嗜熱芽孢桿菌SL-2產(chǎn)生物乳化劑的研究

王雅潔，梁綺雯，楊芳芳

（廣州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東廣州 510450）

生物乳化劑是指一種由細(xì)菌新陳代謝所產(chǎn)生的表面活性化合物，一般是蛋白質(zhì)、多糖、脂蛋白、脂多糖中的一種或是幾種的復(fù)合體所組成的生物表面活性劑[1]。生物乳化劑具有穩(wěn)定界面膜的作用，能與石油烴等物質(zhì)形成穩(wěn)定的油水乳化液，沒有毒害作用，可以進(jìn)行生物降解，是一種環(huán)境友好型材料，目前在石油開采、污染治理、農(nóng)藥開發(fā)、化妝品以及食品等領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景[2-3]。

嗜熱芽孢桿菌SL-2是從中國勝利油田油井中分離的一株細(xì)菌，這種菌株可以進(jìn)行原油乳化，是目前生物乳化劑研究實驗中的熱門菌株之一。其在高溫（60 ℃）條件下能正常生長代謝，且乳化烴類物質(zhì)的效果優(yōu)越。因此，開展該菌株生長及烴類乳化特性的研究，可以為該菌進(jìn)一步應(yīng)用于微生物驅(qū)油奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

1.1.1 菌株

SL-2菌株來自中國勝利油田油井。

1.1.2 實驗儀器

HPX-Ⅱ-200隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；FTIR-650S傅里葉變換紅外光譜儀，天津港東科技發(fā)展股份有限公司；EM-30AX掃描電子顯微鏡，韓國COXEM公司；3K15低溫高速離心機(jī)，德國Sigma公司；IMARK酶標(biāo)儀，美國BIORAD公司；UV-1800紫外可見分光光度計，上海美譜達(dá)儀器有限公司；X50梯度PCR儀，德國Master cycler；L-8800氨基酸自動分析儀，日本日立公司；電泳儀，Sub-Cell GT水平電泳槽，美國Bio-Rad公司；Tanon 3500膠成像儀，上海天能科技有限公司；VM100漩渦振蕩儀，北京托摩根生物科技有限公司；FD-1A-50冷凍干燥儀，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.1.3 實驗試劑

蔗糖，10021418，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖，10010518，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂糖，CAS 9012-36-6，阿拉丁試劑（上海）有限公司；酵母粉，LP0021，英國OXOID公司；蛋白胨，LP0042，英國OXOID公司；甲苯，C0430110209，南京化學(xué)試劑有限公司；二甲苯，C0430530209，南京化學(xué)試劑有限公司；Na2HPO4，10020318，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；KH2PO4，10017618，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；NH4NO3，A117717-1 g，阿拉丁試劑（上海）有限公司；MgSO4·7H2O，M200，美國phytotech公司；柴油，南京德茗化工科技有限公司；煤油，南京德茗化工科技有限公司；液體石蠟，南京德茗化工科技有限公司；SDS，南京圣比澳生物科技公司。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.2.1 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：酵母粉3.00 g/L，蛋白胨3.00 g/L，K2HPO4·4H2O 2.70 g/L，NaCl 5.00 g/L。

MSS培養(yǎng)基：NaCl 10.00 g/L，蔗糖10.00 g/L，Na2HPO45.00 g/L，KH2PO42.00 g/L，NH4NO33.00 g/L，MgSO4·7H2O 0.20 g/L。

1.2.2 培養(yǎng)條件

在固體培養(yǎng)基MSS中選出一株單菌落，然后接種到培養(yǎng)基里，在250 mL的三角杯中加入約50 mL的菌液，在60 ℃、130 r/min條件下培養(yǎng)12 h。以5%（v∶v）轉(zhuǎn)接量將種子孵化液轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)基里，在250 mL三角杯中添加約50 mL的細(xì)菌水，以60 ℃、130 r/min的條件振蕩培養(yǎng)。

1.3 目的菌株的鑒別

（1）通過肉眼觀察目的菌株的生長形態(tài)、顏色、外觀的粗細(xì)程度等，并用電子顯微鏡觀察目的菌株的外觀和構(gòu)造。（2）通過16S rDNA測序解析鑒定目的菌株的種類以及屬性。

