王淑婷，劉 坤，劉 靜，李月華，王玉東，焉華駿，王曉茵，曹旭敏，秦立得，孫曉亮，宋翠平*，趙思俊*

(1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東青島 266032；2.青島華測檢測技術(shù)股份有限公司,山東青島 266100)

β-內(nèi)酰胺類抗生素(β-lactam antibiotics)是指化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有β-內(nèi)酰胺環(huán)的一類抗生素，主要包括青霉素類和頭孢菌素類，其作用特點(diǎn)是能夠抑制細(xì)菌黏肽轉(zhuǎn)肽酶的活性，從而阻止細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，呈現(xiàn)殺菌活性[1]。β-內(nèi)酰胺中四元環(huán)的存在, 使得這些化合物的理化性質(zhì)與其他類的抗生素有較大不同[2]。在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中, β-內(nèi)酰胺類抗生素常被用于醫(yī)治奶牛的乳腺炎, 由于其使用廣泛,可能導(dǎo)致在牛奶中存在殘留[3]。牛奶中的抗生素殘留是乳制品生產(chǎn)過程中一個(gè)嚴(yán)重的健康和技術(shù)問題[4]。隨著新藥研究的不斷更新，建立先進(jìn)的牛奶中β-內(nèi)酰胺分析方法已成為殘留監(jiān)控的重點(diǎn)問題。在藥物殘留分析檢測的過程中，對樣品的前期處理非常重要，也是整個(gè)檢測過程中最可能出現(xiàn)誤差的環(huán)節(jié)，處理得當(dāng)可以提高對樣品分析的準(zhǔn)確性，所以優(yōu)化前處理技術(shù)，保證多種藥物的回收效果和試驗(yàn)結(jié)果的精密度是建立檢測方法的關(guān)鍵[5]。在報(bào)道的方法中，Oasis HLB柱常被用于β-內(nèi)酰胺類藥物提取液的凈化。張琦[6]等用阿莫西林、頭孢氨芐、氨芐西林和青霉素V等藥物的標(biāo)準(zhǔn)混合液對HLB柱、C18柱、MAX柱的凈化效果進(jìn)行對比，結(jié)果表明HLB柱對所測藥物的保留能力和重現(xiàn)性最好，回收率最高，回收率為34%～93%，4種藥物除了阿莫西林外，其余3種抗生素的平均回收率均高于70%。超濾(Ultrafiltration，UF) 是一種壓力驅(qū)動系統(tǒng)[7]，通過僅允許低于某個(gè)分子量截止值的小分子通過膜來實(shí)現(xiàn)與大分子物質(zhì)分離的目的[8]。膜在食品工業(yè)中的應(yīng)用主要集中在乳清、牛奶、葡萄酒、啤酒、水果和蔬菜汁等幾種食品和副產(chǎn)品的分離、分餾、純化、澄清和濃縮中[9-11]。張秀堯等[12]使用超濾離心法，先用乙腈對牛奶中β-內(nèi)酰胺類藥物進(jìn)行提取，提取液經(jīng)超濾管離心凈化處理，通過超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜快速測定牛奶中53種β-內(nèi)酰胺類抗生素及其代謝產(chǎn)物的殘留量。相關(guān)系數(shù)均優(yōu)于0.9911，平均加標(biāo)回收率在71%～121%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%～19%。本試驗(yàn)在已建立的UPLC-MS/MS儀器檢測法的基礎(chǔ)上，分別用超濾離心濃縮管與Oasis HLB柱對牛奶樣品進(jìn)行凈化濃縮，目的為確立一種方法簡單，試劑消耗少，測定時(shí)間短，回收效果好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠的前處理方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1 牛奶樣品 超市購買。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室分析檢測，購買的牛奶樣品中未檢出β-內(nèi)酰胺類藥物，可作為空白樣品使用。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 青霉素G(PEN-G，純度99.5%)、青霉素V(PEN-V，純度99.0%)、氯唑西林(LZXL，純度97.0%)、雙氯西林(SLXL，純度99.5%)、氟氯西林(FLXL，純度91.0%)、萘夫西林(NFXL，純度91.0%)、頭孢哌酮(TBPT，純度94.0%)，上述7種標(biāo)準(zhǔn)品均購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；苯唑西林(BZXL，純度99.5%)、甲氧西林(JYXL，純度91.4%)、頭孢地尼(TBDN，純度98.0%)、美羅培南(MLPN，純度98%)、多尼培南(DNPN，純度98%)、青霉噻唑酸V(QM-SZS-V，純度95.0%)購自加拿大Toronto Research chemicals INC公司；美西林(MXL，純度90.0%)、哌拉西林(PLXL，純度94.4%)、美洛西林(MLXL，純度95.10%)、頭孢噻吩(TBSFEN，純度94.7%)均購自USP公司；阿洛西林(ALXL，純度93.74%)購自中國藥品生物制品檢定所；頭孢匹林(TBPLin，純度99.6 %)購自英國British Pharmacopeia公司。

