李秋方, 高 艷, 2, 梁立強(qiáng), 李正漢卿, 朱雅楠, 張 娟,楊尚寧, 傅云熙, 蘇松坤,*, 聶紅毅,*

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院), 福州 350002; 2. 江西省養(yǎng)蜂研究所, 江西省蜂業(yè)技術(shù)推廣站, 南昌 330052)

蜜蜂的采集行為對(duì)蜂群獲得物質(zhì)與能量、適應(yīng)環(huán)境、生存繁衍以及保護(hù)植物多樣性等方面具有重要意義(李莉等, 2012)，其主要受社會(huì)環(huán)境、體內(nèi)激素水平、組織的結(jié)構(gòu)與生理等變化影響(Robinson, 1987; Robinson and Huang, 1998; Whitfieldetal., 2003)。在組織的結(jié)構(gòu)與生理方面，研究者已對(duì)蜜蜂腦、咽下腺(hypopharyngeal glands, HGs)、觸角等組織中相關(guān)基因的差異表達(dá)進(jìn)行了廣泛研究，以期闡明采集行為的分子機(jī)制。蜜蜂腦是調(diào)節(jié)蜜蜂學(xué)習(xí)和記憶等復(fù)雜社會(huì)行為的中心器官，腦部相關(guān)基因的差異表達(dá)與采集行為的發(fā)育及成熟相關(guān)(Hanetal., 2017)。Toma等(2000)研究表明晝夜節(jié)律調(diào)控基因period的差異表達(dá)與蜜蜂的采集行為有關(guān)，其在采集蜂的大腦中的表達(dá)水平始終顯著高于其他日齡蜜蜂，這也暗示了社會(huì)性昆蟲的勞動(dòng)分工和生物鐘之間在分子水平上存在聯(lián)系。乙酰膽堿是昆蟲大腦中與學(xué)習(xí)相關(guān)的主要神經(jīng)遞質(zhì)，乙酰膽堿酯酶(AChE)對(duì)其具有水解活性，研究發(fā)現(xiàn)采集蜂乙酰膽堿酯酶基因mRNA水平的降低導(dǎo)致乙酰膽堿酯酶催化活性顯著降低，這在蘑菇體中尤為明顯(與嗅覺、視覺學(xué)習(xí)和記憶有關(guān)的大腦區(qū)域)，而乙酰膽堿酯酶抑制劑美曲磷酯的處理改善了嗅覺學(xué)習(xí)能力(Shapiraetal., 2001)，這些結(jié)果證明了采集蜂大腦中乙酰膽堿酯酶基因表達(dá)的下調(diào)與更高級(jí)學(xué)習(xí)能力的生理需求相一致。Amfor表達(dá)水平和相應(yīng)蛋白活性的增加影響工蜂的行為轉(zhuǎn)變，研究發(fā)現(xiàn)該基因在采集蜂視葉薄板中的表達(dá)量顯著高于哺育蜂，表明該基因可能通過調(diào)控視覺通路影響蜜蜂的采集行為(Ben-Shaharetal., 2002)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)該基因與采集過程的趨光行為有關(guān)(Ben-Shaharetal., 2003)。與哺育蜂相比，采集蜂對(duì)蔗糖更敏感，而花粉采集蜂比花蜜采集蜂對(duì)蔗糖更敏感。錳影響工蜂的蔗糖反應(yīng)能力，錳轉(zhuǎn)運(yùn)體編碼基因malvolio(mvl)的表達(dá)介導(dǎo)錳向腦細(xì)胞中運(yùn)輸(Ben-Shaharetal., 2004)。研究發(fā)現(xiàn)，與哺育蜂相比，采集蜂腦中mvlmRNA水平和頭部錳含量較高，且花粉采集蜂中的含量高于花蜜采集蜂。錳處理提高了蜜蜂對(duì)蔗糖的反應(yīng)，并導(dǎo)致早熟覓食(Ben-Shaharetal., 2004)。Liu等(2017)研究表明ame-miR-279a可能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Mblk-1 進(jìn)而影響蜜蜂的糖反應(yīng)能力，最終參與調(diào)控蜜蜂的采集行為。工蜂咽下腺的功能存在職能差異：在哺育蜂中合成及分泌蜂王漿，為蜂王、小幼蟲提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；在采集蜂中，咽下腺分泌蜂王漿蛋白過程受到抑制，轉(zhuǎn)而合成與蜂蜜釀造相關(guān)的酶類物質(zhì)(Ohashietal., 1997; Ohashietal., 1999; Uenoetal., 2015)。Ohashi等(1999)研究發(fā)現(xiàn)，α-淀粉酶和葡萄糖氧化酶的編碼基因在采集蜂的咽下腺中特異表達(dá)，這與采集過程中將花蜜加工成蜂蜜所需的這些碳水化合物代謝酶活性有關(guān)。蜜蜂觸角上分布著許多復(fù)雜的嗅覺感受器，用于檢測(cè)蜂群中化學(xué)信號(hào)以及采集過程中的蜜粉源信號(hào)。為了揭示工蜂行為發(fā)育過程中的嗅覺適應(yīng)機(jī)制，Nie等(2018)通過轉(zhuǎn)錄組分析對(duì)剛出房蜜蜂、哺育蜂和采集蜂的觸角中的基因表達(dá)水平進(jìn)行了全面分析，篩選到14個(gè)與采集行為緊密相關(guān)的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs)，并對(duì)不同行為狀態(tài)下的嗅覺基因家族成員的表達(dá)進(jìn)行了分析，這有助于闡明嗅覺與行為變化之間的分子機(jī)制。Mao等(2015)分析了采集蜂觸角和足中CYP9Q1,CYP9Q2,CYP9Q3和CYP4G11的表達(dá)模式，并表明這4個(gè)基因與采集過程有關(guān)。