1.4 乳化劑的分離提取與純化

（1）將培養(yǎng)液在4 ℃、8 000 r/min的條件下離心20 min，倒出上清液；

（2）抽濾（上清液），濾膜孔徑標(biāo)準(zhǔn)尺寸為0.22 μm；

（3）將濾液與事先在4 ℃冰箱中預(yù)冷的冰乙醇以1∶3（v∶v）的比例混合，置于4 ℃冰箱中過夜；

（4）經(jīng)沉淀后的濾液于4 ℃、8 000 r/min的條件下離心20 min，在分離出的沉淀物中加入去離子水使其充分溶解，并將其放于透析袋于4 ℃冰箱透析48 h后，隨后進(jìn)行冷凍干燥操作，得到白色絮狀物質(zhì)，儲存于-20 ℃的環(huán)境中。

1.5 乳化活性的測定

將生物柴油與發(fā)酵液及萃取物按1∶1（v∶v）混合，渦旋振蕩60 s，靜置48 h以乳化指數(shù)（EI）表征乳化劑的乳化活性。乳化指數(shù)的計算公式：乳化指數(shù)=乳化層高/油相總高。

1.6 生物乳化劑定性實驗

（1）糖類定性實驗：在硅膠板上輕輕點樣，晾干后，將硫酸-蒽酮溶液均勻噴灑在硅膠板上，然后放入120 ℃烘箱加熱2～5 min，使其顯示出顏色，若在硅膠板上出現(xiàn)藍(lán)綠色即可證明樣品中存在糖類。

（2）蛋白質(zhì)定性實驗：在硅膠板點樣品后，晾干，用0.1%茚三酮溶液快速潤濕后放入110 ℃烘箱中加熱15 min顯色。用茚三酮顯色后都呈現(xiàn)出和陽性對照相似的黃色，說明該乳化劑中含有蛋白質(zhì)組分。

（3）脂類定性實驗：在硅膠板上點樣，吹干，將其放入展層缸中，待展開劑前部距離硅膠板頂端大約1 cm時，取出硅膠板，在通風(fēng)櫥內(nèi)晾干，均勻展鋪顯色劑后將其置于110 ℃烘箱中加熱5～10 min，觀察顏色是否發(fā)生改變，如果出現(xiàn)紫紅色即可證明樣品中存在脂肽類物質(zhì)。展開劑：氯仿/甲醇/水（65/15/2，v/v/v）；將0.2 g的茚三酮溶放入100 mL乙醇溶液中，脂肽顯紫紅色。

1.7 乳化劑組分分析

1.7.1 乳化劑的紅外光譜分析

將樣品與溴化鉀混合置于在研缽中磨碎，制作壓片，上機(jī)掃描。

1.7.2 乳化劑的氨基酸分析

乳化劑樣品經(jīng)過6 mol/L HCl水解12 h后進(jìn)行氨基酸組成分析。使用HITACHI L-8800型氨基酸自動分析儀進(jìn)行氨基酸組成分析，操作過程參照儀器使用說明。

1.7.3 蛋白質(zhì)電泳

蛋白質(zhì)定量方法：通過SDS-PAGE電泳檢測，使蛋白分離原理是憑借其蛋白分子量亞基不同，在樣品介質(zhì)和Acrylamide gel中加入離子去污劑和強(qiáng)還原劑后，亞基分子量大小決定蛋白質(zhì)亞基電泳遷移速率。使用考馬斯亮藍(lán)染色。

1.8 乳化劑的性質(zhì)研究

1.8.1 乳化劑對不同底物的乳化作用

以甲苯、二甲苯、煤油、生物柴油和液蠟等為主要乳化對象，測試計算發(fā)酵液和離心去菌體的上清液的EI值。

1.8.2 乳化劑的稀釋性能

將乳化劑樣品溶解在重蒸水中，并逐級稀釋到原液濃度的1/1、1/2、1/4、1/6和1/10，以柴油為有機(jī)相，靜置72 h后測定其乳化活性，EI-72。

1.8.3 乳化劑酸敏性

取乳化的試樣混合為乳狀液，并分別測其在pH值為3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的環(huán)境下乳化活性，EI-24。

