gòu)日常門(mén)診大，難以做到每位患者診療后的器械逐一、立即送供應(yīng)室消毒。一般在門(mén)診先收集、放置，再集中送消毒流程。這就意味著門(mén)診集中放置時(shí)可能存在病原微生物滋生。目前臨床消毒清洗流程中所使用的多酶清洗液本身對(duì)病原微生物、蛋白質(zhì)等感染性物質(zhì)有滅活作用[14]。雖然在清除ZOE水門(mén)汀方面沒(méi)有明顯優(yōu)勢(shì)，但是否需要在丁香酚超聲去除ZOE水門(mén)汀后再次應(yīng)用多酶清洗液來(lái)應(yīng)對(duì)門(mén)診集中放置時(shí)可能存在的病原微生物滋生問(wèn)題？本研究將消毒滅菌研究中常用的金黃色葡萄球菌[21-23]摻入ZOE水門(mén)汀，模擬口內(nèi)去除ZOE水門(mén)汀時(shí)口腔內(nèi)微生物與ZOE水門(mén)汀混合，觀察丁香酚超聲清除TR-13車(chē)針表面ZOE后，金黃色葡萄球菌的增殖情況。結(jié)果顯示單純使用丁香酚超聲清除表面ZOE水門(mén)汀后，TR-13車(chē)針表面依然有散在的金黃色葡萄球菌(圖2)，單純丁香酚超聲清洗的實(shí)驗(yàn)組和丁香酚超聲清洗+多酶浸泡處理的實(shí)驗(yàn)組，經(jīng)過(guò)6 h細(xì)菌培養(yǎng)，均未見(jiàn)明顯細(xì)菌增殖。經(jīng)過(guò)24 h的細(xì)菌培養(yǎng)后單純丁香酚超聲清洗的實(shí)驗(yàn)組中金黃色葡萄球菌有輕微擴(kuò)增。這一結(jié)果也與已有報(bào)道中所提及丁香酚具有抑菌作用相印證[24-25]，而追加多酶浸泡處理后的實(shí)驗(yàn)組中抑菌效果更優(yōu)于單純使用丁香酚超聲清洗的實(shí)驗(yàn)組(圖3)。說(shuō)明在應(yīng)用丁香酚清除ZOE水門(mén)汀污染的粗糙小器械后，配合使用多酶浸泡處理，可獲得更好的抑菌效果。因此，我們提出直接用丁香酚超聲清洗粗糙器械表面的ZOE水門(mén)汀，可以明顯縮短椅旁預(yù)處理的時(shí)間，但在集中存放門(mén)診使用后器械的環(huán)節(jié)中需應(yīng)用多酶浸泡預(yù)處理后的器械，有效抑菌，防止在集中存放時(shí)發(fā)生二次污染。

4 結(jié) 論

針對(duì)口腔臨床粗糙表面的口腔小器械上難以清洗ZOE水門(mén)汀的問(wèn)題，在椅旁應(yīng)用丁香酚超聲清洗，即可有效清除粗糙器械表面ZOE水門(mén)汀。但如果需要在集中消毒前暫時(shí)存放，則需要在丁香酚超聲清洗后，用多酶消毒劑浸泡保存，防止病原微生物的滋生造成二次污染。本研究所述對(duì)ZOE水門(mén)汀污染器械行椅旁消毒預(yù)處理，對(duì)口腔小器械上ZOE水門(mén)汀清除效果好，且方法簡(jiǎn)便易行。