蜜蜂上顎腺(mandibular glands, MGs)是位于蜜蜂頭部?jī)?nèi)表面兩側(cè)的一對(duì)大型囊狀物，作為蜜蜂的重要外分泌腺。在蜂群結(jié)構(gòu)中，上顎腺分泌物的組成與功能存在級(jí)型、日齡和職能差異(Huoetal., 2016; Rangeletal., 2016)。工蜂上顎腺主要合成與分泌10-羥基-2癸烯酸(10-hydroxy-2E-decenoic acid, 10-HDA)和10-羥基癸酸(10-hydroxydecanoic acid, 10-HDAA)以及蜂群報(bào)警信息素相關(guān)的2-庚酮等，在脂質(zhì)分泌、幼蟲營(yíng)養(yǎng)和信息素合成、勞動(dòng)分工和蜂群穩(wěn)定方面至關(guān)重要(Barkeretal., 1959; Plettneretal., 1996)。由于基因的多重效應(yīng)、基因網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性、環(huán)境作用和工蜂勞動(dòng)分工的可塑性(Robinson, 1992; Robinsonetal., 2005; Behrendsetal., 2007; Hanetal., 2021)，研究工蜂上顎腺中基因的表達(dá)與調(diào)控，對(duì)揭示工蜂勞動(dòng)分工的分子機(jī)制有著重要意義。目前，研究者們已從轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組水平闡釋哺育蜂上顎腺在蜂王漿合成與分泌的分子機(jī)制(Huoetal., 2016)。然而，采集蜂上顎腺中調(diào)控采集行為的機(jī)制尚不明確。

本研究利用課題組前期的西方蜜蜂Apismellifera5種不同職能工蜂(3日齡工蜂、10日齡哺育蜂、10日齡采集蜂、21日齡哺育蜂和21日齡采集蜂)上顎腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，在降低日齡因素對(duì)職能分工影響的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)分析了5種職能工蜂上顎腺中基因表達(dá)模式，篩選了采集蜂上顎腺中高表達(dá)的DEGs，并利用qRT-PCR對(duì)2個(gè)關(guān)鍵DEGs在工蜂不同發(fā)育時(shí)期和采集蜂不同組織的表達(dá)譜進(jìn)行分析，這些結(jié)果將為闡明西方蜜蜂采集行為的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)蜂種