1.8.4 溫度對乳化劑的影響

將與乳化劑和柴油充分接觸形成的乳狀液分別置于 60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和 95 ℃下，放置 24 h后再測定其EI-24。

1.9 數(shù)據(jù)分析

將篩選得到的高溫菌株進(jìn)行DNA的提取后，利用細(xì)菌16SrDNA基因通用引物來擴(kuò)增16SrDNA基因序列，序列在GenBank中用BLAST比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的菌株的鑒別

由圖1可知，菌株SL-2呈棒桿狀形態(tài)，且其外層有一層透明物質(zhì)，該物質(zhì)可能是由多糖莢膜組成的。根據(jù)16SrDNA的測序結(jié)果，登陸https://www.ncbi.nlm.nih.gov/，將其結(jié)果在GenBank中用BLAST比對，得出菌株SL-2與Geobacillus pallidus.的同源性為100%。

圖1 菌株SL-2的掃描電鏡圖

2.2 生物乳化劑定性實驗

2.2.1 菌株SL-2發(fā)酵液的乳化活性

菌株SL-2在以葡萄糖為碳源時可以產(chǎn)生一種生物乳化劑，該乳化劑的乳化活性隨著菌株的生長有所變化。在生產(chǎn)乳化劑培養(yǎng)基發(fā)酵過程中，發(fā)現(xiàn)表面張力略有下降，發(fā)酵5 h乳化活性達(dá)到100%；72 h后，乳化液可以穩(wěn)定在2個月以上。發(fā)酵液對0#柴油的EI-24為100%。菌株SL-2在培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，經(jīng)離心、抽濾、沉淀、凍干的步驟，可獲得乳化劑的產(chǎn)量為0.362 g/L。

2.2.2 乳化劑樣品的薄層分析

采用薄層定性分析法可以對試樣中的化學(xué)組成進(jìn)行研究，該試驗的基本原理是采用具有差異的特異性顯色劑方法。將酸水解后所得的試樣用毛細(xì)管在點樣或有機(jī)硅板上點樣，噴灑硫酸-蒽酮溶液后呈出現(xiàn)藍(lán)綠色，這一顯色顏色反應(yīng)現(xiàn)象可以證實乳化劑試樣中含有葡萄糖類成分；用茚三酮顯色的水解物試樣呈現(xiàn)淡淡橙色，而水解后的乳化物試樣呈現(xiàn)紫黃色，這一顏色變化現(xiàn)象表明乳化試樣中存在含有蛋白質(zhì)。乳化劑樣品經(jīng)過薄層色譜法茚三酮顯色后呈出現(xiàn)紫紅色，說明乳化劑樣品中含有脂類物質(zhì)。通過對特異性顯色法顏色反應(yīng)的薄層定性分析可以證明，菌株SL-2所產(chǎn)生的乳化劑化學(xué)組成主要包括糖、脂類和蛋白質(zhì)（肽）[4]。

2.2.3 乳化劑的紅外光譜分析

將菌株SL-2所產(chǎn)的乳化劑試樣用溴化鉀壓片后在400～4 000 cm-1波數(shù)下掃描[5]，結(jié)果如圖2所示。該乳化物于1 065 cm-1、1 548 cm-1、1 651 cm-1、2 935 cm-1和3 314 cm-1處存在特征性吸收峰。其中，吸收峰（1 065 cm-1）是由C—O伸縮振動產(chǎn)生，吸收峰（1 548 cm-1）是由糖環(huán)上的C—O—C伸縮振動產(chǎn)生，吸收峰（1 651 cm-1）是酰胺鍵上羰基的特征吸收峰，（1 651 cm-1）是糖類C—H伸縮振動的特性吸收峰，而吸收寬峰（3314 cm-1）是由O—H的伸縮振動而形成。從菌株SL-2所產(chǎn)乳化劑的紅外光譜可發(fā)現(xiàn)，該物質(zhì)中存在較多-OH和RCO-NHR基團(tuán)，且上述基團(tuán)都是糖蛋白的特征官能團(tuán)，因此能夠最終判斷糖類和蛋白質(zhì)都是該乳化劑的主要化學(xué)組成。

