益生菌牙膏緩解犬牙菌斑和牙結(jié)石的研究

鄭智杰，彭曦冉，焦玉珠，唐海麗，陳欣雨，張曉露，王自力，吳海沖

（1.浙江大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)中心，浙江 杭州 310058；2.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058；3.上海弗艾柏生物科技有限公司，上海 200092）

牙周病是影響牙齒及其周圍組織的一系列炎性疾病， 為小動(dòng)物最常見的疾病之一。 犬貓的年齡、品種、遺傳、飲食、棲息地、牙齒護(hù)理頻率和口腔菌群狀況等與牙周病的發(fā)生有關(guān)［1］。 越來越多的研究表明牙周病與系統(tǒng)性疾病之間存在相關(guān)性，如中風(fēng)、心肌梗死和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化與牙周炎有關(guān)； 心血管病變的嚴(yán)重程度與牙周感染和炎癥的程度有關(guān)［2-3］。 隨著寵物犬飼養(yǎng)數(shù)量的增加，2歲后犬的牙周病發(fā)病率可達(dá)80%［4］，因此，預(yù)防牙周病的發(fā)生對(duì)寵物犬的健康至關(guān)重要。

牙菌斑和牙結(jié)石是誘發(fā)牙周病的主要原因。近年來，益生菌被用于治療多種疾病，其在牙周病的治療中也逐漸流行起來［5-6］。 該研究旨在確定某公司生產(chǎn)的益生菌牙膏對(duì)犬牙菌斑和牙結(jié)石形成的緩解作用， 從而為寵物在使用該功能性產(chǎn)品的功效情況提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用口腔檢查合格、均無牙周疾病、牙齒咬合正常、身體健康狀況良好的比格犬10 只（雌雄兼有，購自濟(jì)南金豐實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），且在試驗(yàn)前7 天，動(dòng)物未使用抗生素或其他消炎藥。在試驗(yàn)開始前，進(jìn)行全面的臨床和血液生化檢查，確保犬健康狀況良好， 試驗(yàn)期間每周由獸醫(yī)檢查犬的健康狀況。

1.1.2 犬糧和益生菌牙膏

犬糧購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司，經(jīng)中國廣州分析測試中心檢測符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 配合飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》（GB/T14924.2—2001）與《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 配合飼料營養(yǎng)成分》（GB/T 14924.3—2010）的要求［7-8］。益生菌牙膏，由上海某生物科技公司提供，規(guī)格：100 g/支，主要含有植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），每克含滅活益生菌數(shù)量為5×107CFU。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

電子天平，型號(hào)：BSA2202S，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司產(chǎn)品；電子臺(tái)秤，型號(hào)：IW2-150，賽多利斯工業(yè)稱重設(shè)備（北京）有限公司產(chǎn)品；全自動(dòng)血液體液分析儀，型號(hào)：XN-1000，希森美康醫(yī)用電子（上海）有限公司產(chǎn)品；全自動(dòng)生化分析儀，型號(hào)：7180，日本日立公司產(chǎn)品；全自動(dòng)凝血分析儀，型號(hào)：C3510，北京普利生儀器有限公司產(chǎn)品；低速冷凍離心機(jī)，型號(hào)：L535R，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司產(chǎn)品； 電子體溫計(jì)，型號(hào)：MC-347，歐姆龍健康醫(yī)療（中國）有限公司產(chǎn)品；冷光型孔式手術(shù)無影燈，型號(hào)：KS05L，汕頭市福利醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；潔牙拋光一體機(jī)，型號(hào)：ARTSP1，雙博診斷產(chǎn)品；唐伯森口臭檢測儀，型號(hào)：Twin Breason Ⅱ，上海榮峰醫(yī)療用品有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將10 只比格犬分為陰性對(duì)照組和益生菌牙膏組，每組5 只，試驗(yàn)第0 天對(duì)所有犬進(jìn)行潔牙拋光處理。陰性對(duì)照組的犬正常飼喂犬糧；益生菌牙膏組的犬每次餐后約0.5 h 給予約4 g/只益生菌牙膏， 用棉簽均勻涂抹在犬口腔牙齒表面， 等待約30 s，防止犬舔舐，30 s 后可自由飲水。益生菌牙膏每天給予2 次，連續(xù)使用28 d。