實(shí)驗(yàn)材料為福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)實(shí)驗(yàn)蜂場(chǎng)的“蜂強(qiáng)1號(hào)”西方蜜蜂。蜂群由課題組進(jìn)行飼養(yǎng)管理以確保能維持強(qiáng)群，群內(nèi)至少含有健康飽滿的臨出房的封蓋子脾2～3張(平均溫度約為25℃，相對(duì)濕度為60%～65%，光周期為13L∶11D)。

1.2 主要試劑及儀器

熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)、體視顯微鏡1臺(tái)、冷光源1臺(tái)；RNA提取液、Hiscript?Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme公司，南京)、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme公司，南京)。

1.3 上顎腺轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析及采集蜂上顎腺高表達(dá)DEGs篩選

3日齡工蜂(3 dW)、10日齡哺育蜂(10 dN)、21日齡哺育蜂(21 dN)、10日齡采集蜂(10 dF)和21日齡采集蜂(21 dF)的Illumina轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)(每個(gè)樣本3個(gè)生物學(xué)重復(fù))來源于本課題組前期公布數(shù)據(jù)(NCBI SRA登錄號(hào): SUB8031156)?；贔PKM(fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments)計(jì)算基因表達(dá)量，并分析和篩選DEGs (高艷等, 2020)。采集蜂上顎腺中高表達(dá)DEGs的篩選標(biāo)準(zhǔn)如下：DEGs在21 dF上顎腺中的表達(dá)量顯著高于3 dW, 10 dN和21 dN上顎腺中的；DEGs在10 dF上顎腺中的表達(dá)量顯著高于10 dN上顎腺中的；DEGs在21 dF上顎腺中表達(dá)量與10 dF上顎腺中的無顯著差異。利用clusterProfiler R軟件包、GO數(shù)據(jù)庫、KEGG數(shù)據(jù)庫、BLAST軟件，并結(jié)合NovoMagic平臺(tái)對(duì)DEGs進(jìn)行GO和KEGG富集分析。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)DEGs的表達(dá)量

基于梁立強(qiáng)等(2021)限王產(chǎn)卵的方法，準(zhǔn)確收集西方蜜蜂3日齡卵、1日齡幼蟲、3日齡幼蟲、5日齡幼蟲、1日齡蛹、3日齡蛹、5日齡蛹、7日齡蛹、9日齡蛹、11日齡蛹、剛出房工蜂。將封蓋子脾置于35℃的培養(yǎng)箱，收集出房時(shí)間小于6 h的工蜂作為剛出房蜜蜂；收集頭部插入幼蟲巢房持續(xù)10 s以上的工蜂作為哺育蜂；收集返回巢門口且花粉筐載有花粉的工蜂作為采集蜂。按照高艷等(2021)組建蜂群方法，采集10日齡哺育蜂和10日齡采集蜂，在干冰上分別解剖采集蜂的上顎腺、咽下腺、腦、胸、腹、足、翅和觸角以及10日齡哺育蜂和10日齡采集蜂的上顎腺，采用Trizol法提取RNA，利用Hiscript?Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme公司，南京)合成用于qRT-PCR分析的cDNA。