1.1.3 試劑 乙腈，色譜純，美國Merck公司出品。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 AcquityTMUPLC- Xevo TQMS UPLC-MS/MS儀(美國Waters公司)；固相萃取設(shè)備(Wat 200677，美國Waters公司)；超濾離心濃縮管(0.2 μm Supor?, Aqua，MCPM02C67，美國PALL公司)；Milli-Q超純水儀，美國Millipore公司出品；高速冷凍離心機(jī)；數(shù)控超聲波清洗儀；冰箱；漩渦混合器；N2蒸發(fā)儀。

超濾離心管：體積為6 mL，截留分子量(MWCO)為0.2 μm和0.45 μm；體積為20 mL，截留分子量(MWCO)為3、10 kD，購自美國PALL公司。新超濾管在使用前先加入超純水，水量完全過膜，放置冰浴或冰箱里預(yù)冷幾分鐘，再將水倒出，加入前處理液。

1.1.5 溶液的配制

1.1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液配制(1000 μg/mL) 準(zhǔn)確稱取適量的β-內(nèi)酰胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品到棕色容量瓶中，分別用50%乙腈水溶解并定容至10 mL，配成1000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20 ℃冷藏保存。

1.1.5.2 混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液配制(10.0 μg/mL) 從冰箱中取出β-內(nèi)酰胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1000 μg/mL)放至室溫，分別準(zhǔn)確吸取250 μL于25 mL容量瓶中，加50%乙腈水稀釋至刻度，配成10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，-20 ℃冷藏保存。

1.1.5.3 混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制(1.0 μg/mL) 從10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液中取1 mL于10 mL容量瓶中，加50%乙腈水稀釋至刻度，配成1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，即配即用。

1.1.5.4 流動相配制 流動相A：配制0.1 %甲酸(V/V)水溶液，甲酸與超純水按體積比1∶1000混合。流動相B：乙腈；使用前將流動相A、B分別超聲5 min，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.1.5.5 復(fù)溶液配制 乙腈與超純水按體積比1∶5混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.1.6 靈敏度的考察 用1.1.5.5項(xiàng)確定的復(fù)溶液制備不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用實(shí)驗(yàn)室已建立的UPLC-MS/MS儀器檢測法進(jìn)行分析，重復(fù)6次。以信噪比S/N=3時(shí)為檢測限(LOD)，信噪比S/N=10時(shí)為定量限(LOQ)。

1.1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 依照10、20、50、100 μg/kg的濃度分別準(zhǔn)確吸取19種藥物的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，氮?dú)獯蹈?，用?乙腈(80/20，V/V)水復(fù)溶，制備系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行UPLC-MS/MS分析，以定量離子的峰面積為縱坐標(biāo)(y)，標(biāo)準(zhǔn)品添加濃度為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.1.8 精密度的考察 取50 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液置于1 mL的進(jìn)樣瓶中，3個(gè)平行，重復(fù)3次，測定各藥物的峰面積積分值，通過回歸方程計(jì)算各物質(zhì)濃度，計(jì)算各藥物濃度的RSD(n=3)，以RSD來考察方法的精密度。

1.2 方法

1.2.1 UPLC-MS/MS檢測法

1.2.1.1 色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLCTMBEH C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相：A為 0.1 %甲酸溶液，B為乙腈溶液，采用梯度洗脫，條件如表1。進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：35 ℃；流速：0.3 mL/min。

表1 梯度洗脫條件Tab 1 Gradient elution conditions

1.2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI+)，正離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，毛細(xì)管電壓：2.5 kV；離子源溫度150 ℃，霧化氣流1000 L/h，錐孔氣流50 L/h，霧化室溫度450 ℃。質(zhì)譜條件如表2。

表2 質(zhì)譜MRM方式檢測參數(shù)Tab 2 Mass spectrum of MRM detection parameter

1.2.2 兩種前處理方法對比試驗(yàn)