1.2.2 測定指標(biāo)及方法

1.2.2.1 牙菌斑、牙結(jié)石評(píng)分

牙菌斑、 牙結(jié)石評(píng)分測試牙齒分別為上頜：I3、C、P3、P4、M1，下頜：C、P3、P4、M1。 每次評(píng)分操作均在動(dòng)物鎮(zhèn)靜或麻醉狀態(tài)下進(jìn)行， 使用鹽酸賽拉嗪注射液進(jìn)行麻醉或鎮(zhèn)靜， 麻醉劑量為7.5～10.0 mg/（kg·BW）， 具體使用劑量以實(shí)際情況為準(zhǔn)， 補(bǔ)充麻醉劑量不超過該動(dòng)物首次麻醉劑量的25%。 每次完成操作后，可經(jīng)肌肉注射途徑給予鹽酸苯噁唑注射液，以加快犬蘇醒。

①牙菌斑評(píng)分：連續(xù)使用益生菌牙膏28 d，在試驗(yàn)第14 天、 試驗(yàn)第29 天各統(tǒng)計(jì)每只犬牙齒的牙菌斑情況1 次， 用菌斑顯示劑對(duì)測試的牙齒進(jìn)行染色并用純水沖洗，參考Turesky 等［9］人改良的Quigley-Hein 法對(duì)測試牙齒的牙菌斑判定評(píng)分，并拍照記錄。 牙菌斑評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：

a.覆蓋面積：0 分＝牙面無菌斑；1 分＝牙頸部齦緣處有散在的點(diǎn)狀菌斑；2 分＝牙頸部菌斑寬度不超過1 mm；3 分＝牙頸部菌斑覆蓋寬度超過1 mm，但在牙面1/3 以下；4 分＝菌斑覆蓋面積占牙面1/3～2/3；5 分＝菌斑覆蓋面積占牙面2/3 以上。

b.厚度：0 分＝無顏色；1 分＝輕度，點(diǎn)狀或淺紅色；2 分＝中度，紅色；3 分＝重度，深紅色。

c.牙菌斑評(píng)分計(jì)算：覆蓋面積×厚度，根據(jù)測試牙齒牙菌斑評(píng)分計(jì)算算術(shù)平均值。

②牙結(jié)石評(píng)分：試驗(yàn)第29 天統(tǒng)計(jì)完每只犬牙齒的牙菌斑情況后， 使用Warrick-Gorrel 法統(tǒng)計(jì)測試牙齒的牙結(jié)石評(píng)分［10］。 具體操作方法為先用軟毛牙刷將牙菌斑刷除，再用純水沖洗干凈，用注射針管吹空氣使牙齒表面變干燥或使用干燥無菌紗布輕柔蘸取殘留水分后進(jìn)行牙結(jié)石評(píng)分。 牙結(jié)石評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：

a.覆蓋面積：0 分=牙齒表面無牙結(jié)石；1 分=牙齒表面牙結(jié)石覆蓋范圍＜24%；2 分=牙齒表面牙結(jié)石覆蓋范圍在25%～49%；3 分=牙齒表面牙結(jié)石覆蓋范圍在50%～74%；4 分=牙齒表面牙結(jié)石覆蓋范圍＞75%。