從采集蜂上顎腺中特異性上調(diào)表達(dá)DEGs中隨機(jī)選擇了8個(gè)基因(LOC100576395,LOC411983,LOC410235,LOC725581,LOC410527,LOC406131,LOC408453和LOC410253)，利用qRT-PCR檢測(cè)在10日齡哺育蜂和10日齡采集蜂上顎腺中表達(dá)量；同時(shí)利用qRT-PCR檢測(cè)本研究篩選到的2個(gè)可能與采集蜂能量代謝和外源性物質(zhì)解毒相關(guān)的關(guān)鍵DEGs [Δ-1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因Amp5cs(LOC412948)和細(xì)胞色素P450 9e2基因CYP9Q3(LOC408453)]在不同發(fā)育時(shí)期和采集蜂各組織(上顎腺、咽下腺、腦、胸、腹、足、翅和觸角)中的表達(dá)量。 利用Primer Premier 6軟件設(shè)計(jì)基因特異引物(表1)，以actin(GenBank登錄號(hào): NM_001185146.1)作為相對(duì)定量的內(nèi)參基因。PCR反應(yīng)體系(10 μL): ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme公司，南京)5 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各0.4 μL, cDNA模板1 μL, ddH2O 3.2 μL。PCR反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性3 min; 95℃變性10 s, 60℃退火 30 s, 40次循環(huán); 最后溶解曲線分析。每組設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)和3個(gè)生物學(xué)重復(fù)(3日齡卵和1日齡幼蟲每組100個(gè)個(gè)體，其他發(fā)育時(shí)期每組3個(gè)個(gè)體，組織樣本每組20個(gè)個(gè)體)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算DEGs的相對(duì)表達(dá)量(Livak and Schmittgen, 2001)。

表1 引物信息

1.5 數(shù)據(jù)分析

Graphpad Prism Version 8用于圖表繪制，其中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠性驗(yàn)證時(shí)，基因表達(dá)量采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析；目的基因時(shí)空表達(dá)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)方法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 采集蜂上顎腺中高表達(dá)DEGs

基于上顎腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選到21 dFvs3 dW有2 770個(gè)DEGs；21 dFvs10 dN有568個(gè)DEGs；21 dFvs21 dN 有664個(gè)DEGs；10 dFvs10 dN有374個(gè)DEGs，將這4組交集得到69個(gè)共有DEGs。這69個(gè)DEGs可能與采集行為調(diào)控及日齡發(fā)育等相關(guān)。由于工蜂勞動(dòng)分工的可塑性，我們排除21 dFvs10 dF與69個(gè)DEGs交集得到的7個(gè)DEGs以減少日齡因素的干擾，最終得到采集蜂上顎腺中高表達(dá)的62個(gè)DEGs(圖1)。

圖1 西方蜜蜂工蜂上顎腺(MG)中高表達(dá)基因篩選韋恩圖

在62個(gè)DEGs中，只有22個(gè)DEGs在21日齡采集蜂上顎腺中的表達(dá)量顯著高于在3日齡工蜂、10日齡哺育蜂、21日齡哺育蜂上顎腺中的表達(dá)量，同時(shí)這些基因在10日齡采集蜂上顎腺中的表達(dá)量也顯著高于在10日齡哺育蜂上顎腺中的表達(dá)量，符合篩選采集蜂上顎腺中高表達(dá)DEGs的標(biāo)準(zhǔn)(表2)；而另外35個(gè)DEGs則呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)，即在同日齡(21和10日齡)采集蜂上顎腺中的表達(dá)量均低于相應(yīng)日齡哺育蜂上顎腺中的表達(dá)量，同時(shí)在21日齡采集蜂上顎腺中的表達(dá)量也顯著低于在3日齡工蜂和10日齡哺育蜂上顎腺中的表達(dá)量。

表2 西方蜜蜂工蜂上顎腺中22個(gè)上調(diào)差異表達(dá)基因(DEGs)的表達(dá)

