莫丹梅 藍(lán)黃麗 李國力 楊文琪 徐開遵

(廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 南寧 530004)

蠶沙是蠶業(yè)生產(chǎn)的大宗副產(chǎn)物之一，每生產(chǎn)100 kg蠶繭可得600 kg風(fēng)干蠶沙[1]。蠶沙富含有機(jī)物質(zhì)及各種養(yǎng)分元素[2]，可發(fā)酵成有機(jī)肥應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。然而，蠶沙也是家蠶病原物的載體之一，因此，蠶沙的無害化、肥料化處理無論是對蠶業(yè)生產(chǎn)副產(chǎn)物的高效、合理利用，還是對阻斷家蠶病原物的傳播途徑，都具有重要的意義。

據(jù)報道，銳鈦礦型納米二氧化鈦表現(xiàn)出強(qiáng)的光活性，其抗菌、抗紫外線等功能突出，已廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域[3]。近年來，將納米二氧化鈦作為添食劑應(yīng)用于養(yǎng)蠶生產(chǎn)的研究在國內(nèi)外取得了一定進(jìn)展。已有研究表明，以5 mg/L納米二氧化鈦作為添加劑噴灑在桑葉上飼喂家蠶，有利于家蠶生長發(fā)育，不僅可提高飼料效率以及全繭量和繭層量[4-5]，還能促進(jìn)家蠶生殖發(fā)育[6]、絲蛋白合成[7]以及脂肪和碳水化合物的合成與代謝[8-9]。此外，添食納米二氧化鈦還能在一定程度上增強(qiáng)家蠶對核型多角體病毒(BmNPV)和黑胸敗血菌(BmBb)的抵抗性[10-12]，能緩解辛硫磷農(nóng)藥對家蠶神經(jīng)系統(tǒng)[13]、絲腺[14-15]、中腸及脂肪體的損傷[16-17]，提高家蠶幼蟲微量農(nóng)藥中毒后的存活率以及蠶繭產(chǎn)量和質(zhì)量。隨著研究的深入，程嵐[18]采用ICP-MS法測定了納米Cu、Ag金屬粒子能否被家蠶吸收及其進(jìn)入蠶體后的代謝途徑，結(jié)果表明這2種納米金屬粒子都能夠通過食物被家蠶吸收，在家蠶的血淋巴、表皮、前部絲腺、中部絲腺以及后部絲腺中均有分布，但大部分的納米粒子則是通過蠶沙排到了體外。雖然家蠶添食納米二氧化鈦的益處已有較多的研究報道，但蠶沙中含有的納米二氧化鈦對蠶沙肥料發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響尚不清楚。因此，本研究用5 mg/L納米二氧化鈦處理蠶沙后，采用Illumina Miseq技術(shù)對其進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)域測序，分析納米二氧化鈦處理對蠶沙細(xì)菌群落影響，為制備含納米二氧化鈦的蠶沙有機(jī)肥，拓展納米二氧化鈦在蠶業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考信息。

1 材料與方法

1.1 材料

供試家蠶品種為兩廣二號，由廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)科學(xué)研究院饋贈。供試納米二氧化鈦為銳鈦礦型，購自杭州萬景公司，平均粒徑為6～10 nm。將供試的納米二氧化鈦配置成5 mg/L懸濁液。

1.2 蠶沙處理方法

飼養(yǎng)家蠶收獲5齡蠶的蠶沙，等量分成對照組和處理組，每組6 kg，各設(shè)3個平行重復(fù)組。處理組蠶沙添加5 mg/L納米二氧化鈦500 mL并攪拌均勻，對照組以等量無菌水代替。在相同環(huán)境條件下放置24 h后，在對照組和處理組中分別隨機(jī)選取5個點(diǎn)采集蠶沙樣品，將采集的蠶沙充分混勻成1個樣品，各取3次重復(fù)。后續(xù)對蠶沙樣本的細(xì)菌16S rRNA V3-V4區(qū)域測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

經(jīng)Illumina MiseqTM/HiseqTM得到各樣本有效數(shù)據(jù)后，進(jìn)行操作分類單元(OTU)聚類，以相似性>97%的非重復(fù)序列為標(biāo)準(zhǔn)，去除嵌合體后得到OTU代表序列，再將所有優(yōu)化序列與OTU代表序列比對，選取相似性97%以上的序列進(jìn)行物種注釋及統(tǒng)計、物種分布、相對豐度、功能注釋和BugBase分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠶沙菌群測序的序列數(shù)目和OTU聚類

按照97%相似性對非重復(fù)序列 (不含單序列) 進(jìn)行OTU聚類，對照組和處理組蠶沙測序分別獲得62個和61個OTU，覆蓋度均達(dá)到99%(表1)，其中對照組和處理組共有的OTU數(shù)為50個，對照組和處理組特有的OTU數(shù)分別為12個和11個(圖1)。去除Read引物接頭，對照組和處理組樣品分別平均獲得62 648和66 284有效序列。

表1 納米二氧化鈦處理蠶沙中的菌群高通量測序結(jié)果

圖1 納米二氧化鈦處理組與對照組蠶沙菌群分布韋恩圖

2.2 蠶沙菌群的α多樣性

α多樣性又被稱之為生境內(nèi)的多樣性(within-habitat diversity)。蠶沙經(jīng)納米二氧化鈦處理后，反映樣品中含OTU 數(shù)目的Chao指數(shù)與菌群組成豐富度和均勻度的Ace指數(shù)均高于對照組，表明納米二氧化鈦處理增加了菌群的豐度。對照組蠶沙樣品反映菌群多樣性的Shannon指數(shù)高于處理組，Simpson指數(shù)則低于處理組(表2)，表明處理組菌群多樣性低于對照組。綜上所述，納米二氧化鈦處理增加了蠶沙菌群的豐度，但菌群的多樣性降低。

