萬 瑩，朱傳衛(wèi)，張青松

β-內(nèi)酰胺酶是一種具有水解β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物能力的滅活酶，該種酶的出現(xiàn)是細(xì)菌對β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制之一[1]。超廣譜β-內(nèi) 酰 胺 酶（extended spectrum beta-lactamases,ESBLs）是由質(zhì)粒介導(dǎo)的β-內(nèi)酰胺酶，主要存在于臨床分離的革蘭陰性桿菌，其中以大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等腸桿菌科細(xì)菌最為常見[2]。隨著β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物尤其是第三代頭孢菌素的廣泛應(yīng)用，抗菌藥物選擇壓力不斷增大，產(chǎn)ESBLs細(xì)菌引起醫(yī)院感染病例也在不斷增加[3]，其中ICU是出現(xiàn)耐藥菌感染的最主要科室之一。由于ESBLs兼有多重耐藥性和快速傳播能力，給臨床抗感染治療帶來極大的困難[4]。目前有關(guān)產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌感染的國內(nèi)外研究大多僅側(cè)重于危險因素分析，難以滿足臨床定量化篩查的需求[5-6]。列線圖是一種具有個體化定量化預(yù)測功能的新型模型，近年來已被廣泛應(yīng)用于臨床風(fēng)險事件的預(yù)測[7]?；诖?，本研究擬在篩選ICU患者發(fā)生產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌感染的危險因素基礎(chǔ)上構(gòu)建列線圖風(fēng)險模型，以期為臨床早期識別和防控產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌所致的醫(yī)院感染提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 對象 選取2017年5月—2021年4月宣城市中心醫(yī)院ICU發(fā)生大腸埃希菌或肺炎克雷伯菌感染的189例患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲；②所有患者均符合《醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)（試行）》[8]中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)菌株鑒定及藥物敏感性（藥敏）試驗(yàn)確診；③入住ICU＞48 h；④30 d內(nèi)臨床資料保存完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①細(xì)菌培養(yǎng)陽性而無臨床癥狀者；②排除同一患者的重復(fù)菌株；③同一病例不重復(fù)收錄；④無應(yīng)答式拒訪者。本研究已通過我院倫理委員會審批，批準(zhǔn)編號：宣醫(yī)倫審（2016）第（052）號。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定和藥敏試驗(yàn) 入住ICU 30 d內(nèi)的患者標(biāo)本培養(yǎng)、分離、純化、鑒定等操作嚴(yán)格按照《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》[9]進(jìn)行。采用Compact vitek-Ⅱ全自動微生物分析儀進(jìn)行菌株鑒定[質(zhì)控菌株包括大腸埃希菌（ATCC 25922）、肺炎克雷伯菌（ATCC 700603）]。參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會推薦的紙片瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[10]，抗菌藥物紙片和M-H培養(yǎng)基均來自英國Oxoid公司。采用雙紙片確證試驗(yàn)進(jìn)行ESBLs的測定，當(dāng)頭孢噻肟（30 μg）和頭孢噻肟 /克拉維酸（30 μg/10 μg）、頭孢他啶（30 μg）和頭孢他啶/克拉維酸（30 μg/10 μg）中任一組抑菌圈直徑相差值≥5 mm時，可確證為產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌菌株。

1.2.2 資料收集 通過病歷系統(tǒng)收集患者臨床資料：性別，年齡，急性生理與慢性健康評分Ⅱ（acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ ,APACHEⅡ），留置尿管時長，抑酸劑使用時長，第三代頭孢菌素使用時長，抗菌藥物聯(lián)用時長，ICU住院時間及是否有糖尿病、高血壓、冠心病、慢性阻塞性肺?。╟hronic obstructive pulmonary disease, COPD）、低蛋白血癥、機(jī)械通氣。其中APACHEⅡ分值越高病情越重，取入住ICU 24 h內(nèi)最高值。留置尿管和藥物使用時長以入住ICU日期至陽性標(biāo)本送檢日期計算。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以頻數(shù)（%）表示，組間比較采用四格表χ2檢驗(yàn)。采用LASSO回歸篩選出非零系數(shù)的預(yù)測因素，采用Logistic回歸篩選ICU患者30 d內(nèi)發(fā)生產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌感染的危險因素。采用R（R3.5.3）軟件包和rms程序包繪制列線圖。采用bootstrap自抽樣法作內(nèi)部驗(yàn)證，通過計算一致性指數(shù)（C-index），繪制校正曲線、ROC曲線和決策曲線評估模型的預(yù)測效能。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 患者的一般情況和產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌菌株檢出情況 共入選189例患者，平均年齡為（74.16±7.54）歲。感染原發(fā)部位：肺部157例，腹腔12例，尿路10例，胸腔7例，血/深靜脈導(dǎo)管3例。檢出大腸埃希菌148株（78.31%）和肺炎克雷伯菌41株（21.69%）。檢出產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌菌株65例，入住ICU至陽性標(biāo)本檢出日時長3～30 d，總陽性檢出率為34.39%，其中大腸埃希菌47例，肺炎克雷伯菌18例，陽性檢出率分別占31.76%和43.90%。