2.2 采集蜂上顎腺中高表達(dá)DEGs功能富集

22個(gè)上調(diào)表達(dá)DEGs的GO功能富集表明：在細(xì)胞組成大類中，DEGs富集在細(xì)胞核(nucleus)、細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器(intracellular membrane-bounded organelle)、膜結(jié)合細(xì)胞器(membrane-bounded organelle)；在分子功能大類中，DEGs主要富集在氧化還原酶活性(oxidoreductase activity)、過渡金屬離子結(jié)合(transition metal ion binding)、序列特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性(transcription factor activity, sequence-specific DNA binding)、核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性(nucleic acid binding transcription factor activity)、四吡咯結(jié)合(tetrapyrrole binding)、血紅素結(jié)合(heme binding)、陰離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性(anion transmembrane transporter activity)、鐵離子結(jié)合(iron ion binding)等；在生物學(xué)過程大類中，DEGs主要富集在激素應(yīng)答(response to hormone)、激素介導(dǎo)的信號(hào)通路(hormone-mediated signaling pathway)、脂質(zhì)應(yīng)答(response to lipid)、甾體激素介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)(steroid hormone-mediated signaling pathway)等(圖2)。KEGG通路富集表明，DEGs主要富集在膽固醇代謝(cholesterol metabolism)、半乳糖代謝(galactose metabolism)、淀粉和蔗糖代謝(starch and sucrose metabolism)、精氨酸和脯氨酸代謝(arginine and proline metabolism)、細(xì)胞凋亡-果蠅(apoptosis-fly)、氨基酸生物合成(biosynthesis of amino acids)、過氧化物酶體(peroxisome)、自我吞噬-動(dòng)物(autophagy-animal)等通路(圖3)。

圖2 西方蜜蜂工蜂上顎腺中22個(gè)上調(diào)的差異表達(dá)基因(DEGs)的GO功能富集

圖3 西方蜜蜂工蜂上顎腺中22個(gè)上調(diào)的差異表達(dá)基因(DEGs)的KEGG通路富集

2.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性驗(yàn)證

對(duì)qRT-PCR結(jié)果表明：隨機(jī)選擇的8個(gè)DEGs(LOC100576395,LOC411983,LOC410235,LOC725581,LOC410527,LOC406131,LOC408453和LOC410253)的表達(dá)模式與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的表達(dá)模式一致(圖4)，進(jìn)一步證實(shí)了上顎腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性。

圖4 西方蜜蜂工蜂上顎腺中8個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs)的qRT-PCR驗(yàn)證

2.4 關(guān)鍵DEGs時(shí)空表達(dá)

LOC412948(Amp5cs)在西方蜜蜂工蜂各發(fā)育階段均有表達(dá)(圖5: A)，其在卵期表達(dá)量較低；在幼蟲階段表達(dá)量相對(duì)較高；在蛹期表達(dá)量有兩個(gè)上升階段，在1-5日齡時(shí)表達(dá)量逐漸升高，且在5日齡蛹達(dá)到蛹期峰值，隨著日齡的發(fā)育在7日齡蛹的表達(dá)量陡然下降，然后逐步上升；在從剛出房蜜蜂到采集蜂的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，且在采集蜂中的表達(dá)量達(dá)到整個(gè)發(fā)育歷程的最大值。LOC408453(CYP9Q3)在西方蜜蜂各發(fā)育階段中均有表達(dá)(圖5: B)，在卵期相對(duì)表達(dá)量較低；幼蟲階段表達(dá)量在5 日齡時(shí)較高，而其他日齡時(shí)較低；在蛹期的表達(dá)量更低且表達(dá)趨勢(shì)較穩(wěn)定；在成年蜂階段隨著日齡的發(fā)育表達(dá)量呈高量表達(dá)的上升趨勢(shì)。整個(gè)發(fā)育歷程中，該基因在采集蜂中的表達(dá)量高于其他發(fā)育階段的表達(dá)量。

圖5 西方蜜蜂工蜂上顎腺中差異表達(dá)基因(DEGs)LOC412948(Amp5cs)(A)和LOC408453(CYP9Q3)(B)在各發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量

LOC412948(Amp5cs)在采集蜂各檢測(cè)組織中均有表達(dá)，但在腹、胸、上顎腺和觸角中的表達(dá)量顯著高于在其他組織中的表達(dá)量(P<0.05)(圖6: A)。LOC408453(CYP9Q3)在采集蜂各檢測(cè)組織中均有表達(dá)，在觸角和足中的表達(dá)量顯著高于在其他組織中的(P<0.05)(圖6: B)。