表2 納米二氧化鈦處理對蠶沙菌群豐度和多樣性的影響

2.3 蠶沙菌群中優(yōu)勢菌的相對豐度

對蠶沙菌群中優(yōu)勢菌的相對豐度進(jìn)行分析，結(jié)果表明：在分類階元門和綱水平上，對照組和處理組蠶沙中的優(yōu)勢菌門(圖2-A)、優(yōu)勢菌綱(圖2-B)類別均相同，只是相對豐度不同；在目水平，處理組蠶沙中假單孢桿菌目(Pseudomonadales)消失(圖2-C)；在科水平，處理組蠶沙中新增了棒狀桿菌科(Corynebacteriaceae)，而莫拉菌科(Moraxellaceae)則消失(圖2-D)；在屬水平，處理組蠶沙中葡萄球菌屬(Staphylococcus)豐度增加，此外還新增了棒桿菌屬(Corynebacterium)，而不動桿菌屬(Acinetobacter)消失(圖2-E)。可見，納米二氧化鈦處理蠶沙，對其中的不動桿菌屬細(xì)菌具有抑制作用，而與其具有拮抗作用的葡萄球菌屬、棒桿菌屬則豐度增加。

A～E圖分別為對照組在門、綱、目、科、屬水平上的優(yōu)勢菌群差異。

2.4 蠶沙菌群的功能注釋

COG功能注釋結(jié)果表明，處理組蠶沙具有復(fù)制、重組和修復(fù)[(L)Replication, recombination and repair]功能的細(xì)菌增加，具有脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝[(I)Lipid transport and metabolism]、轉(zhuǎn)錄[(K)Transcription]、細(xì)胞運(yùn)動[(N)Cell motility]、次級代謝物生物合成、運(yùn)輸和分解代謝[(Q)Secondary metabolites biosynthesis, transport, and catabolism]、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸[(U)Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport]等功能的細(xì)菌減少，具有其余功能的細(xì)菌差異不顯著(圖3-A)。FAPROTAX功能注釋結(jié)果表明：納米二氧化鈦處理蠶沙引起具有以下功能的菌類減少，包括芳香族化合物降解(aromatic compound degradation)、纖維素水解(cellulolysis)，哺乳動物腸道(mammal gut)、人類腸道(human gut)感染，碳?xì)浠衔锝到?hydrocarbon degradation)、脂肪族非甲烷烴降解(aliphatic non methane hydrocarbon degradation)、芳香烴降解(aromatic hydrocarbon degradation)；具有以下功能的菌類則增加，如葉綠體形成(chloroplasts)、氮呼吸(nitrogen respiration)、硝酸鹽呼吸(nitrate respiration)、尿解(ureolysis)、甲基營養(yǎng)(methylotrophy)、甲醇氧化(methanol oxidation)；具有發(fā)酵功能(fermentation)的菌類無明顯差異(圖3-B)。可見，納米二氧化鈦處理可使蠶沙中對哺乳動物及人類腸道有害的致病菌減少，而具有光合作用和氮呼吸功能的菌類增加，同時也不會影響蠶沙的發(fā)酵功能。

進(jìn)一步對差異菌進(jìn)行了BugBase分析，結(jié)果表明，納米二氧化鈦處理使蠶沙中的需氧型菌群減少(圖4-A)，厭氧型(圖4-B)和兼性厭氧型(圖4-C)菌群增加；革蘭陰性菌減少(圖4-D)，革蘭陽性菌增加(圖4-E)。潛在致病性分析結(jié)果表明，對照組蠶沙中存在變形菌(Proteobacteria)等致病菌，而納米二氧化鈦處理后可完全抑制蠶沙中該類菌的存活(圖4-F)。

圖3 納米二氧化鈦處理組與對照組蠶沙菌群的COG功能 (A)及FAPROTAX功能(B)注釋

A—需氧型菌群，B—厭氧型菌群，C—兼性厭氧型菌群，

3 小結(jié)

納米二氧化鈦具有抗菌特性，可作為添加劑提高家蠶產(chǎn)絲量，但家蠶食下的納米二氧化鈦大部分是通過蠶沙排出體外的。蠶沙是蠶桑產(chǎn)業(yè)中的大宗副產(chǎn)物，發(fā)酵成蠶沙有機(jī)肥是目前蠶沙最有效的利用方式。本研究結(jié)果表明，以納米二氧化鈦處理蠶沙，增加了蠶沙菌群的豐度，但菌群的多樣性降低；納米二氧化鈦抑制了蠶沙中的不動桿菌屬，而與其具有拮抗作用的葡萄球菌屬、棒桿菌屬則豐度增加。此外，F(xiàn)APROTAX功能注釋結(jié)果表明，納米二氧化鈦處理使蠶沙中對哺乳動物及人類腸道有害的致病菌減少，而使具有光合作用和氮呼吸功能的菌類增加，同時不會影響蠶沙的發(fā)酵功能。進(jìn)一步的BugBase分析表明，納米二氧化鈦可增加蠶沙中厭氧型和兼性厭氧型菌群，對變形菌等致病菌具有良好的抑制作用。