2.2 ICU患者30 d內(nèi)發(fā)生產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌感染的單因素分析 基于產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌菌株檢出情況將患者分為產(chǎn)ESBLs組（n=65）和非產(chǎn)ESBLs組（n=124）。2組單因素分析結(jié)果顯示：產(chǎn)ESBLs組APACHEⅡ≥16分、留置尿管時長≥7 d、抑酸劑使用時長≥3 d、第三代頭孢菌素使用時長≥3 d、抗菌藥物聯(lián)用時長≥3 d和ICU住院時間≥15 d的患者比例明顯高于非產(chǎn)ESBLs組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05），見表1。

表1 ICU患者30 d內(nèi)發(fā)生產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌感染的單因素分析[例（%）]Table 1 Univariate analysis of ESBLs Gram-negative bacilli infection in ICU patients within 30 days [cases (%)]

續(xù)表1

2.3 ICU患者30 d內(nèi)發(fā)生產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌感染的預(yù)測因素篩選 LASSO回歸分析結(jié)果顯示，log（λ）為-2.6時二項(xiàng)式偏差最小，此時參數(shù)最優(yōu)。在線性回歸中系數(shù)為 0時，表明對相應(yīng)變量無影響，而最優(yōu)參數(shù)下對應(yīng)的非零系數(shù)的變量個數(shù)為6個，故篩選出APACHEⅡ、留置尿管時長、抑酸劑使用時長、第三代頭孢菌素使用時長、抗菌藥物聯(lián)用時長和ICU住院時間為系數(shù)不為零的重要預(yù)測因素，見圖1。

圖1 LASSO回歸分析篩選預(yù)測因素圖A. 二項(xiàng)式偏差曲線與log（λ）的關(guān)系曲線，虛線垂直線顯示為最佳λ值；B. 14個特征因素的LASSO回歸系數(shù)分布；根據(jù)log（λ）的序列對系數(shù)剖面圖進(jìn)行了評價，其中最佳λ產(chǎn)生了6個具有非零系數(shù)的變量Figure 1 LASSO regression analysis screening predictors

2.4 ICU患者30 d內(nèi)發(fā)生產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌感染的多因素Logistic回歸分析 以產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌感染發(fā)生情況為因變量，以LASSO回歸中篩出的重要預(yù)測因素為自變量，進(jìn)行二分類Logistic回歸分析，結(jié)果顯示：APACHEⅡ≥16分（OR=2.686）、留置尿管時長≥7 d（OR=2.915）、抑酸劑使用時長≥3 d（OR=2.561）、第三代頭孢菌素使用時長≥3 d（OR=2.795）、抗菌藥物聯(lián)用時長≥3 d（OR=3.305）和ICU住院時間≥15 d（OR=2.857）是ICU患者30 d內(nèi)發(fā)生產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌感染的危險因素（P均＜0.05），見表2。

表2 ICU患者30 d內(nèi)發(fā)生產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌感染的多因素Logistic回歸分析Table 2 Multivariate Logistic regression analysis of ESBLs Gram-negative bacilli infection in ICU patients within 30 days

2.5 ICU患者30 d內(nèi)發(fā)生產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌感染的列線圖風(fēng)險預(yù)警模型的建立 基于上述危險因素構(gòu)建預(yù)測ICU患者30 d內(nèi)發(fā)生產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌感染風(fēng)險的列線圖模型，結(jié)果顯示，各危險因素對應(yīng)的分值自上而下依次為83分、89分、79分、86分、100分、88分，見圖2。

圖2 預(yù)測ICU患者30 d內(nèi)發(fā)生產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌感染的列線圖風(fēng)險模型APACHEⅡ評分、留置尿管時長、抑酸劑使用時長、第三代頭孢菌素使用時長、抗菌藥物聯(lián)用時長和ICU住院時間6個變量軸上相應(yīng)點(diǎn)對應(yīng)不同的分?jǐn)?shù)，各項(xiàng)預(yù)測變量的評分相加，得到總分，不同總分對應(yīng)不同的ICU患者30 d內(nèi)發(fā)生產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌感染風(fēng)險概率。例如，1位APACHEⅡ評分≥16分、留置尿管時長≥7 d、抑酸劑使用時長≥3 d、第三代頭孢菌素使用時長＜3 d、抗菌藥物聯(lián)用時長≥3 d和ICU住院時間＜15 d是ICU患者，總得分為83+89+79+0+100+0=351分，對應(yīng)發(fā)生產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌感染的預(yù)測概率約為64%Figure 2 Nomogram risk model for predicting ESBLs Gram-negative bacilli infection in ICU patients within 30 days