b.牙結(jié)石評(píng)分計(jì)算：根據(jù)測試牙齒牙結(jié)石覆蓋面積計(jì)算算術(shù)平均值。

1.2.2.2 口腔氣體揮發(fā)性化合物濃度檢測

試驗(yàn)第29 天使用韓國Twin Breason Ⅱ唐伯森口臭檢測儀對(duì)動(dòng)物口腔氣體揮發(fā)性化合物H2S和CH3SH 的濃度進(jìn)行檢測。 具體操作方法：待犬鎮(zhèn)靜或麻醉后，先將犬的嘴張開3～5 s，然后讓犬嘴唇完全閉合保持約30 s，30 s 后在不完全打開嘴唇的情況下，將注射器由犬齒和前臼齒的縫隙伸入口腔內(nèi)部后盡量閉合嘴唇，隨后緩慢拉動(dòng)活塞抽取約14 mL 氣體， 停留3～5 s 讓氣體發(fā)生充分交換，完成采樣后，立即拔出注射器并與Twin Breason Ⅱ唐伯森口臭檢測儀連接， 測定抽取的口腔氣體揮發(fā)性化合物H2S 和CH3SH 的濃度。 每只犬重復(fù)檢測2～5 次，擇優(yōu)選取2 次檢測數(shù)值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理方法

統(tǒng)計(jì)益生菌牙膏使用不同時(shí)間階段的牙菌斑評(píng)分、牙結(jié)石評(píng)分、口腔氣體揮發(fā)性化合物濃度的檢測結(jié)果，所有數(shù)據(jù)均輸入Excel 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組計(jì)量數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（Mean±SD）的形式表示。產(chǎn)品減少功效參考美國獸醫(yī)口腔健康委員會(huì) （Veterinary Oral Health Council，VOHC）指南（http：//www.vohc.org/）［11］，定義如下：減少幅度（%）=（陰性對(duì)照組評(píng)分均值-試驗(yàn)組評(píng)分均值）/陰性對(duì)照組評(píng)分均值×100%。分析益生菌牙膏對(duì)犬牙菌斑、 牙結(jié)石和口腔氣體揮發(fā)性化合物濃度的減少功效，當(dāng)減少幅度≥15%時(shí)，說明該產(chǎn)品具有減輕牙菌斑、牙結(jié)石或口臭的功效。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌牙膏對(duì)犬牙菌斑形成的影響

由表1 可知， 試驗(yàn)前所有犬都進(jìn)行了潔牙處理，所以第0 天的犬牙菌斑評(píng)分均為0；連續(xù)給予益生菌牙膏第14 天，陰性對(duì)照組、益生菌牙膏組犬牙菌斑評(píng)分分別為5.61±1.95、5.63±2.18 （見表1）；與陰性對(duì)照組相比，益生菌牙膏組口腔牙菌斑評(píng)分均值減少-0.36%（見表2）。 試驗(yàn)第29 天，陰性對(duì)照組、 益生菌牙膏組動(dòng)物牙菌斑評(píng)分分別為9.78±2.93、7.68±1.23 （見表1）； 與陰性對(duì)照組相比， 益生菌牙膏組口腔牙菌斑評(píng)分均值減少21.47%（見表2）， 說明此款動(dòng)物益生菌牙膏具有減少犬牙菌斑產(chǎn)生的功效。 圖1 為益生菌牙膏減輕牙菌斑形成功效評(píng)分對(duì)比，圖2～圖4 分別為試驗(yàn)前犬的牙齒拋光效果， 以及試驗(yàn)第14 天和第29 天各組犬牙菌斑染色效果。

圖1 益生菌牙膏減輕比格犬牙菌斑形成功效對(duì)比

圖2 試驗(yàn)前對(duì)犬牙齒進(jìn)行潔牙拋光效果

圖3 試驗(yàn)第14 天犬的牙菌斑染色情況

圖4 試驗(yàn)第29 天犬牙菌斑染色情況

表1 試驗(yàn)第14 天和第29 天比格犬牙菌斑評(píng)分結(jié)果

表2 試驗(yàn)第14 天和第29 天益生菌牙膏減輕比格犬牙菌斑形成功效結(jié)果

2.2 益生菌牙膏對(duì)犬牙結(jié)石形成的影響

由表3 可知，試驗(yàn)第29 天，陰性對(duì)照組、益生菌牙膏組犬牙結(jié)石評(píng)分分別為1.09±0.40、1.02±0.44（見表3）；與陰性對(duì)照組相比，益生菌牙膏組口腔牙結(jié)石評(píng)分均值減少幅度6.54%（見表4），低于15%， 說明該公司生產(chǎn)的此款益生菌牙膏不具有減輕犬牙結(jié)石生成的功效。 圖5 為益生菌牙膏對(duì)減輕牙結(jié)石形成功效評(píng)分對(duì)比。