3 討論

3.1 主要富集通路中相關(guān)DEGs

本研究在采集蜂上顎腺中共篩選到22個(gè)高表達(dá)的DEGs，這些DEGs主要富集在膽固醇代謝、半乳糖代謝、淀粉和蔗糖代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、細(xì)胞凋亡-果蠅、氨基酸生物合成、過氧化物酶體、自我吞噬-動(dòng)物等代謝通路(圖2, 3)，表明DEGs可能主要參與采集蜂上顎腺生理發(fā)育以及能量供應(yīng)、外源性物質(zhì)解毒、花蜜轉(zhuǎn)化等代謝通路，進(jìn)而影響蜜蜂的采集行為。

在昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育過程中，脂類物質(zhì)起到至關(guān)重要的作用：昆蟲體內(nèi)貯存的脂肪為胚胎發(fā)生和發(fā)育、變態(tài)、昆蟲飛翔和生殖提供能源，脂類物質(zhì)也是昆蟲激素和信息素等的組成成分(李曉鳳等, 2020)。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是一種真核生物中廣泛存在的蛋白質(zhì)降解通路，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和DNA修復(fù)、細(xì)胞免疫與應(yīng)答等生理活動(dòng)中起著重要調(diào)控作用，E3 泛素連接酶作為泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的重要組成部分，在蛋白泛素化過程中決定底物識(shí)別的特異性(金姝雯等, 2021)。本研究轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，E3 泛素連接酶編碼基因LOC412897在采集蜂上顎腺特異性高表達(dá)(表2)，且KEGG富集分析顯示該基因富集在膽固醇代謝通路中，推測(cè)其可能在采集蜂上顎腺脂類物質(zhì)代謝和蛋白質(zhì)降解等生理過程中承擔(dān)著更加復(fù)雜的功能。

超氣門蛋白(ultraspiracle, USP)是核激素受體家族的成員，該家族是調(diào)控細(xì)胞分化和發(fā)育、穩(wěn)態(tài)及生殖的配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎和胚胎后發(fā)育中起著關(guān)鍵作用(Segraves, 1991)。 在果蠅Drosophila中，兩種活性JH亞型生理調(diào)節(jié)因子(JH酸和JH甲酯)與USP特異結(jié)合，誘導(dǎo)了USP的構(gòu)象變化和寡聚，這可能賦予USP不同的活性來影響轉(zhuǎn)錄過程(Jones and Sharp, 1997)。USP和蛻皮激素受體(EcR)形成的異源二聚體與蛻皮激素結(jié)合后，調(diào)控昆蟲生理的許多方面。本研究轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)編碼USP的基因LOC409227在采集蜂上顎腺中高量表達(dá)(表2)，其可能是蜜蜂MGs對(duì)JH和蛻皮激素作出應(yīng)答的媒介，促進(jìn)采集蜂的行為發(fā)育與成熟。