2.6 列線圖模型的驗(yàn)證 模型驗(yàn)證結(jié)果顯示，C-index為0.795；校正曲線趨近于理想曲線，見圖3，ROC曲線下面積（AUC）為0.807（95% CI：0.775～0.839），見圖4。決策曲線顯示，在2條臨界線以上，即2%～81%范圍內(nèi)，模型凈獲益，見圖5。

圖3 列線圖模型的校正曲線Figure 3 Calibration curve of nomogram model

圖4 列線圖模型的ROC曲線Figure 4 ROC curve of nomogram model

圖5 列線圖模型的決策曲線分析圖Figure 5 Decision curve analysis of nomogram model

3 討 論

產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌是醫(yī)院感染的重要致病菌，盡管發(fā)病率因患者群體、時間和ESBLs，定義不同而不同，但在全世界范圍內(nèi)均呈持續(xù)上升趨勢[11]。國外文獻(xiàn)報道ICU患者中有5%～25%是產(chǎn)ESBLs的腸桿菌科細(xì)菌攜帶者[12]，國內(nèi)有研究報道大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌感染的產(chǎn)ESBLs檢出率分別為62.15%和78.78%[13-14]。本研究中產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌菌株總陽性檢出率34.39%，其中大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的陽性檢出率分別占31.76%和43.90%，與國內(nèi)外研究的檢出率具有較大的差異，可見產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌菌株存在地域性差異，這可能與各地經(jīng)濟(jì)狀況以及抗菌藥物使用習(xí)慣不同有關(guān)。

本研究篩選出APACHEⅡ≥16分、留置尿管時長≥7 d、抑酸劑使用時長≥3 d、第三代頭孢菌素使用時長≥3 d、抗菌藥物聯(lián)用時長≥3 d和ICU住院時間≥15 d是ICU患者30 d內(nèi)發(fā)生產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌感染的危險因素。楊靜等[15]報道APACHEⅡ是產(chǎn)ESBLs腸桿菌血行感染的危險因素，與本文結(jié)果一致。雖然俞錫燦等[16]報道APACHEⅡ≥16分與ICU內(nèi)發(fā)生產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌感染無關(guān)，但統(tǒng)計值P為0.08，已接近統(tǒng)計學(xué)差異臨界值。究其原因，可能是因?yàn)锳PACHEⅡ評分較高反映了患者病情較為危重，常存在不同程度的意識障礙和免疫力受損，導(dǎo)致纖毛清除功能和機(jī)體保護(hù)能力下降，為細(xì)菌的生長繁殖創(chuàng)造了有利條件。甄鵬等[17]報道留置尿管的患者更易分離出產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌，與本研究結(jié)果相似。究其原因，可能是因?yàn)榱糁媚蚬茏鳛橐豁?xiàng)侵入性操作，長期進(jìn)行會對尿道黏膜造成一定程度的機(jī)械性損傷，導(dǎo)致防御保護(hù)能力下降，故產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌的定植風(fēng)險增加。尤其是黏附于管壁的致病菌，由于表面生物膜或黏膜復(fù)合物的覆蓋，難以被抗菌藥物抑制或殺滅，從而易誘發(fā)感染。由于ICU患者為重癥患者，病情相對危急，一般盡管在不確定病原菌的前提下，臨床仍須經(jīng)驗(yàn)性使用抗菌藥物以挽救患者生命，聯(lián)用抗菌藥物已成為控制重癥感染的常用方法，但這樣會造成病原菌暴露在多種抗菌藥物中，易獲得耐藥性。黃文進(jìn)等[18]提出聯(lián)用抗菌藥物與產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌感染顯著相關(guān)，與本研究結(jié)果一致。抑酸劑常在ICU應(yīng)用于應(yīng)激性黏膜病變，它能夠有效減少胃酸的分泌，增高胃內(nèi)pH值，但也會導(dǎo)致胃腸道內(nèi)的細(xì)菌擺脫胃酸的抑制作用而過度繁殖，改變腸道微生物結(jié)構(gòu)。此外，抑酸劑還兼有降低胃粘液黏度，延長排空時間等作用，可造成胃腸道自我保護(hù)能力下降，增加感染風(fēng)險[19]。劉勇等[20]報道使用第三代頭孢菌素超過3 d是感染產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的危險因素，與本研究結(jié)果一致。第三代頭孢菌素是目前臨床常用的抗生素，可有效殺滅敏感菌群，但不合理的應(yīng)用會破壞正常菌群，誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。尤其是頭孢曲松等廣譜抗生素可將腸道內(nèi)耐藥菌株選擇出來，長期使用可誘發(fā)耐藥菌株感染。張湘湘等[21]報道住院時間是產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌感染的危險因素，與本研究結(jié)果一致。產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌廣泛存在于外界環(huán)境、人體皮膚和開放的腔道中，ICU患者多集中管理，當(dāng)患者長期暴露在醫(yī)院環(huán)境下時，接觸產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌的風(fēng)險也就較大。