圖5 益生菌牙膏減少比格犬牙結(jié)石形成功效對(duì)比結(jié)果（第29 天）

表3 試驗(yàn)第29 天比格犬牙結(jié)石評(píng)分結(jié)果

表4 試驗(yàn)第29 天益生菌牙膏減輕比格犬牙結(jié)石功效結(jié)果

2.3 益生菌牙膏對(duì)犬口腔氣體揮發(fā)性化合物濃度的影響

由表5 可知，試驗(yàn)第29 天，陰性對(duì)照組、益生菌牙膏組犬口腔氣體揮發(fā)性化合物的濃度分別為（0.74±0.67）ng/10 mL、（1.07±0.44）ng/10 mL； 益生菌牙膏組犬口腔氣體揮發(fā)性化合物濃度均值減少幅度為-44.59%（見表6、圖6），低于15%，說明此款動(dòng)物益生菌牙膏不具有降低犬口腔氣體揮發(fā)性化合物濃度的功效。

圖6 益生菌牙膏減輕口腔氣體揮發(fā)性化合物濃度功效對(duì)比結(jié)果（第29 天）

表5 試驗(yàn)第29 天比格犬口腔氣體揮發(fā)性化合物濃度檢測結(jié)果

表6 試驗(yàn)第29 天益生菌牙膏減輕口腔氣體揮發(fā)性化合物濃度功效結(jié)果

3 討論

牙周病是犬貓最常見的疾病， 與牙周致病菌密切相關(guān)。 牙周病形成的主要病因是牙齒上的微生物菌斑積聚［1］。 隨著病情的發(fā)展，犬牙周病可能會(huì)引發(fā)菌血癥、脊椎炎及心臟內(nèi)膜炎等病癥，危及犬的生命［12-13］。 發(fā)現(xiàn)寵物犬出現(xiàn)進(jìn)食減少、流涎、口臭等現(xiàn)象時(shí)，應(yīng)考慮是否患上該病，及時(shí)就診。

該試驗(yàn)中， 餐后涂抹益生菌牙膏的犬牙菌斑沉積量明顯低于陰性對(duì)照組的犬。 而益生菌牙膏組犬在連續(xù)給予益生菌牙膏28 d 后， 第29 天檢測牙結(jié)石和口腔氣體揮發(fā)性化合物濃度的減少功效分別為6.54%、-44.59%，均低于15%，說明此款動(dòng)物益生菌牙膏不具有降低口腔氣體揮發(fā)性化合物濃度和牙結(jié)石的功效， 這可能與受試物的性狀或益生菌成分有關(guān)。 雖然試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)益生菌牙膏能夠降低牙菌斑的形成，但試驗(yàn)時(shí)間有限，不能證明此款益生菌牙膏能夠完全阻止牙結(jié)石的生成。由于牙結(jié)石的形成是牙齒在萌出之后會(huì)被一層薄膜覆蓋， 其主要是由于唾液蛋白選擇性地吸附在牙釉質(zhì)的表面而形成的。 犬長期攝食柔軟的食物或流質(zhì)食品， 食物殘?jiān)涂谇恢械募?xì)菌容易附著在該薄膜上，進(jìn)而形成牙菌斑和牙垢。 牙結(jié)石由牙菌斑或牙垢通過與犬唾液中某些成分相互作用從而引起鈣磷沉積形成［14-15］。 該研究結(jié)果表明，在犬的飼喂過程中， 補(bǔ)充益生菌牙膏可以有效減少牙菌斑在牙齒表面的堆積， 但不能降低犬口腔氣體揮發(fā)性化合物的濃度。

4 結(jié)論

連續(xù)給予該款益生菌牙膏28 d，在觀測期內(nèi)，能有效抑制比格犬牙菌斑的形成， 但不具有減少牙結(jié)石形成和降低口腔氣體揮發(fā)性化合物濃度的功效。