Kruppel同源物(Kruppel homologs, Kr-hs)是鋅指轉(zhuǎn)錄因子，在協(xié)調(diào)發(fā)育和細(xì)胞分化中起重要作用，包括神經(jīng)發(fā)育(Isshikietal., 2001; Kaczynskietal., 2003)。研究表明Kruppel homolog 1(Kr-h1)在果蠅形態(tài)發(fā)生過程中對(duì)蛻皮激素具有敏感性，并與果蠅幼蟲的運(yùn)動(dòng)軸突引導(dǎo)和突觸發(fā)生有關(guān)(Pecasseetal., 2000; Krautetal., 2001)。另外，在不同物種的進(jìn)化過程中，這個(gè)家族的成員經(jīng)歷了復(fù)制并獲得了新功能(Shannonetal., 2003)。在蜜蜂中，微陣列研究表明，與哺育蜂相比，采集蜂腦部Kr-h1有著更高的表達(dá)量(Whitfieldetal., 2003)，其表達(dá)受蜂王上顎腺信息素的強(qiáng)烈調(diào)控，特別是在蜜蜂腦部綜合感覺信息的蘑菇體中(Grozingeretal., 2003)。進(jìn)一步研究表明Kr-h1表達(dá)與采集狀態(tài)無關(guān)，而是與行為轉(zhuǎn)變的穩(wěn)定生理變化有關(guān)(Fussnecker and Grozinger, 2008)，例如基因表達(dá)和神經(jīng)元結(jié)構(gòu)變化，這些變化是將上顎腺信息素刺激傳遞給下游行為和生理變化所必需的。本研究發(fā)現(xiàn)Kr-h1的編碼基因LOC100576395在采集蜂上顎腺中的表達(dá)量顯著性高于在哺育蜂中的(表2)，暗示轉(zhuǎn)錄因子Kr-h1在采集蜂上顎腺中具有其他功能，可能參與采集蜂上顎腺的信息素處理及其他相關(guān)代謝過程。

碳水化合物代謝酶中的α-葡萄糖苷酶(α-glucosidases，HBGases)在將花蜜中的蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖、果糖的過程中起著重要的作用(Chanchaoetal., 2008)。根據(jù)底物特異性，HBGases有3種異構(gòu)體：HBGaseⅠ, HBGaseⅡ和HBGaseⅢ(Kubotaetal., 2004)。其中，野生型HBGaseⅢ以蔗糖為底物。研究表明，工蜂的上顎腺與咽下腺存在兩種截然不同的職能狀態(tài)(Kuboetal., 1996)：哺育蜂的上顎腺和下咽腺發(fā)育良好有助于合成與分泌蜂王漿，而采集蜂的上顎腺和咽下腺萎縮退化，并激活將花蜜中蔗糖水解為葡萄糖和果糖的α-糖葡萄糖苷酶。本研究發(fā)現(xiàn)編碼HBGaseⅢ的基因LOC406131在采集蜂上顎腺中的表達(dá)量顯著高于哺育蜂中的(表2)，這與采集蜂在采集過程中將花蜜中的蔗糖水解為葡萄糖和果糖的水解活性需求有關(guān)(Simpsonetal., 1968; Sasagawaetal., 1989)，表明該基因可能在采集蜂上顎腺促使花蜜中的蔗糖水解為葡萄糖和果糖的過程中發(fā)揮著重要的作用。

蜜蜂的信息素成分具有顯著的復(fù)雜性，這些化學(xué)信號(hào)是碳?xì)浠衔?、蠟酯、脂肪酸、醛和醇的混合物。Teerawanichpan等(2010)研究表明，在蜜蜂中脂肪酰輔酶A還原酶(AmFAR1)催化多種脂肪酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇。其中，AmFAR1在蜜蜂頭部高表達(dá)，異源表達(dá)表明AmFAR1可以將多種脂肪酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇，其中C18硬脂酸是最佳的底物。此外，疏水圖譜分析表明AmFAR1在其羧基末端含有一個(gè)高度疏水區(qū)域，在哺乳動(dòng)物中也觀察到了疏水區(qū)，這是將酶靶向合成血漿原的過氧化物酶體所必需的(Cheng and Russell, 2004; Honshoetal., 2010)。結(jié)合AmFAR1的一級(jí)結(jié)構(gòu)、底物譜以及在工蜂中的表達(dá)模式，表明AmFAR1不太可能在分泌蜂蠟方面起主要作用，而是合成脂肪醇參與信息素的生物合成。本研究轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明，脂肪酰輔酶A還原酶的編碼基因(LOC411983)在采集蜂上顎腺中顯著高表達(dá)(表2)，其編碼產(chǎn)物可能與采集過程中復(fù)雜的信息交流有關(guān)。