1.2.2.1 HLB-SPE柱法的樣品提取 分別取空白牛奶樣品(經(jīng)1.1.1項(xiàng)中確認(rèn)可作為空白樣品使用)1個(gè)、回收(添加濃度為50 ng/mL)3個(gè)牛奶樣品各2 mL于50 mL離心管中，加6 mL乙腈，渦旋混勻，超聲提取20 min，4 ℃條件下10000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至潔凈試管內(nèi)，再加4 mL乙腈重復(fù)提取一次，合并上清。分別轉(zhuǎn)移5 mL上清液于另一新管中，均于45 ℃氮?dú)獯蹈?，? mL 20%乙腈溶解，分別作樣液備用。

1.2.2.2 HLB-SPE柱法的凈化與濃縮 依次用3 mL乙腈活化，3 mL水平衡，3 mL樣液上樣，依次用3 mL水淋洗，3 mL 乙腈洗脫后，收集洗脫液，45 ℃下N2吹干，加1 mL水-乙腈(80/20,V/V)復(fù)溶，過0.2 μm濾膜，供UPLC-MS/MS分析。

1.2.2.3 超濾離心管法的樣品提取 分別取空白(經(jīng)1.1.1項(xiàng)中確認(rèn)可作為空白樣品使用)1個(gè)、回收(添加濃度為50 ng/mL)3個(gè)牛奶樣品各2 mL于50 mL離心管中，加6 mL乙腈，渦旋混勻，超聲提取10 min，4 ℃條件下10000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至潔凈試管內(nèi)，再加4 mL乙腈重復(fù)提取一次，合并上清。分別于45 ℃氮?dú)獯蹈桑? mL 20%乙腈溶解，分別作樣液備用。

1.2.2.4 超濾離心管法的凈化與濃縮 將樣液倒入超濾離心濃縮管中，4 ℃條件下10000 r/min離心10 min，取濾液裝瓶，供UPLC-MS/MS分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系和靈敏度 19種β-內(nèi)酰胺類藥物的線性關(guān)系和靈敏度結(jié)果見表3。結(jié)果表明，19種藥物的靈敏度好，在線性范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)均大于0.99，線性關(guān)系良好，能夠滿足定性和定量分析的要求。

表3 19種β-內(nèi)酰胺類藥物的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢測限和定量限Tab 3 Linear ranges， Regression equations，Correlation coefficient,LOD and LOQ of 19 β-lactams

2.2 精密度 測得的β-內(nèi)酰胺類藥物的濃度及計(jì)算的標(biāo)準(zhǔn)偏差見表4，結(jié)果表明，19種分析藥物的日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.68%～3.47%，日間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.89%～4.11%，說明試驗(yàn)19種藥物的測定精密度良好。

表4 標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算的19種β-內(nèi)酰胺類藥物濃度及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab 4 concentrations of 19 β-lactams calculated by standard curve equations and RSD

2.3 兩種前處理方法的結(jié)果回收率比較 由圖1可知，HLB-SPE柱法整體回收效果不如超濾離心濃縮管法回收效果理想，回收率在4.2%～104.1%，超濾離心濃縮管的回收率均在60.7%～96.6%范圍內(nèi)，回收效果更好。

圖1 兩種前處理方法對牛奶中19種β-內(nèi)酰胺類藥物的回收率的影響Fig 1 Effects of the recoveries of 19 β-lactams in milk by two pretreatment methods

3 討論與小結(jié)

3.1 復(fù)溶液的優(yōu)化 分別采用水-乙腈(90/10、80/20、70/30、60/40,V/V)體系和0.1%甲酸水-乙腈(90/10、80/20、70/30、60/40,V/V)體系作為復(fù)溶液對19 種β-內(nèi)酰胺類藥物混標(biāo)(加標(biāo)水平10.0 μg/kg)在用N2吹干后進(jìn)行回收復(fù)溶試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)水相中添加甲酸明顯對苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林等青霉素類藥物的回收率產(chǎn)生不利影響，可能是加入甲酸后pH降低，對藥物保留和穩(wěn)定性產(chǎn)生了影響[13]。在水-乙腈體系中，多種藥物隨乙腈含量的增加而響應(yīng)增高，但乙腈含量過高會出現(xiàn)峰形差的問題。所以綜合考慮峰形、回收率等因素，選擇水-乙腈(80/20,V/V)作為樣品的復(fù)溶液，既能保證各組分峰形良好，又能保證藥物的回收率，從而達(dá)到理想的檢測效果。