既往有研究采用指數(shù)平滑法和ARIMA乘積季節(jié)模型來預(yù)測產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌的流行趨勢，通過回顧性分析觀測數(shù)據(jù)隨時間變化的規(guī)律有效預(yù)測了未來的流行趨勢和變化，并利用模型參數(shù)對結(jié)果進(jìn)行量化提高了模型的預(yù)測精度[22]。但此類模型難以個體化預(yù)測每1例患者的產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌感染風(fēng)險，臨床實(shí)用價值有限。本研究基于回歸方程的篩選結(jié)果構(gòu)建了ICU內(nèi)產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌感染風(fēng)險的列線圖模型，模型主要由危險因素、對應(yīng)線段和賦值軸3部分構(gòu)成，可視可讀，簡潔直觀，使用人員可通過簡單的作圖和計算快速個體化預(yù)測患者的感染風(fēng)險，相較于傳統(tǒng)數(shù)學(xué)模型更適用于臨床實(shí)際操作系統(tǒng)。同時，本研究為防止模型過度擬合，以及保證模型的可靠性，采用計算C-index，繪制校正曲線、ROC曲線和決策曲線驗(yàn)證模型的預(yù)測效能，并在結(jié)果中得到C-index高達(dá)0.795，校正曲線趨近于理想曲線，表明模型預(yù)測值與實(shí)際值具有較好的一致性。AUC為0.807（95% CI：0.775～0.839），表明模型區(qū)分度良好。且在2%～81%預(yù)測范圍內(nèi)，對ICU患者采取干預(yù)措施后，能夠在降低30 d內(nèi)發(fā)生產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌感染率方面凈獲益，故該模型在預(yù)測操作系統(tǒng)中具備良好的預(yù)測效能。此外，使用人員還可根據(jù)患者的各項(xiàng)指標(biāo)情況，以降低總分值為目標(biāo)采取干預(yù)措施，如對危重患者做好氣道保護(hù)措施，加強(qiáng)留置尿管護(hù)理，嚴(yán)格控制抑酸劑和第三代頭孢菌素的使用。同時，針對ICU患者要及早進(jìn)行微生物篩查，盡可能選用單種抗菌藥物進(jìn)行抗感染治療?？s短ICU住院時間，盡可能提高患者周轉(zhuǎn)率，對于預(yù)計長期入住ICU的患者，在細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果出來前有條件的可置入隔離病房，并對ICU患者周圍環(huán)境進(jìn)行嚴(yán)格消毒。

本研究存在的不足：受試者獲取局限于單中心，且數(shù)量有限，未能納入外中心數(shù)據(jù)對模型進(jìn)行外部驗(yàn)證；受條件限制未做細(xì)菌分子分型，未能準(zhǔn)確追溯既往抗菌藥物使用種類及療程；未對ICU轉(zhuǎn)出患者進(jìn)行遠(yuǎn)期預(yù)后評估。故模型仍須大規(guī)模、多中心的研究予以進(jìn)一步驗(yàn)證和完善。

綜上所述，臨床應(yīng)對APACHEⅡ≥16分、留置尿管時長≥7 d、抑酸劑使用時長≥3 d、第三代頭孢菌素使用時長≥3 d、抗菌藥物聯(lián)用時長≥3 d和ICU住院時間≥15 d的ICU患者予以高度重視，警惕其30 d內(nèi)發(fā)生產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌感染。根據(jù)危險因素建立的列線圖模型能夠有效預(yù)測ICU患者30 d內(nèi)發(fā)生產(chǎn)ESBLs革蘭陰性桿菌感染的風(fēng)險，有助于臨床及早篩查ESBLs革蘭陰性桿菌感染高風(fēng)險患者。