3.2 采集蜂脯氨酸合成相關(guān)DEGs

本研究轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較結(jié)果表明，與采集行為緊密相關(guān)的Amp5cs富集在精氨酸和脯氨酸的代謝通路中。qRT-PCR結(jié)果表明，Amp5cs在成年蜂中的表達(dá)量隨日齡增長(zhǎng)而增加，在采集蜂中表達(dá)量達(dá)到峰值(圖5: A)；在采集蜂各組織中，Amp5cs在腹、胸、上顎腺和觸角中高量表達(dá)(圖6: A)。而在前期相關(guān)研究中，Micheu等(2000)發(fā)現(xiàn)與喂食葡萄糖并保持休息狀態(tài)的采集蜂相比，喂食或注射葡萄糖的采集蜂在完成飛行實(shí)驗(yàn)后，血淋巴中脯氨酸的濃度顯著降低，但其他氨基酸的含量沒有顯著性變化，這表明脯氨酸參與采集蜂的飛行代謝；Carter等(2006)研究表明，花蜜中的脯氨酸主要為蜜蜂短期、快速的采集飛行提供能量，而葡萄糖用于長(zhǎng)期的飛行代謝；Mollaei等(2013)研究表明，脯氨酸能顯著降低蜜蜂的過冷卻點(diǎn)(supercooling point, SCP)，進(jìn)而提高蜜蜂的耐寒性。另外，在馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata中，RNAi沉默Amp5cs，結(jié)果顯著降低了成蟲血淋巴中脯氨酸和精氨酸含量，進(jìn)一步降低了飛行速度，縮短飛行距離，并增加了成蟲的死亡率(Wanetal., 2014)。綜上表明，Amp5cs可能參與蜜蜂中Pro和Arg的生物合成，為采集過程及相關(guān)組織發(fā)育提供能量，而Amp5cs基因在上顎腺中高量表達(dá)，可能與采集蜂上顎腺的生理發(fā)育有關(guān)。

3.3 采集蜂外源性物質(zhì)降解相關(guān)DEGs

本研究中，qRT-PCR檢測(cè)比較了CYP9Q3編碼基因(LOC408453)在不同發(fā)育時(shí)期和采集蜂不同組織間的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，該基因的表達(dá)量在成蜂階段隨日齡增長(zhǎng)而增加，采集蜂中表達(dá)量達(dá)到最高(圖5: B)，而在采集蜂不同組織間，在觸角和足中顯著性高量表達(dá)(圖6: B)，這與前期研究結(jié)果(Maoetal., 2011, 2015)一致，表明細(xì)胞色素P4509e2基因可能也參與采集過程中復(fù)雜的外源物質(zhì)的解毒。另外，在減少日齡因素干擾下，相比3日齡工蜂和哺育蜂，該基因在采集蜂上顎腺中顯著高表達(dá)，表明該基因在采集蜂上顎腺中具有其他功能，可能與上顎腺相關(guān)生理變化有關(guān)。

蜂群的勞動(dòng)分工受復(fù)雜多樣的因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，包括蜜蜂腦部、咽下腺、上顎腺等相關(guān)組織中基因的綜合性調(diào)控?；诜淙簞趧?dòng)分工的可塑性，在減少日齡因素影響下，深入分析3 日齡幼蜂、相同日齡哺育蜂和采集蜂(10和21日齡)上顎腺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出22個(gè)采集蜂上顎腺中高表達(dá)的DEGs，其中2個(gè)關(guān)鍵的DEGs(Amp5cs和P4509e2)在采集蜂和采集蜂上顎腺組織高量表達(dá)，暗示它們可能在采集行為中發(fā)揮重要的生理功能，后續(xù)可利用RNAi或CRISPR/Cas9技術(shù)驗(yàn)證其功能。該研究對(duì)上顎腺中基因表達(dá)模式進(jìn)行系統(tǒng)分析，為上顎腺調(diào)控采集行為的分子機(jī)制及相關(guān)基因功能研究奠定基礎(chǔ)。