3.2 超濾膜分子量的選擇 通常情況下選擇合適的超濾管，主要考慮 MWCO和濃縮體積，而本實(shí)驗(yàn)是需要離心透析出的液體，因此在選用超濾管時(shí)不但要考慮能否透析出目標(biāo)化合物，還要考慮被截留的大分子物質(zhì)在離心時(shí)是否會損壞超濾膜[14]。19種β-內(nèi)酰胺類藥物的分子量均在 300～700之間，根據(jù)現(xiàn)有的6 mL和20 mL超濾管的型號規(guī)格 (0.2 μm，0.45 μm，3 kD，10 kD) 進(jìn)行試驗(yàn)。

先加入1 mL 20%乙腈離心 10 min，0.2 μm，0.45 μm，3、10 kD超濾管均能全部濾出; 選用牛奶樣品，按1.2.2.3項(xiàng)方法進(jìn)行樣品處理后，取 1 mL上清液加入超濾管中，10000 r/min 離心 10 min，0.2 μm、0.45 μm和3 kD超濾膜均能夠離心徹底，且未見破損，濾液澄清，而10 kD超濾管存在透濾現(xiàn)象，濾液渾濁；選用空白樣品進(jìn)行加標(biāo)回收(加標(biāo)水平 50.0 μg/kg)試驗(yàn)，按1.2.2.3項(xiàng)和1.2.2.4項(xiàng)方法進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示采用0.2 μm超濾管的回收效果較好。為了更好地截留生物大分子物質(zhì)，達(dá)到最佳回收效果，本試驗(yàn)選用截留分子量為 0.2 μm的超濾管。

3.3 離心條件的選擇 由于離心力垂直于膜，通常會發(fā)生強(qiáng)烈的濃差極化，如此一來，過濾速度可能迅速減慢，甚至堵塞膜，從而對濾液的回收率和體積產(chǎn)生影響[8]。因此，需要選擇適當(dāng)?shù)碾x心速率。該超濾管推薦的離心速率約為10000 r/min，按1.2.2.3項(xiàng)方法進(jìn)行樣品處理后，分別對不同離心速率(6000，8000，10000，12000 r/min) 和離心時(shí)間(5，10，15，20 min) 進(jìn)行比較，上機(jī)檢測后計(jì)算19種目標(biāo)物的回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，離心速率對回收率無明顯影響，與離心出的液體快慢有關(guān)，即離心速率越大，達(dá)到相同凈化效果所需的離心時(shí)間越短，但離心速率過快，會損壞超濾膜，離心速率太低則會使濾液體積過少，故在實(shí)際使用中采用10000 r/min 離心 10 min，其離心出的液體量滿足實(shí)驗(yàn)要求且濾膜無破損。

3.4 超濾管的凈化效果 在空白牛奶樣品中添加19種β-內(nèi)酰胺類藥物混標(biāo)(加標(biāo)水平為50.0 μg/kg)，加入 10 mL 乙腈分兩次提取，N2吹干后，將用1 mL 20%乙腈復(fù)溶后的上清液加入超濾管中，進(jìn)行凈化處理，上機(jī)檢測；另取 1 mL上清液直接上機(jī)檢測。經(jīng)超濾管凈化處理和未處理的牛奶樣品的檢測結(jié)果可以看出，經(jīng)超濾管凈化處理的樣品干擾減少，降低了基質(zhì)效應(yīng)，達(dá)到了凈化目的。

本試驗(yàn)對牛奶樣品分別用固相萃取HLB柱和超濾離心管進(jìn)行凈化、濃縮處理，比較了兩種方法對牛奶中19種β-內(nèi)酰胺類藥物的回收效果。其中，HLB柱對雙氯西林、氯唑西林、美洛西林、萘夫西林、氟氯西林和苯唑西林等6種藥物進(jìn)行凈化濃縮處理的回收率和用超濾離心管處理的回收率相當(dāng)，兩者回收率均在69.1%～104.1%，而美西林、青霉素-V、青霉素-G、甲氧西林、阿洛西林、哌拉西林、青霉噻唑酸V、頭孢匹林、頭孢地尼、頭孢哌酮、頭孢噻吩、美羅培南和多尼培南等13種藥物的回收率結(jié)果表明，用超濾離心管進(jìn)行凈化濃縮處理遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于用HLB柱處理的回收率，且均在60.7%～95.4%。綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，用超濾離心管對牛奶進(jìn)行凈化濃縮處理比HLB柱的回收效果好。使用超濾離心管的前處理方法簡單，試劑消耗少，測定時(shí)間短，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以獲得良好的測定效果，故本試驗(yàn)選擇超濾離心管作為檢測牛奶中β-內(nèi)酰胺類藥物殘留的前處理方法。