圖2 菌株SL-2產(chǎn)生的生物乳化劑的紅外光譜分析

2.2.4 乳化劑的氨基酸分析

乳化劑樣品經(jīng)酸水解12 h后進(jìn)行氨基酸組成分析。其中，極性氨基酸有7種，分別是Thr、Asp、Glu、His、Ser、Arg和 Lys，約為乳化劑總量的13.74%；非極性氨基酸有10種，分別為Ile、Val、Cys、Met、Ala、Tyr、Leu、Gly、Pro 和 Phe，約為乳化劑總質(zhì)量的14.01%。

2.2.5 乳化劑的蛋白質(zhì)分析

由圖3可知，條帶顏色較亮的是26.0 kDa和 66.4 kDa大小蛋白質(zhì)，證明乳化劑中含上述兩種大小的蛋白質(zhì)比較多，其余蛋白質(zhì)條帶顏色很淺證明含量少甚至沒有，實驗證明生物乳化劑含有的蛋白質(zhì)種類較單一，因此還需要進(jìn)一步驗證才能確定生物乳化劑中活性蛋白的成分。

圖3 蛋白質(zhì)電泳圖

2.3 乳化劑理化性質(zhì)分析

2.3.1 乳化劑對不同底物的乳化作用

本實驗選取的乳化對象分別為甲苯、二甲苯、煤油、柴油和液蠟，分別測試發(fā)酵液和上清液的乳化能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液對甲苯、二甲苯、柴油和煤油的EI-24均為100%，對液蠟的乳化效果僅為76%；上清液對二甲苯和柴油的EI-24為 100%，但對甲苯、煤油和液蠟的乳化能力有所降低，其中對液蠟的EI-24只有25%。證明菌株SL-2產(chǎn)生的乳化劑對不同的石油烴具有不同的乳化效果，同時也說明菌株本身對石油烴也有一定的乳化效果。

2.3.2 乳化劑的稀釋特性

與原液濃度一致時，其EI-72為100%；當(dāng)乳化劑濃度為原液濃度的1/2時，其EI-72仍大于90%；當(dāng)溶液中乳化劑的濃度為原液濃度的1/10時，其EI-72依然大于30%，優(yōu)于已報道的一些生物乳化劑的乳化效果[4-5]。說明菌株SL-2所產(chǎn)生乳化劑在極微量條件下就可以乳化石油烴，是一種高效生物乳化劑。

2.3.3 乳化劑的酸敏性

當(dāng)乳化劑溶液的pH值為3～9時，其EI-24均為100%；當(dāng)pH值在10～12時，乳化活性略有下降。說明菌株SL-2產(chǎn)生的乳化劑具有較好的耐酸能力。

2.3.4 溫度對乳化劑活性的影響

乳狀液的破乳程度隨著放置溫度的增加而增加，在60 ℃高溫生長環(huán)境下形成的生物乳化劑特性非常穩(wěn)定，溫度低于80 ℃時，EI-24仍為100%；當(dāng)放置溫度為 95 ℃時，其EI-24仍大于40%，說明菌株SL-2產(chǎn)生的乳化劑具有一定的耐高溫性質(zhì)。

圖4 溫度對菌株SL-2乳化活性的影響

3 結(jié)論

本實驗對蒼白地芽胞桿菌SL-2所產(chǎn)的生物乳化劑進(jìn)行了分離純化及化學(xué)組分分析，發(fā)現(xiàn)該生物乳化劑由糖類、脂類和蛋白質(zhì)組成；對其所產(chǎn)生物乳化劑的理化性能進(jìn)行分析，結(jié)果顯示菌株SL-2在60 ℃高溫生長環(huán)境下形成的生物乳化劑性質(zhì)穩(wěn)定，證實了菌株SL-2是一株能夠適用于中高溫油藏的原位生物驅(qū)油菌種，并有著很重要的科研價值。但目前對該菌株生產(chǎn)生物乳化劑的機(jī)制尚不清楚，因此研究該菌株合成乳化劑的代謝途徑和調(diào)控機(jī)制將是筆者未來的研究方向與重點。